Farmaceutická kompozícia na liečenie neurodegeneratívnej choroby

Vynález sa týka farmaceutickej kompozicie na liečenie neurodegenerativnej choroby, Vrátanie Alzheimerovej choroby, epilepsie a amyotrofickej laterálnej sklerózy.Sporadická Alzheimerova choroba je závažné neurodegenerativne ochorenie spojené so stamutim. Riziko prepuknutia choroby sa zvyšuje exponencionálne vo veku 65 až 85 rokov s tým, že sa zdvojnásobuje každých päť rokov. Z histologickej stránky je charakteristickým znakom A 1 zheimerovej choroby ukladanie amyloidu V senilných plakoch a V stenách mozgových ciev, prítomnost neurotlbrilámych pletencov (tangles) a neurodegradácie. Etiológia Alzheimerovej choroby však nie je dobre preštudovaná. Predpokladá sa, že úlohu zohrávajú genetické faktory vrátane trizómie 21, mutáciou génu kódujúceho APP (amyloid B-protein precursor), génov presenilin-1 (PS 1) a presenilin-2 (PS 2) a prítomnosti apolipoproteinovej 4 alcly E typu(Younkin, 1995, Ann. Neurol. 37 287 - 88, Lendon et. al.,1997, JAM A 277 825). Niekoľko štúdii ukázalo, že B-amyloid indukuje apoptózu pri neurónových kultúrach(Loo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 7951 - 7955, Li et al., 1996, Brain Res. 738 196 - 204). Takáto indukcia môže zahŕňať priame rané génové proteiny (immediate early gene proteins) c-jun a fos (Anderson et al.,1995, J. Neurochemistry 64 1487 - 1489, Anderson et al.,1996, J. Neurosci. 16 1710- 1719).Bola prednesená teória, že apoptóza môže byť zahmutá V patogenéze Alzheimerovej choroby (Smale et al., 1995 Exp. Neurol. 133 225 - 230, Anderson et al, 1996, J. Neurosci, 16 1710 - 1719, Anderson et al., 1994, Experimental Neurology 125 286 - 295). Uvažuje sa taktiež nad zápalovým mechanizmom (Pasinetti, 1996, Neurobiol. Ageing. 17 707 - 716). Tento mechanizmus podporujú pozorovania, pri ktorých sa V sére pacientov trpiacich AlzheimeroVou chorobou nachádza zvýšená hladina proteínov akútnej fáze (acute phase proteins) a že sa ukladajú V amyloídných plakoch. Aktivované mikrogliové bunky majú tendenciu sa nachádzať V blizkosti senilných plakov a látky komplementu boli nájdené okolo dystroñckých neuritov a neurofobrilámych pletencov (Aisen and Davis, 1994, Am. J. Psychiatry 151 1105 - 1113). Protizápalové látky boli navrhnuté ako potenciálne terapeutické prostriedky (Aisen et al., 1996, Dementia 7 201 - 206, McGeer et al., 1996, Neurology 47 425 - 432). Ako látky na ošetrenie takýchto zápalov boli selektivne inhibitory enzýmu cykloxygenázy - 2,z dôvodov, vo väčšine prípadov menšieho množstva nepriaznivých vedľajších efektov, zlepšované (lntemtional Publication No. WP 94/ 13635, Merck Frosst Canada 1 nc.). Do predloženia tohto vynálezu sa však neverilo, že by sa tieto látky mohli použit na potlačenie nezápalových aspektov neurodegenerácie v súvislosti s Alzheimerovou chorobou a pod.Cyklooxygenázy (COXs) sú enzýmy, ktoré katalyzujú Vznik prostaglandinu (PG)-H 2 z arachidónovej kyseliny(AA). PG-H 2 je ďalej metabolizovaný na fyziologicky aktívne prostaglandiny (napr. PG-D 2, PG-E 2 a PG-F 2 a),prostacyklin (PG-12) a tromboxány. Špecifické prostaglandiny majú široké, často protichodnć vplyvy na rôzne tkanivá. Napr. PG-12 a PG-E 2 sú silne vazodilatátory, ktoré mô žu prispievať k zápalovej reakcii, aj ked PG-F 