Způsob fermentační výroby fungicidinu

612 m( STANISLAV ing cEcHuER VÄCLAV ing., ROZTOKY u Prahy raocnâmą VLADIMÍR ingL, PRAHA(54) Způsob fermentační výroby łungiciüpuŘešení se týká z ůsobu fementační výroby fungicidinu ultivaci produkčniho kmene Str-e tomyces nourseí v tekuté živné půdě, obe x i 01 zdroje asimilovetelného uhlíku a uaíku a minerální živné soli,za aerobnich podmínek, ehož podstata spočívá v tom, že se ku tivace produkčniho kmene v inokulačním médiu provádí za přísady loučeniny obecného vzorcenebo soli aloučeniny uvedeného obecného. vzorce.Vynález se týká způsobu fermentačni výroby fungicidinu kultivací produkčního kmene Streotimyces noursei v tekuté živné pddě obsahující zdroje aaimilovetelného uhlíku a dusíka a minerální živné soli, za aerobních podmínek.Při doaevadní technologii se při přípravě kultur produkčního kmene Streptomyces nouraei používají v různých fázích stejné nebo různé složky či prísady. Tak např. k přípravě egerových kultur se používá kukuřičnáho extraktu, síranu amonnéha, chloridu aodného, uhličitanu vápenetého, ěkrobu, d-fruktozy a ageru. K přípravě spor pro očkování se používá proee, aminokyselín, např. tyrosinu, kyseliny nikotinové, kyseliny glutamavé, aspareginu a L-cysteinu. Složky tekuté inokulační půdy tvoří kukuřičný extrakt,sojová mouke, glukdža, dueičnen emonný, uhličitan vápenatý e chlorid aodný. Produkční půdy bez euapenzníoh složek obsahují kukuřičný extrakt, glukóžu, fruktőzový sirup nebo äkrob, mikromletý vápenec a dueičnan amonný. Suspenzní püdy obsahují sušené kvesnice a eojovou mouku nebo kukuřiöný šrot, masokostnílmoučku nebo eraäidavou mouku, glukóžu,fruktőzový sirup nebo äkrob, amonné soli, uhličitan vápenatý nebo mlkramletý vápenec a soli kyseliny fosforečné.Na živnýoh půdáoh a uvedenými aložkami se dosahuje určité výše produkce fungicidinu,která se za určitých podmínek pohybuje v rozmezí 25 000 až 40 000 mj/M fungicidinu.Bylo zjiätěno, že výtěžky fungicidinu při fermentaci na pddách obvyklóho složení lze zvýäit o 30 až 60 opatrením, ktoré je předmätem tohoto vynálezu a jehož podstate epočívá v tom, že ee kultivace produkčního kmene v inokulečním nebo fermentečním médiu provádí za prísady 0,001 až 0,5 aloučeniny obecného vzorceVe kterém X značí tom kyalíku nebo aíry nebo šminoskupin a substítuenty R, R, a R 2, ktoré jsou stejné nebo různé, značí atom vodíku, aminoekupinu, kyamekupinu, isonitroaoekupinu, alkyl nebo acyl, nebo eoli eloučeniny uvedeného obecného vzorce, a výhodou soli a alkaliokým kovem.Sloučeninu uvedeného obecného vzorce nebo její eůl lze přidávat do inokulačního neba fenmentečního média před eterilizaoí, popřípadě ji lze do předem aterilizovaného fermentačního média v jedné nebo více dávkáoh nebo kultinuálně ve aterilní formě.Jako eloučeniny uvedeného obecného vzorce přicházejí v úvahu předeväím kyselina barbiturová, kyselina thiobarbiturová a jejich alkylderiváty, barbituran draselný, kyselina violurová, kyselina dialurová, alloxan a další deriváty a soli. Tyto látky působí význačně atimulečně a současně mají 1 silný mutagenní efekt, nebo inokulum připravené na