BAG3 protilátky na použitie na výskum, diagnostiku a liečenie ochorení, súvisiacich s bunkovou smrťou

0001 Predložený vynález poskytuje BAG 3 nukleotidové a proteínové sekvencie na použitie na výskum, diagnostiku a liečenie ochorení, ktoré súvisia s bunkovou smrťou, a na moduláciu preživania a/alebo smrti buniek.0002 Konkrétnejšie sa vynález týka použitia špecifických konštruktov na antisense báze a peptidovo špecifických polyklonálnych a monoklonálnych protilátok pri Ieukémii, dalších neopláziách alebo ochoreniach, súvisiacich s bunkovou smrťou.0003 Bunková smrt prostrednictvom apoptózy je do značnej miery zodpovedná za riadenie tkanivovej homeostázy, diferenciaćných a imunitných procesov. Zmeny v programe apoptózy pôsobia v prípade akútnych a chronických poškodení tkanív (srdca, obličiek mozgu a ischémiách iných tkanív, chronické degeneratívne poruchy, ako je napriklad Parkinsonova choroba,amyotrofnej Iaterálnej skleróze a iných, atď.), ktoré sa vyznačujú nadmernou apoptózou,a v pripade neoplastických, autoimúnnych a iných ochorení, súvisiacich s nedostatočnou apoptózou. Keďže antineoplastické zlúčeniny pôsobia zväčša indukovanlm apoptózy v rakovinových bunkách, molekuly súvisiace s apoptickou reakciou určujú citlivosť neoplastickej bunky alebo jej rezistenciu voči terapii. Biochemické komponenty a/alebo regulatory apoptických dráh môžu byt cieľmi modulačných terapií, z ktorých niektoré sa ukázali ako účinné na predklinických modeloch a teraz sú predmetom humánnych klinických testov. Okrem toho molekuly súvisiace s apoptózou môžu predstavovať diagnostické nástroje v množstve ochorení a reakčné činidlá na Iaboratórnu prácu (1).0004 BAG 3 je členom rodiny BAG proteínov, ktoré sú zapojené do košaperónovej aktivity pre vnútrobunkové Skladanie proteínov (2). Hoci BAG 3 vykazuje homológiu s ostatnými členmi BAG rodiny v niektorých častiach, ako napríklad v BAG doméne. zvyšné časti jeho nukleotidovej a proteinovej sekvencie sú ojedinele (2-4). Tieto BAG 3-špecifické ojedinele časti sa využili v tu opisanom vynáleze.0005 Nižšie je uvedená BAG 3 nukleotidová sekvencia a BAG 3 peptidová sekvencia podčiarknuté časti zodpovedajú častiam, ktoré sa považujú za obzvlášť významné pre predložený vynález.odkaz NCBI PubMed XM 055575 Homo sapiens BCL 2-asociovaný atanogén 3 (BAG 3), mRNA1 a tcc catccaacc cc ccaa tt act a ca61 c tt ct cc ccm ct ct ca a a121 a cc a ctt ct ct cc tc aa tcataaa181 cc ctt aca c c a cccac c ccc 241 c a cca ccc cacc c ca accccaa 301 ccca t a at at ca tcc caa ac361 ogcgaocctt tgcoccccgg atgggagatc aagatcgacc cgcagaccgg ctggoccttc 421 ttcgtggacc acaacagccg caccactacg tggaacgacc 09090 ctctgagggc 481 c a a a ccatoctct ocaa a ctcta ct541 cta a ccacoctt ta ctaca cc cattcc t 601 ggccatgaag gggctgagaa ggcaggm cagmg atgggggm ocagcctggg 661 a ca attcc aa a ca ca ca841 t catoctcctc cca cct ccttcctc ca a 901 ca catctccattc ataca a ca aa 961 ac accct ccaccaaoccaaaacctccca cca1021 t a cct aocac aa atoca at act1081 cc c c ttca tcat tcca tcat a 1141 ca a a c ctccactcccoct cccatcc tt caca1200 t aca cctca ca ccca a a aaact cacct cc cc a1261 gacaaaccag aaaggaagcc gggccgggtt ggaccagaag tgcctgg acacatocg1381 a a ta a t aaa ccc cctt ct tcc1441 cccttct ct cccctc ttccc a a t ca a a ca1501 a cact cct ca aa ctaca cca a a aa c a1561 gaiącąggag tgctgaaagt ggaagocatc ctggagaagg tgcaggggct ggagcaggct-3 1621 gtagacaact ttgaaggcaa gaagactgac aaaaagtacc tgatgatcga agagtatttg 1681 accaaagagc tgctggocct ggattcagtg gaccccgagg gacgagccga tgtgcgtcag 1741 gccaggagag acggtgtcag gaaggttcag accatcttgg aaaaacttga acagaaagcc 1801 att at tccca ca tcca tctat aact ccca caacctt aa ca1861 ca ccact ca caatcat a at t cct ca acaa ca a aa1921 gctggaaatg cagaagatcc ccacacagaa acccaggagc cagaaggcac agcagcaggg 1981 acttcaaacc ccagcagcat gacagacaoc cctggtaacg