2 je Vazokonstriktor.Existujú dve izoformy COX, COX-l a COX-2, ktoré aj ked sa predpokladá ich fyziologícká rozdielnosť, majú podobnú aminokyselinovú sekvenciu i enzymatickú funkciu. COX-l je konštitutivne exprimovaná na rozdielnej úrovni V rôznych typoch buniek. COX-2 nie je konštitutivne exprimovaná a je všeobecne ncdetegovatcľná V normálnych perifémych tkanivách (Kujubu et al., 1991, J. Biol. Chem. 166 12866 - 12872 OBaníon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 4888 - 4892). Expresia COX-2 je indukovateľná(napr. mitogénmi) a bolo zistené, že hladina mRNA COX-2 rýchlo rastie pri reakcii na glukokortikoidy. Po aplikácii rovnakých faktorov zostáva hladina mRNA COX-l V podstate nezmenená, z čoho sa vyvodzuje, že COX-2 je izoforma, ktorá sprostredkováva zápal (Cao et al., 1995, Brain Res. 697 187 -l 96 O Banion et al., Proc. Natl. Acad. Sco. U.S.A. 89 4888 - 4892).Nedávne dôkazy naznačujú, že COX-2 môžu zohrávať úlohu V mechanizme prežitia buniek a bunkovej adhézii V perifémych bunkách (Lu et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sco U.S.A. 92 7961 - 7965 Tsujii et al., 1995, Cell 83 493 - 501). Tsujii a spolupracovnlcí ukázali, že epiteliálne bunky pozmenené tak, aby exprimovali zvýšenú hladinu COX-2 boli odolné proti apoptóze indukovanej butyrátom,mali zvýšenú expresiu proteínu BCL 2 a zníženú hladinu receptora transfonnačného rastového faktora B 2 (Tsuji et al.,1995, Cell 83 493 - 501). Lu a spolupracovníci objavili, že nesteroidné protizápalové látky môžu indukovať apoptický mechanizmus zahmujúci COX systém.Úloha COX-l, COX-2 a syntézy PG v nonnálom mozgu a V kontexte Alzheimerovej nebola dodnes úplne charakterizovaná. Dôležitost prostaglandinov Vo fyziológii mozgu môže byť nezávislá od zápalověho mechanizmu. V mozgu boli receptory prostaglandínov identitikované V hypothalame, thalamc a limbickom systéme (Watanabe et al.,1989, Brain Res. 478 143 - 148). Prostaglandíny zohrávajú úlohu V mechanizme sekrécic l 101 T 11 Óľ 10 V V hypothalame-hypofýze (Kinoshita et al., 1982, Endocrinol. 110 2207 - 2209), v regulácii teploty a spánkového cyklu (Hayaishi,1988, J. Biol. Chem. 163 14593 -14596). Nedávne práce dokazujú, že mRNA COX-Z je exprimovaná a regulovaná V mozgu potkanov synaptickou aktivitou aglukokortikoidov(Adams et al., 1996, J. Neurochem. 66 6 - 13 Kaufinann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 2317 - 2321 Yamagata et al., 1993, Neuron ll 371 - 386). Tieto štúdie naznačujú, že COX-2 je V mozgu regulovaná ako okamžitý skorý a gén a predpokladajú, že prostaglandíny môžu byt dôležité V transsynaptickej signalizácii a dlhodobej reakcii. Chang a spolupracovnlcí (1996, Neurobiol. of Aging 17 801 - 808) uvádzajú, že expresia mRNA COX-2 je pri Alzheimerovej chorobe znížená.Predkladaný vynález sa Vzťahuje na použitie nimesulidu a štruktúme podobných látok k prevencii a liečeniu neurodegenerativnych stavov. Je založený, aspoň sčasti, na objave, že 1. expresie COX-2 je pri neurodegenerativnych modeloch zvýšená V neurónoch a nie V gliových bunkách(čo je V súlade s nezápalovým mechanizmom) a 2. nimesulid má neuroprotektivne vlastnosti proti B-amyloidom indukovanej smrti neuronálnych buniek. Toto neskoršie zistenie je veľmi neočakávané v súvislosti so schopnosťou