agarových půdách nebo na proeu s přísadou některé ze sloučenin uvedeného obecného vzorce si ponechévá vysokaprodukční vlastnosti 1 v následujících generacích.Způsob podle vynálezu má význam především ekonomický, neboí 5 minimálním množstvím běžně dostupných látek se dosáhne pozoruhodného zvýšení výtěžku. Další jeho přednoetí je to, že je velmi jednoduchý a že ke evé realizeci nevyžaduje žádnou změnu technologie nebo úpravu zařízení.P ř í k l a d 1 Použití stímulátoru při přípravě agarové kultury kmene Streptouwcee nourseiSpoluračni agarová půda obsahující 0,5 ó kukuřičného extraktu, 3,0 96 iz-mu emonného,0,3 56 chloridu sodného, 0,3 uhličitnnu vápenatáho, 1,0 SB škrobu, 0,5 fruktőzy,0,05 36 kyseliny borbitnrové n 2,5 agaru byla zaočkována sporovou susponzí streptomycea nouraei o ta kultivována při 28 °C. Po 5 dnoch byla touto kulturou zoočkováno inokuląční půda obsahující 0,25 5 kukuřičného extraktu, 1,0 5 aojová mouky, 4,4 31115. zy, 0,5 96 dusičnanu monného, 0,5 96 uhličitonu vápenotého a 0,2 5 chloridu aodného. Kultivováno 28 hodin na reciprokém třepacim stroji. získaním vegetntivním inolmlem v množství 3 ml bylo znočkováno 60 m 1 fermentočni půdy tohoto složení kukuřičný extrakt. 1,18 96, glukóza 2,0 03, fruktőzový sirup 8,0 76, mikromlotý vápence 1,0 5, dusičnm omonny 0,5 96. Fermenltováno ne reciprokém tŕepecím stroji 120 hodin při teplotě 28 °C. Po ukončení fermentace rabsahovalo půda 45 000 mj/ml fungicidinu. Kontrolní fermentnce provedená e inokulem pňiprovemłm na půdě bez kyseliny barbiturové poskytla výtěžek 27 000 mj/ml.P ř i k 1 a d 2 Použití ntimulátoru při přípravě presných konzerv Streptomyces noureei500 g propraného pre bylo spařeno 250 ml vařící vody obsahující 0,2 g kyseliny barbiturové a vařeno 5 až 10 minut. Vąřené proao bylo rozprostřeno na filtročním papíře a asi 20 minut sušono při teplotě místnoati. Potom bylo v dávkách po 15 g rozdäleno do 500 ml Erkenmoyerových buněk, zazátkováno buničitou vatou o eterilizováno 30 minut při 120 °C. Po 24 hodinách byla sterilizace opakována. Sterilizovaná proso bylo potom zaočkováno 3 m 1 28 hodin starého inokula Streptomyces noursei a kultivováno 4 dny při teploxě 28 °C. Po ukončení kultivace byla přüprnvoným inokulem znočkovéna inokulnční půda tohoto složení kukuřičrąý extrakt 0,25 59, sojová mouka 1,0 95, glukóza 4,4 96, dusičman amonný 0,51, mikromletý vápenec 0,5 96, chlorid sodný 0,2 . Kultivováno 28 hodin na reciprokém třepacim stroji. Tímto inokulem v množství 3 ml bylo zaočkováno 60 m 1 rermentačni půdy tohoto složení kukuřičný extrakt 1,18 76, glukóza 2,0 ň, fruktőzový sirup 8,0 , mikromletý vápenec 1,0 96, dusičnan emonný 0,5 96. Fermentováno na rociprokém třepacim stroji 120 hodin při teplotě 28 °C. Po ukončení fcrmentace obsahovat půda 48 000 mj/ml fungicidinu. Při kontrolní fermentaci, kdy bylo proané inokulum připraven bez kyseliny barbiturové, bylo dosnženo produkce 28 000 nj/ml fungicidinu.i Použití stimulátoru při přípravě vegetativniho inokula Streptomyces nouraeiInokulačni půda obsahuáľcí 1,0 51 sušených kvasnic, 0,5 96 sodové mouky, 4,4 96 glukózy, 0,5 95 