2-Tiokyanátometyl-5-benzyloxy-4H-pyrán-4-ón a spôsob jeho prípravy

Vynález sa týka Z-tiokyanàtometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ónu a spôsobu jeho výroby.Z literatúry sú máme étery, estery kyseliny kójovej,kondenzačné deriváty kyseliny kójovej s amoniakom aj s primámymi amínmi (P. Bajpai, PK. Agmwal, L. Vishwanathan, J. Sci. lnd. Res., 4 l, 185-194, 1982), ale 2-tiokyanátometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ón nebol doteraz pripravený.Podstatou vynálezu je Z-tiokyanatometyl-S-berízyloxy-4 H-pyràn-4-ón vzorcaUvedenú zlúčeninu je moàié pripraviť postupom podľa vynálezu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa 5-benzyloxy-2-chlónnetyl-4 H-pyràn-4-ón necha reagovať s tiokyanátom sodným v acetóne za súčasného miešania pri teplote varu reakčnej zmesi. Po ukončení reakcie sa reakčná mes preñlmije, zahustj a kxyštalizuje z organických rozpúšťadiel, výhodne z octanu elylového.Podstatou vynalezu je ďalej prostriedok s antimikrobiálnym a cytostatickým účinkom, ktorý ako účinnú látku obsahuje 2-tiokyartàtometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ón. Umožňuje to skutočnosť, že uvedená zlúčenina sa vyznačuje antimikrobiálnym (ako napr. antibakteriálnym, antifungálnym účinkom), ako aj cytostatickým účinkom.Výhodou vynalezu je skutočnosť, že sa na prípravu účinnej látky používa kyselina kójová, ktorá samotná nemá výrazné biologické účinky, nie je toxícká, je dokonale biodegradabilná, bez nežiaducich účinkov na jednotlivé zložky biocenózy (Shibua a spol. The Joiunal of Toxicological Sciences, 7, 255-262, 1982). Zlůčeninu podľa vynálezu možno používat všade tam, kde je polrebná supresia mikrobiálnej tlóry ako napríklad v potravinarskom priemysle, v humánnej a veterinúmej mediclne alebo v poľnohospodárstve, ďalej ako účinný prípravok s cytostatickým účinkom napríklad v onkológií alebo reumatológii.Príklad I Príprava kyseliny kójovej ako východiskovej látky Na tekutej živnej pôde s obsahom asimilovateľnéhoLihlíka, dusíka a živných solí sa kultivuje kmeň Aspergillus tamari mutant VIII (CCM F 781), alebo Asperñllus tamarii mutant lll (CCM F 780) jednotlivo,alebo v zmesi a kyselina kójovà sa iznluje zahustenim ultraliltiuvaného média s následnou kryštalizaciou. Získa sa kyselina kójovà vo výťažku 35 g na 100 g.l,2 g (0,05 mol) sodíka sa rozpustí v 100 ml absolútneho metanolu, pridá sa 7,1 g (0,05 mol) kyseliny kójovej a 6,5 ml benzylchloridu. Reakční mes sa zahrieva pri teplote varu 3 hodiny. Po skončení reakcie sa reakčna zmes vyleje do 500 ml vody. Vzníknutá zrazenina sa odñltruje a produkt kryštalizuje z etanolu. Výťažok je 91 , teplota topenia látky je i 27 až 1292,32 g (0,0 l mol) S-benzyloxy-Z-hydroxymetyl-4 H-pyrán-4-ónu v l 5 ml bezvodeho chloroformu sa mieša s 2,4 g (0,02 mol) tionylchloridu. Reakčná mies sa zaluieva pri teplote varu l hodinu. Po ochladení sa vzniknutú zrazenina odñltruje a surový produkt sa kryštalizuje z etanolu. výťažok je 52 , teplota topenia látkyje ll 0 až ll 2 °C.6,25 g (0,025 mol) 5-benzyloxy-2-chlórmetyl-4 