inhibitorov COX zvýšiť apoptózu iných než ncuronálnych buniek. Bez akéhokoľvek viazania sa na určitú teóriu jezjavné, že nimesulid inhibuje nezápalový mechanizmus neurodegenerácie.Predmetom vynálezu je použitie nimesulidu na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie neurodegeneratívnej choroby, vrátanie Alzheimerovej choroby, epilepsie a amyotrofickej laterálnej sklerózy.Predkladaný vynález sa teda vzťahuje na použitie selektívneho inhibítora cyklooxygenázy (COX-2) nimesulidu a štruktúme príbuzných látok k prevencii a (alebo) liečbe neurodegeneratívnych stavov. Vynález je založený, prinajmenšom sčasti, na objave, že sa spoločne s neuronálnymi léziami vyvolanými kyselinou kaínikovou (kainic acid) a s indukciou neuronálnej apoptózy (ako bolo zistené v in vitro systémoch, pozri príklady uskutočnenia vynálezu) zvyšuje expresia COX-2. Oproti predošlým pozorovaniam, že COX-2 má primámu úlohu pri zápaloch a môže mat úlohu v zápalovej zložke neurodegenerácie (napr. v súvislosti s Alzheimerovou chorobou), bolo ďalej objavené, že v ľudskom mozgu je zrejme expresia COX-2 obmedzená na neuróny a nie na gliové bunky (v pripade, že by platil zápalový mechanizmus, predpokladala by sa expresia práve v glíových bunkách - pozri príklady uskutočnenia vynálezu). Boli pozorované korelácie medzi expresiou COX-2 a charakteristickými patologickými zmenami (amyloidné plaky) spojenými s Alzheimerovou chorobou. Ďalej bolo ukázané, že nimesulid má neuroprotektivne účinky oproti 3-amyloidom indukovanej bunkovej smrti pri neuronálnych kultúrach. Vo svetle týchto objavov, podľa tohto vynálezu môže byť nimesulid a príbuzné látky použité k zásahom do procesu apoptíckej neuronálnej bunkovej smrti spojené s Alzheimerovou chorobou a ďalšími neurodegeneratívnymi stavmi. Bez väzby na akúkoľvek špeciálnu teóriu môže byť účinok nimesulidu a príbuzných látok sprostredkovaný znížením apoptických účinkov oxídatívneho stresu.Termín nimesulid, ako je tu použitý, sa vzťahuje na 4-nitro-Z-phenoxymetansulfonaninidu, ktorého štruktúra je zobrazená ďalej vo vzorci (1)No, Látky, ktoré sú považované za štruktúme príbuzné, sú látky majúce podobnú bicyklickú štruktúru a ktoré selektivne inhibujú COX-2. Napríklad substituenty, analógy a enantioméry nimesulidu sú považované za štruktúme pribuzné látlçy. Ďalším príkladom môže byt to, že štruktúme príbuzné látky môžu súťažiť s nimesulidom o väzbu na COX-Z alebo sa môžu viazat na rovnaké miesto COX-2 ako bolo stanovené kryštalograñcky. Okrem toho je nimesulid konjugovaný s inou látkou taktiež považovaný za štruktúme príbuznú látku, ako je tu definovaná.Nimesulid alebo štruktúr-ne príbuzná látka môže byť podávaná tak, aby bola zaistená účinná koncentrácia V nervovom systéme objektu, ktorý je ošetrovaný. Učinná koncentrácia je tu definovaná ako koncentrácia, ktorá inhibuje neuronálnu bunkovú smrť z minimálne 20 . V špecifických, nelimitujúcich uskutočneniach vynálezu je koncentrácia nimesulidu aspoň l nanomoláma a lepšie l mikromolárna v oblasti neuronálnych buniek, ktoré majú byť ošetrené. Vhodne je, aby koncentrácia nimesulidu bola niž šia než 103 moláma (s cieľom obmediť toxické účinky nimesulidu). V tak špecifických realizáciách vynálezu ako je ošetrenie neurodegeneratívnych stavov, ktorými je