cagcagcacc ggagcctcgg2041 coct aa atca actc aacc at t t cttta aattttaa tt ca cat 21011 taactaacatttttttat ctctt atcata t 2161 a caaaa ctaataaaa ctaaaaa aaaat t cttrtcttct attc c 2221 tct tacaaa taaa aa tt ctt tt tttca aa aa ctt c2281 a coct tct actt cac ccccaocacct a ct t t cact tctttt 2341 a tct ct a ta at a tcaattaccca caca aaat at aaacatt2401 tatcągaaat gttgccattt taatgagatg attttcttca tctcataatt aaaaggcctg 2461 actttagaga gagtaaaatg tgccaggagc cataggaata tctgtatgtj ggatgacttt 2521 aatgctacat tttMSAATHSPMMQVASGNGDRQELPEGWHKIDPQTGWPFFVDHNSRTITWNDP RVPSEGPKETPSSANGPSREGSRLP ARE HP P P IPI VLHEG N7 QVHPFHVYPQEGMQRFRTEAAAAAPQRSQSPLRGMPETTQPDKQCGQVĺ AAQPPA§HGPERSQSPAA§DCSSSSS§ASLPSSGR§ SLGSHQLPRGYISIPVIHE QNVTB4 P PS H A HYPA QG Y THQPVYHKI GDDW P L S RSSV GAS R S ARSSTPL SPSPIRV DRP PMT RETAPVS EN PESKAVPSSPKSVATEE PS EATPPKPGEAEAPP H LKVEAILEKVQGLE0006 O BAG 3 proleíne je známe, že sa exprimuje v niektorých bunkových Iíniách, ako napríklad HeLa a A 2058, a čo sa týka normálnych primárnych humánnych buniek, exprimujú v kostrových svalových bunkách, v bunkách srdca, vaječníkov a v iných typoch normálnych buniek (2-5). Expresia BAG 3 sa zistila aj v humánnych pankreatických nádorových bunkách (6).0007 Predtým, ako sa tieto výsledky uviedli po prvýkrát v tomto dokumente, sa dovtedy BAG 3 expresia neuvádzala v iných typoch primárnych normálnych alebo neoplastických buniek.0008 Niektore zistenia uvádzajú, že transfekcia buniek humánnej bunkovej linie HeLa (5) alebo myšacej bunkovej linie 32 D (7) s BAG 3 hyperexprimujúcimi konštruktami môže mierne Zvýšit bunkovú apoptózu, indikovanú prostredníctvom Bax mikroinjekcie alebo prostredníctvom Fas (5),alebo lL-3 deprivàcie (7).0009 Generická protilátky pre BAG 3 boli oplsane vo WO 00/14108 a WO 95/25125, avšak sa necharakterizovalo žiadne pre nich špecifické imunogénne miesto. Citácie 4-6 opisujú polyklonálne protilátky špecifické pre karboxy-koncovú oblasť BAG 3 proteínu, začínajúcu špecificky od aminokyseliny 306. Liao opisuje králičiu polyklonálnu anti-BAG 3 protilátku proti 196 aminokyselinám C-koncovej časti BAG 3. Lee opisuje polyklonálnu protilátku proti aminokyselinovej oblasti,zahrnujúcej ćast 306-575. Dong opisuje polyklonálnu protilátku proti dvom aminokyselinovým oblastiam 2 a 8.0010 Patentová anotácia japonskej publikácie 10327872 opisuje použitie BAG 3 na diagnostiku,profylaxiu a terapiu patológil súvisiacich s apoptózou, avšak sa necharakterizovalo žiadne imunogénne miesto alebo špecifická protilátka, okrem toho chýbajú testy, najmä u ludí.0011 Pred tým, ako sa po prvýkrát uviedli takéto výsledky, nedokázalo sa, že BAG 3 expresia ovplyvňuje apoptózu v humánnych primárnych bunkách, v normálnych, v neoplastických bunkách,v bunkách postihnutých iným typom patológie. Okrem toho sa nikdy neuvádzala inhibujúca BAG 3 modulácia reakćnými činidlami, ako sú napríklad oligonukleotidy, ktorá sa môže použil v primárnych bunkách, a ani jeho vplyvy na apoptózu sa nikdy predtým nepublikovali.0012 Predložený vynález sa týka BAG 3 proteínu (SEQ ID NO 2) a zodpovedajúcej nukleotidovej sekvencie (SEQ lD N 0 1) a ich častí (označené podčiarknutím vo vnútri vyššie uvedených dlhých sekvencii).D 013 Prvé uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka protilátky AC-1 vylučovanej hybridómovým materským klonom č. PD 02009, ktorý bol uložený 17. decembra 2002 v Centro Biotecnologie Avanzate, v Ženeve, ktorý sa vyznačuje tým, že je to protilàtka špecifická pre aspoň jednu peptidovú sekvenciu humánneho BAG-3 proteínu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej SEO ID NO 15,16,17,18.0014 Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka hybridómového materského klonu č. PD 02009,uloženého 17. decembra 2002 v Centro Biotecnologie Avanzate di v Ženeve na produkciu protilátky