H-pyrán-4-ónu a 2,43 g (0,03 mol) tiokyanátu sodného sa v l 10 m acetónu miešajú pri teplote varu l hodinu. Po ochladenl sa reakčná mes preíilüuje a ñltrát sa zahustí. Vmiknutý reakčný produkt sa prekryštalizuje z octanu etylového. Výťažok je 40 , teplota topenia lálkyje l 27 až 130 °C.Príklad 5 Stanovenie cytostalickcj aktivity Z-tiokyanátometyl-S-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ónu na myšej leukemickej línii blmiek L 12 | 0Myšie leukemické bunky boli kultivovane v médiu RPM s prídavkom 10 FCS pri teplote 37 °C vo vlhkostnom inkubátore, v prítomnosti 5 koncentrácie oxidu uhličitćho. Východisková denzita buniek bola v každom experiment 3000 buniek/ml a inkubačný čas96 hodin. Z-Tiokyanátometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ón bol rozpustený v zmesí etanol - voda a aplikovaný v pokuse tak, aby výsledná koncentrácia etanolu v bunkovej suspenzji neprekročila 0,0 l 37 . Kontrolná skupina bluikovej suspenzie obsahovala kyselinu kójovú a rovnake množstvo ctanolu. Dynamika rastu buniek bola vyhodnotení stanovením počtu buniek v Bllrkerovej komôrke.Knmentrácia testnvanej zlúčeniny ýumol/l)Príklad 6 Kvalitativne stanovenie antimikrobiàlnej aktivity 2-tiokyanátometyl-5-benzyloxy-4 H-pyràn-4-ónu diskovou difúmou metódouDo Petriho misky s priemerom i 50 mm sa pridala zhomogenizovaná suspenzia pozostávajúca z 13,5 ml živého média (baktérie - Mueller-Hintonov agar kvasinky a vlàknité huby - sladinový agar) a 1,5 ml vodnej suspenzie buniek, resp. spor príslušného testovncieho mikroorganizmu. V prípade baktérií a kvasiniek sa použila 18 hodinové vegetativne inokulum, získané subrnennou kultiváciou na reciprokej trepačke. V pripade vláknitých húb sa na inokuláciu ävného média použili 2 dňové vysporulované kultury vyrastené na šikmých agaroch.Spórová suspenzia sa pripravila pomocou 0,1 vodného roztoku Tweenu 80, pričom hustota spor bola 5 x 109 ml. Po stuhnutí živných médií sa na ich povrch umiestnili sterilnú papierové disky Whatrnan No 3 s priemerom l 0 mm, na ktorých bolo nanesených 10 l z roztoku obsaliujúceho Z-tiokyanátornetyl-S-benzyloxy-4 H-pyràn-4-ónu v dimetylsulfoxide (20 mg/ml). Kultúry mikroorganizmov sa kultivovali pri optimálnej teplote ich rastu, baktérie pri 37 °C, 24 hodin kvasinky pri teplote 25 °C, 48, resp. 72 hodín. Antimikróbna aktivita testovanej látky sa prejavila vznikom sterilnej inhibičnej zóny, ktorú vytvoril citlivý mikroorganizmus okolo centra difúzie účiruiej látky.kvalitatívne stanovenie antimikróbnej aktivityĺĺĺ aS Kunerčné štandardy ýug účJátky/disk) In Dithane Fundezol Euparentak, aby výsledná koncentrácia DMSO bola l a 7,5 ml suspenzie baktérií v MPB.Spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 650 mn bola stanovená počiatočná optická hustota v čase t 0. Kullúry baktérií boli kultivované pri 37 °C na recipro mwvuie ikrwrganízw Žšärůgu J ĺetťircišt( M-ąätzotnĺgmgg (200) l. Escherichia coli ł 2. Bacillus sublitls 0 t l. Candida ablicans b. Saocharotnyces CĚÍEVISIQE S. Snhízosaccharomyces poebe s. Rhiznpus nigricans