Alzheimerova choroba, koncentrácia nimesulidu v hippocampickej formácií postihnutého by mala byt aspoň l pikomolárna, vhodnejšie aspoň l nanomoláma a ešte lepšie l mikromoláma. Zodpovedajúca koncentrácia v sére musí byt najmenej l 0 pikomoláma, lepšie l 0 nanomoláma a ešte lepšie 10 mikromolárna. Ekvivalentné nmožstvo štruktúme príbuzných látok (prispôsobené na vyrovnanie rozdielov v účinnosti) môže byť taktiež použité.Nimesulid alebo štruktúme príbuzné látky môžu byť podávané akýmkoľvek spôsobom, ktorým bude dosiahnutá požadovaná účinná koncentrácie. Vhodné spôsoby podávania zahŕňajú napriklad orálne, intravenózne, subkutánne,íntramuskuláme, transderrnálne a intratekálne.Nimesulid alebo štruktúme príbuzné látky môžu byť obsiahnuté vo vhodnom farmaceutickom nosiči. Zloženie môže zaistiť predĺžené uvoľňovanie.Nimesulid môže byť podávaný napr. (nie však limitujúcim spôsobom) orálne v dávkach 2 - 800 mg/deň, vhodnejšie 50 - 400 mg/deň, najvhodnejšie 200 mg/deň.Neurodegeneratívne stavy, ktoré môžu byt liečené podľa vynálezu zahŕňajú (ale nie sú tým limitované) na A 1 zheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, neurodegeneráciu spojenú so záchvatom, amyotropickú laterálnu sklerózu, poranenie miechy a ďalšie choroby, kde stavy nie sú bežne považované za spôsobené zápalom alebo autoimúnnou chorobou.Prehľad obrázkov na výkresochObr. l Miestna expresia mRNA COX-2 V kontrolnom nepoškodenom mozgu samca potkana. Expresia mRNA COX-2 bola stanovená in sítu hybridizáciou a vizualizovaná X-ray autorádiografíou. Skratky SC, dentate gyrus - zúbkované brázdy CAl, CA 2 a CA 3 podoblasti neuronálnej pyramídovej vrstvy vznikajúceho hippocampu PAC,mozgová kôra PYC, pyrífommý kortex AC, amygdaloidný komplex THAL, ventroposterior thalamic nucleic. Upravené podľa ilustrácie 24, Paxinos and Watson, 1986(The Rat Brain in Steriotaxic Coordinates, Academic Press,NY).Obr. 2 Regulácia expresie mRNA COX-2 v mozgu potkana. Optické hustoty bolí kvantifikované z autorádiografických obrázkov. Skratky pozri skôr a nasledujúce PYC/AC, pyrimorfný a amygdaloidný komplex, v ktorom bola expresia mRNA COX-2 kvantífikovaná ako v jednej oblasti mozgu. N 5-8 na jeden časový bod.Obr. 3 Vplyv na expresiu mRNA COX-2 počas reakcie na záchvat índukovaný KA. Mikrografy boli vytvorené z autorádiografických obrázkov. Zmeny v anatomickej distribúcii pozri obr. 1. Control-kontrola, nepoškodené potkany (injektovaný nosič) KA 8 H, potkany ošetrené KA osem hodín pred usmrtením, postnatálne dni p-7, p-l 4 a p-2 l.Obr. 4 A-D Časová závislosť zmien mRNA COX-2 v mozgu potkana počas reakcie na aplikáciu KA vplyvy a lokálne zmeny v distribúcii. Optické hustoty boli kvantifikované z autorádiografických obrázkov. Dáta sú vyjadrené ako priemery plus-mínus smerodajná odchýlka, N 46 na skupinu. P 0,01 vs skupina OH (skupina ktorej bol injektovaný fyziologícký roztok) 4 h, 8 h, 16 h, 30 h, l 20 h, čas v hodinách po začiatku záchvatu indukovaného KA.Obr. 5 A-D Vplyv na distribúciu expresíe mRNA COX-2 a indukcíe v hippocampu potkana. mRNA COX-2v P 21 (A, B) a dospelom (C, D) hippocampe. Stanovené in situ hybridizáciou a vizualizáciou emulznou autoràdiogradfiou s použitím darf-field osvetlenia. Na A a C, expresia mRNA COX-Z pri kontrolných potkanoch (injektovaný