mikromletého vápence, 0,5 55 dusičnanu amonného, 0,2 96 chloridu sodněho a 0,05 96 kyseliny barbitnrové byla znočkována sporovým inokulem Streptomyces noursei a kultivována při 28 °G na reciprokém třepacim stroji 28 hodin. Timto vegetotivnim inokulem bylo zaočkováno 60 ml produkčnz( půdy tohoto složení mlnuřičný extrakt 1,18 ,glukcíza 2,0 , fruktďzový sivup 8,0 3, dusičnan omonný 0,5 ř, mikronlotý vápence 1,0 55,fermentováno 120 hodin na reciprokém třepacím stroji. Po ukončení fermentum obuhovall půda 45 000 nj/ml fungicidinu, zatímco kontrolní fermentoce poskytlo výtěžek 28 000 mj/Inl60 m 1 fermentační půdy a obsahom 1,18 kukuřičného extraktu, 1,0 1- mikromletého vápence, 2,0 glukózy, 8,0 i fruktďzového sirupu, 0,5 i dusičnmu emonlého s 0,001 ř kyseliny barbiturové bylo zeočkováno 3 m 1 vegetntivního lnokuln Streptomycee nouraoi,starého 28 hodin e femantováno na reciprokém tŕepacim stroji 120 hodin při 28 °C. Po ukončení formmtnce obsahovú. půdn 42 000 nad/ml fungicídinu. Kontrolní fementnco na püdě stejného složení, 11 a bez kyseliny bnrbiturovê, poskytlo výtěłck 27 000 md/nl fungicidinu.60 m 1 fermentnčni púdy a obsahom 1,18 515 kukuřičného extraktu, 1,0 K mikromletého vápence, 2,0 96 glukózy, 8,0 96 fruktóznvého sirupu, 0,5 dusičnenu Inonného e 0,001 kyseliny thiopentebarbiturové bylo znočkováno 3 m 1 vogetativniho inokuln Streptowcca nouraei, starého 28 hodin n fementováno 120 hodin na reciprokám třcpnoim stroji při Leplotě 28 °C. Po ukončení fermentum na půdě stojného složení, nvhk bez kyuliny thiopentobnrbiturové, poskytla výtěžek 26 000 nj/ml fungicidinu.P ř i k 1 a d 6 Použití stimulátoz-u při fermantaci nn suspenzní púdě60 m 1 fermentnčni půdy s obsnhem 1,0 ž auäených kvnsnic, 0,5 39 aojové mouky,2,0 glukózy, 8,0 š fruktdzověho sirupu, 1,0 mikrouletého vápence, 0,5 5 dueičnlnu amonného a 0,01 kyseliny barbiturové bylo zaočkováno 3 m 1 vegetntivního inokuln Streptomyces noursei, starého 28 hodin. Fermentováno 120 hodin na reciprokém třepeeím stroji při teplotě 28 °C. Po ukončení fermantace obsahovala půda 60 000 und/ml fungioidinu. Kontrolní fermentace bez kyseliny bar-bíturové poskytla vytěžek 48 000 mj/ml fungicidinu.60 m 1 fermentační půdy obsahující 1,0 56 sušených kvasnic, 0,5 i sojové mouky, 2,0 i glukózy, 8,0 96 fruktózového sirupu, 1,0 96 mikroletého vápence u 0,5 dusičnnnu amonnéhovbylo zaočkováno 3 m 1 vegetativního inokula Streptowces noursoi, starého 28 hodin. Během fermontace byla ve třech dávkách přidáno kyselinu barbiturová v colkovém množství 0,1 i. Fermontováno 120 hodin ne reciprokém třepacím stroji při 28 °C. Po ukončení fer-mentace obsahoval půdn 60 000 mj/ml fungicidinu. Kontrolní fcrmentnce bez kyseliny bnrbiturové poskytla výtěžek 42 000 mJ/ml ñmgicidinu.1. Způsob fermentační výroby fungicídinu kultivncí produkčního kmene streptomyces nouraei v takuto živné púdě obsahující zdroja elimilovatełnáho uhlíka a duaíku n minerální živné soli, za aerobních podmínek, vyznnčující se tím, že n kultivąoe pr-odukčního kmene v inokulačním nebo formentnčním médiu provádí z prísady 0,001 už 0,5 sloučcniny obecného vzorce i