o 7. Micur rouxianus t B. Alternaria alternata 9. Sotrytis cinerea 4 lUJrichnderma virlde í Lřenicellium yaneurn lžJtspergillus niger a) vtíokyanátuvetyl-S-benzyluxy-AH-nyrán-A-ćn vznik sterilrej inhiliícnej zony (látka účinná) Sterilná inhíbiüwá zona nevzniká -Uátka neúčinná) Príklad 7 IS Kvantitatívne stanovenie antibakteriálnej aktivity 2-tiokyanátometyl-S-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ónu Kultíuy Bacillus subtilis a Escherichia coli, ktoré sa použili ako inokulum, sa získali 18 hodinovou submerznou kultiváciou v 20 ml mäsopeptónového bujónu 20(MPB) pri teplote 30 °C, Do L-skúmaviek sa pridali rôzne koncentrácie 2-tiokyanátometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ónu rozpustenćho v dirnetylsulfoxide (DMSO)kej trepačke. Dynamika rastu baktérií bola stanovená spektrofotometricky, meraním optickej hustoty v rôznych časových intervaloch.Kvantitattvne stanovenie antibakteriálnej aktivityKvantitativne stanovenie antifungálnej aktivity 2-tiokyanàtometyl-5-benzyloxy-4 H-pyrán-4-ónul( IO ml sladinového živného agaru (50 °C) sme pridali 0,l ml Z-tiokyanátomelyl-S-benzyloxy-4 H-pyrán-4 ónu rozpustenćho v dimetylsulfoxide, po dokonalom premiešaní sme zmes vyliali do Petriho misiek s priemerom 100 mm. Po stuhnuti živného média sme jeho stred inokulovali 5 l spórovej suspenzie vláknitych húb (spórová suspenzia bola pripravená obdobným spôsobom ako je uvedená v príklade 6. Kultúry húb sme kultivovali pri 25 °C. Rast mycélia sme sledovali pri rôznych koncen 10Lráciách testovanej látky v kultivačnom médiu v závislosti od času. Antifungálna aktivita testovanej zlúčeniny sa prejavila inhibíciou radiálneho rastu kolónie húb v jej prítomnosti v živnom médiu. Na výpočet inhiblcie rastu sme použili vzťahl( Priemer kolónie vláknitej huby bez lestovanej látky v üvnom médiuP Priemer kolónie vláknitej huby v prítomnosti testovanej látky v živnom médiuTabuľka 4 Koncentráeia Inhlbicia rastu (t) Teatuvací mikronrganlzmus testnvaneg Ä 3 látky (mal/l) ~ 3 A - - 1 10 100 so Rhnopus mgneans s z má 56 SB l x 105 26 Ú 5 x lÚ 5 5 D l x 10 U Ú Alternaria alternata l x 1 U 18 54 5 x ro 73 3 l x 1 D 2 U Ú 5 x 10 g 20 0 l x 10 Ú 0 Borytia clnarea 1 x 103 Bü 66 5 x l 05 6 D 37 l x l 05 40 6 5 x 104 34 5 l x 1 U B 0 Aspergíllus niger l x m 10 27 5 x IU 4 0 20 l x 105 0 D 5 x má o o l x lU 0 O Penicilllum cyaneum .l x Lojž 51 35 s x 104 so 15 1 x 1 o 5 4 a 5 x 1 D 5 D U l x 10 D CI Trichuderma viride 1 x 103 85 A 5 x 104 as 21 1 x 1 o 5 37 13 s x má 12 1 D l x 10 0 l A ľ-tiokyanátnmetyl-S-Denzyloxy-ťaHqJyrán-ú-ónA e Ž-chlćrmetyl-S-hydroxy-âH-pyrárrô-őn Príklad 9 autolyzálu, 10 g glukózy v l litn destilovanej vody, pHStanovenie vplyvu 2-liokyanátometyl-5-benzy 1 oxy-4 H-pyrán-4-ónu na rast mutantu kvasiniek Sacharomyces cerevisiae v submermých podmienkach5,5 1 0,3. Rast kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sa inicioval pri koncentrácii a x 10 ° buniek/ml, pridaním čerstvých buniek (naraslených na tekutej pôde až do neskorej logaritmickej fázy rastu) do 20 ml tekutej živ