nosič) na B a D, mRNA COX-2 osem hodín po začiatku záchvatu indukovaného KA. Šípky ukazujú na povrchovú vrstvu DG (stratum granulosum). Meradlo 200 m.Obr. 6 Selektívna indukcia hippocampickej mRNA COX-2 (mRNA COX-l nebola indukovaná) počas reakcie na záchvat indukovaný KA. Stanovené pomocou hybridizácie na blote. CTL, kontrolné potkany injektované fyziologickým roztokom KA, potkany ošetrené KA 12 hodín po poškodení.Obr. 7 A-l COX-2 a apoptóza índukovaná KA V dospelom mozgu potkanov. Na (A, B), expresia mRNA COX-2 v hippocampických pyramidálnych neurónoch CA 3 kontrolných potkanov a potkanov ošetrených KA na (C) subregión CA 3 hippocampického útvaru pri potkanoch poškodených KA zobrazujúca neuróny s apoptickými vlastnosťami (šípky). Na (D,E), expresia mRNA COX-2 v prípade pyriforrn cortexu kontrolných potkanov a potkanov ošetrených KA. Na (F), šípky smerujú k apoptickým bunkám pyriformného kortexu potkanov ošetrených KA. Na (G, H),expresia mRNA COX-2 v bunkách amygdaloidného komplexu kontrolných potkanov a potkanov ošetrených KA. Na(I), šípky smerujú k apoptickým bunkám amygdaloidného komplexu potkanov ošetrených KA. mRNA COX-2 bola stanovená in situ hybridizáciou a vizualizovaná emulznou autorádiografiou s použitím temného osvetlenia. In sítu značenie 3 konca bolo použité na stanovenie apoptických vlastností nasledujúceho ošetrenia KA. Meradlo na A, B,D, E,GaH 200 m naC,FaI 40 m.Obr. 8 A-D Imunocytochemické dôkazy expresie a regulácie neuronálnej COX-2 v reakcii na glutamát in vitro. COX-2 like imunoreaktivita monotypických kultúr potkaních primárnych hippocampických neurónov. Na (A) kontrola, na (B) po 12 hodinách expozície glutamátu. Na(C,D) kontrolné bunky a bunky ošetrené glutamátom po imunoreakcíi s imunoadsrobovanými COX-2 protilátkami. Meradlo 50 m.Obr. 9 A-C Vplyv nimesulidu na endotoxinom sprostredkovanú sekréciu cytokínov a nitritov v gliách. Vplyv nimesulidu (10-9) na syntézu a sekréciu TNF (A), NO intennediátov (Gríessova reakcia) (B) a PGEZ (C) ako bolo stanovené v nesmrteľných BVZ mikrogliových bunkách. Priemer plus-mínus štandardná odchýlka, n 8-l 0 na skupinu. Lipopolysacharidy (LPS) 5 m/ml. LPS a nimesulid boli pridané spolu ku kultúram. Čas inkubácie 24 hodín. Na štatistické spracovanie použitá ANOVA, p 0,05.Obr. 10 A-E Časové zmeny proteínu COX-2 V bunkách P 19 počas reakcie na podmienky vedúce k apoptickej smrti. Na (A), kvantitatívna analýza índukcie COX-2 v bunkách P 19, n 4-6 na skupinu, p 0,05 versus t 0. Na (B),zmeny boli stanovené western analýzou s použitím chemiluminiscenčnej detekcie. Na (C,D), morfologícké sledovanie apoptických jadier buniek P 19 bolo uskutočnené pomocou Hoechst H 33258 24 hodín po odobratí séra (a nahradení médiom N 2). Na (E), elektroforetický profil DNA ukazujúci DNA rebričkovitú (laddering) degradáciu bol stanovený 14 hodín po odňati séra (prúžok 1 - kontrolné bunky v t 0 prúžok 2, DNA laddering 14 hodín po vybratí séra prúžok 3, markery DNA). Polyklonálne protilátky proti COX-2 použité v týchto štúdiách sú opísané v príkladoch uskutočnenia vynálezu. Špecifické protilátky proti COX-2 rozpoznali v celkových homogenátoch V ľudskom mozgu a mozgu potkanov a myši dva hlavné prúžky maj úce odhadnutú molekulovú váhu 70 a 65 kDa.Obr. 11 A-E Regulácia COX-2 počas reakcie na oxidatívny stres neuronálnych buniek SH-SYSY spôsobený AB 1-40. (A) Stĺpik grafov zobrazuje relatívne množstvo prítomnej imunoreaktivíty COX-2 vzhľadom na kontrolu(CTL). Meranie imunoreaktivíty bolo odvodené z dát zobrazených na obr. (B). (B) Western blot proteínov pripravených z kontrolných buniek SH-SY 5 Y a buniek vystavených pôsobeniu AB peptidov. (D) Imunoblot zobrazený na obr. (B) rozdelený na prúžky s následným použitím protilátok proti aktinu. (E) Kultúry SH-SYSY bolí sledované z hľadiska apoptických mechanizmov.Obr. 12 Ochranný vplyv nimesulidu proti neurotoxicite vyvolanej AB 1-40. Stanovené meraním MTl s použitím neuronálnych buniek SH-SYSY.Obr. 13 Míkrofotograñe zobrazujúce selektívnu indukciu imunoreaktivíty COX-2 v temporálnom kortexe AD a k tomu vhodne starej neurologickej kontrole. Mikrofotograñe zobrazujúce selektívnu indukciu imunoznačenia COX-2 v oblastiach šedej hmoty bohatej na neuróny (gm), ale nie v oblasti bielej hmoty bohatej na gliá (wm).Obr. 14 A-D imunoznačeníe COX-2 neurónov v prednej kôre AD mozgu a kolokalizácia imunoznačenia COX-2 s AD plakmi v prednej kôre AD mozgu. Na (A, B) je zobrazené imunoznačeníe COX-2 neurónov AD (A, nízka energia B, vysokoenergetické zväčšenie). Na C je zobrazené imunoznačeníe difúznych plakov. Na (D) je zobrazená COX-2 V neuritických plakoch ako bolo stanovené ímunoznačením AB v susediacích vrstvách tkaniva.Obr. 15 Expresia COX-2 v prednej kôre mozgovej. (A) Nothern bloty mRN A COX-2 a COX-l v AD prednej kôre vztiahnutej ku kontrolám kvantitatívna analýza dát je na obr. (B). (C) Westem bloty proteínu COX-Z v AD prednej kôre a kontrole kvantitatívna analýza dát je na obr. (D).Obr. 16 Regulácia mRNA COX-2 v neurónoch predného a zadného miechového rohu miechy of ALS a neurologíckých kontrol. Autorádiograñcké obrázky boli vizualizované röntgenovým ñlmom. Šípka smerujúca na ventrálny roh ukazuje intenzívnu indukciu signálu mRNA COX-2 v pripade ALS, Obr. 17 A-D Zvýšenie mRNA COX-2 v biopsii ľudskej kortikálnej epileptíckej ako bolo stanovené pomocou in situ hybridizácie. Autorádiografické obrázky boli vizualizované pomocou röntgenového filmu. Šípky smerujúce smerom ku kortikálnym vrstvám ukazujú intenzívny signál mRNA COX-2 V epileptickom mozgu (A) a v kontrole (B). Čast (C) a (D) ukazuje analýzy zobratých dát vzťahujúcich sa k hladinám mRNA COX-2 a COX-l.Obr. 18 Zosilnenie aktivít cyklooxygenázy a peroxidázy nahromadenýmí AB peptidmi.Obr. 19 A-B Prechodná expresia COX-2 v neuronálnych bunkách zosiluje zhoršenie redox aktivity vyvolanej A 13. Neuronálne bunky SH-SYSY boli transfekované bud ľudským génom COX-2 (A), alebo COX-l (B) a ošetrené AB 25-35. Následne bola stanovená metódou MTT redox aktivita.Obr. 20 A-B Vytvorenie transgénnych myší exprimujúce COX-2. (A) In situ hybridizácia demonštrujúca expresíu mRNA COX-2 v myši TgNHCSZ, ale nie v kontrole(wikld type) (myši sú len jeden mesiac staré). (B) Miestna expresia mRNA hCOX-2 v NHC 32 a NHCS vzhľadom na kontrolu, ako bolo stanovené s použitím analýzy obrazu Bíoquant.Obr. 21 Overexpresia hCOX-2 zosiluje oxidatívne poškodenie spôsobené A 13 pri primámych myšacich neuronálnych kultúrach.Obr. 22 Nimesulid chráni neuronálne bunky B 12 proti oxidatívnemu stresu spôsobenému glutatnátom.Obr. 23 Kontrolné štúdie k obr. 22. Oxidatívne poškodenie spôsobené glutamátom (merané LDH stanovením) V závislosti od veľkosti dávky (A) a od času (B). (C) ukazuje netoxicitu nimesulidových kultúr B 12.Dospelé samce Sprague-Dawleyoho potkanov rôzneho veku boli chované V prostredi s kontrolovaným svetlom,teplotou, jedlom a pitím ad libídum. Pri dospelých samcoch(250 - 300 g) boli indukované hippocampálne excitologické lézie podkožnou injekciou kyseliny kainikovej (KA 10 mg/kg, Sigma). Pretože príjem KA je relatívne vyšší pri mladých potkanoch vzhľadom na dospelé potkany (Berger et al., 1986, in Schwartz and Ben-Ari, Advances in Experimental Medicine a Biology, Plenum, N Y, pp. 129 - 209), boli dávky prispôsobené tak, aby bola dosiahnutá maximálna excitotoxicita bez toho, aby boli dosiahnuté letálne dávky (od 2 mg/kg V postnatálnom dni P-7 do 6 mg/kg V postnatálnom dni PZS). Na kontrolu boli použité injekcie fyziologického roztoku (V časovom bode 0 hodín).(Stratagene) obsahujúci cDNA COX-l plnej dĺžky (2,7 kb) bol linearizovaný štiepením ClaI. Plazmid PCRII (1 nvitrogen) obsahujúci kódujúcu sekvenciu potkanej COX-2(1,8 kb) bol linearizovaný štiepením pomocou PfIMl (Feng et al., 1993, Arch. Biochem. Biophys. 307 361 - 368). Línearizované plazmidy boli purifikovane pri použití Elu-Quick (Schleider Schuell) po gélovej agarózovej elektroforéze.In situ hybridization. V rôznych intervaloch po začiatku poškodenia índukovaných KA boli potkany usmrtené a ich mozgy im boli rýchlo vybrané, opláchnutě V studenom fosfátovom pufri (PBS, 10 mM, pH 7,4) a ponorené do metylbutánu pri -25 °C na tri minúty. Mozgy bolí narezane na 10 m preparáty. Tieto bolí potom zmrazené a výsledné zmrazené preparáty boli pripevnené na sklíčka potiahnuté polylyzínom. Takéto preparáty boli potom skladované pri-70 °C. Pre imunocytochémiu (ICC) alebo in sítu hybridizáciu (ISH) boli zmrazené preparáty ďalej fixované V PBS obsahujúcej 4 percentný paraformaldehyd (30 minút pri laboratómej teplote) a potom opláchnuté V 0,1 M trietanolaminu (TEA), pH 8,0, inkubované V anhydríde kyseliny octovej (AAH 0,25 V/v V TEA, 10 minút) a opláchnuté V TEA a PBS. Po tomto kroku s AAH boli tkanivové preparáty hybridizované s s-cRNA próbami (0,3 g/ml, 2 x x 109 dpm ugl) pripravenými z linearizovaných cDNA COX-2 transkripčných Vektorov (Feng et al., 1993, Arch. Biochem. Biophys. 307 361 - 368). Hybridizácie so sense vláknom boli použité ako kontroly, ktorých Výsledkom boli negatívne Výsledky. Nasledovala hybridizácia po 3 hodiny pri 50 °C, stringentné premytie (0,1 x SSC pri 60 °C) a vysušenie. Na kvantifikáciu boli preparáty exponované na X-ray ñlm na sedem dní. Preparáty boli potom exponované na NTB-2 emulzii (Kodak, Rochester, NY) k mikroskopickej analýze distribúcie n 1 RNA COX-Z. Nasledovalo vyvolanie - tkanivové preparáty boli ofarbené kresyl-Íialovou. Autorádiogramy boli kvantitatívne analyzované a použitím softvéru na analýzu obrazu z Drexel University (Tocco et al., 1992, Eur. J. Neuroscí. 4 1093 - 1103). Merania bolivyhodnotené pomocou štatistiky ANOVA a následnou posthoc analýzou.Koncové in sítu značenie. V paralelnýeh pozorovaníach boli tkanivové preparáty mozgu fixované paraforrnaldehydom dehydratované, vysušené na vzduchu a inkubované s dATP, dCTP, dGTP (0,2 mM), dTTP (13 M), digoxigenin-11-dUTP a DNA polymerázou 1 (Boehringer manheim)(10 jednotiek/100 l) pri teplote 37 °C po dve hodiny. Reakcia bola zastavená pridaním 20 mM EDTA, pH 8,0. Preparáty boli inkubované pri laboratómej teplote cez noc s protilátkami proti digoxigenínu konjugovanými s alkalickou fosfatázou (Genius System, Boehrínger Mannheim) riedenými l 200 V 5 ovčom sére riedenom V 150 mM NaCl, 100 mM TRIS-HCL, pH 7,5. Kolorimetrická detekcia nitro-blue-tetrazóliom a 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfátom bola realizovaná použitím Genius Systemu podľa návodu výrobcu (Sakhi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 7525 - 7529).Nothem blot hybridizácia. Extrakcia RNA bola realizovaná nasledovne. Po usmrtení bol potkaní mozog rozpitvaný a skladovaný pri 75 C pred použitím. Celková RNA bola extrahovaná z hippocampického tkaniva (Passinetti et al., 1994, J. Comp. Neurol. 339 387 - 400). Skrátené Tkanivá boli homogenízované jednu minútu v celkovo 5 m 1 4 M guanidíniumtiokyanátu, 25 mM citronanu sodnom, (pH 7,5), 0,5 sarkosyle a 0,1 M B-merkaptoetanole. Po kyslej fenol-chlorofonnovej extrakcii a vyzrážaní etanolom bola RNA peleta opláchnutá postupne 70 a 100 etanolom. Purifikovaná RNA bola potom rozpustená v 0,5 sodium dodecyl sulfátu (SDS) a skladované pri -75 °C. Celková RNA bola kvantiñkovaná UV spektrometrom. Celková tkanivová RNA (5 ug) bola nanesená na denaturujúci(0,2 m formaldehyd) agarózový gél a potom bola realizovaná elektroforéza. Po elektroforéze bola RNA prenesená na nylonovú membránu (Nylon 66 plus, Hoeffer, San Francisco, CA) V 2 x SSC. Hybridizácia na blote bola realizovaná pri použití 10 ° cprn/ml antisence próby COX-l alebo COX-2 32 P-cRNA v 50 formamide, 1,5 x SSPE 1 SDS, 0,5 sušenom mlieku, 100 ug/ml celkovej kvasinkovej RNA a 500 mg/ml lososovej spermiovej DNA pri 53 °C po 15 hodín. Blot bol premytý do celkovej stringencie 0,2 x SSC, 2,0 SDS pri 72 °C. Blot bol exponovaný na röntgenový film (X-ray film XAR-S, Kodak) s použitím zosilujúcej clony pri -70 °C.Bunkové kultúry. Hipokampálne neurónové kultúry boli odvodené z embryonálnych potkaních mozgov. E 16-E 18 embryá boli rozpítvané V Hanksovom soľnom roztoku a prenesené do kultúry (Pasinetti et al., 1994, J. Comp. Neurol. 339 387 - 400 Peterson et al, 1989, Dev. Brain Rcs. 48 187 - 195), Médiá boli menené každý treti deň. K štúdiu neurotoxicíty glutamátu boli osem dní staré kultúry ošetrené glutamátom (250 M. Sigma) V prítomnosti 2,4 mM Vápenatých iónov a 0,8 mM horečnatých iónov. Po 6 hodinách pôsobenia glutamátu bolo médium vymenené za čerstvé médium. COX-Z-like imunoreaktivita bola V neurónoch stanovená po 12 hodinách.Immunocytochemická detekcia COX-2 V monotypíckých kultúrach primámych potkaních neurónov. Kontrolné a glutamátom ošetrené kultúry boli ñxované v PBS obsahujúcom 4 parafomialdehyd (30 minút, laboratóma teplota), premyté V PBS, ošetrené normálnym sérom a inkubované cez noc pri 4 °C s prímámymi protilátkamí. Protilátky COX-2 (králičie lgG) boli produkované proti syntetickému peptidu (CNASASHSRLDD 1 NPT SEQ ID NO l), ktorý zahŕňa C-koncový región myší COX-2. Ako bolo stanovené analýzou pomocou Westem blotu, antiséra reagujú s ľudskou a potkanou COX-Z, ale nie s COX-l. Vectastain