Dvojzložkový prostriedok na zisťovanie optimálneho času oplodňovania z krvi u hospodárskych zvierat

PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA SLOVENSKEJ REPUBLIKYČíslo prioritncj prihlášky (Sl) Im C 1 6Krajina priority Dátum zverejnenia 16.12.92 Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 09.09.98(76) Majiteľ a pôvodca patentu Bellěr Imrich, Ing., CSc., Nitra, SK(54) Názov vynâlezu Dvojzložkový prostriedok na zisťovanie optimálneho času oplodňovania z krvi u hospodárskych zvieratProstriedok je dvojzložkový. Prvá zložka pozostáva z 1,0 až 2,5 hmotnosti hydrátovej soli iónu síranu S 03 s chemickým prvkom dvojmocného katiónu me di alebo zinku, mangánu, kobaltu, horčíka, z 1,0 až 2,5 objemu kyseliny octovcj alebo maslovej, šťaveľovej, palmitovej, mravčej, sírovej, chlorovodíkovej a z 95,0 až 98,0 objemu vody, s celkovým pH zloäçy roztoku 1,4 až 2,8, a druhá zložka pozostáva z 1,3 až 3,5 hmotnosti kazeínu a z 96,5 až 98,7 objemu vody, s celkovým pH zložky roztoku 1,8 až 3,0.Vynález sa týka dvojzložkovćho roztoku, ktorého účinok sa prejavuje priamou vazbou voľných iónov síranov S 03vo vzorke krvnej plazmy, resp. séra na katióny a bielkoviny pridané roztokom z vynálezu, V kyslom prostredí.Na zisťovanie vhodného času oplodňovania u hospodárskych zvierat bolo spracovaných len málo pracovných metód. Najviac sa zaoberali hodnotením z cervikálneho hlienu, menej z mlieka a málo z krvi.- Rozterom hlienu z matemicového krčka na sklička a usporiadanie kryštálikov v rôznych tvaroch - kríčkovitý, vetvičkovitý, papraďovitý, hmdkovitý, beztvarý, čo záviselo od štádia pohlavného cyklu.- Zmenou elektrickej vodivosti vaginálnej sliznice formou implantácie senzora na monitorový záznam a označovaním týchto zmien. V čase ovulácie bola elektricka vodivosť zvýšená.- Rádioimunologická metóda sa využíva pomocou značených hormónov na zisťovanie hladiny progesterónu v krvnej plazme. Do odobratej vzorky krvnej plazmy sćra s pufrom sa pridá špecifická protilátka a značený progesterón. Po ustálení reakčnej rovnováhy, za 24 hodín sa voľný značený progesterón odstráni absorpciou na aktívne uhlie a centrifugáciou. Gama žiarenie progesterónu značeněho nukleotidom 125 J sa odmeria V supematante metódou scintilácie na gamapektrometri. Uvedené metódy možno viac - menej spoločne charakte rizovať tak, že sú spracované na zisťovanie hlavne u hovä dzieho dobytka a koní, možno ich využívať len v obmedzenom rozsahu, lebo vyžadujú spracovateľské miestnosti, náročné prístrojove vybavenie, prípadne aj chemikálie, početnéa náročné pracovné postupy, väčší počet kvalifikovaných amcvičených pracovných síl, výsledky rozborov nie sú mámehned po odbere vzorky, ale obyčajne po určitom časovom odstupe, kedy ich nemožno využiť pri oplodňovaní u zvierat.Veľmi výrazne sa to prejavuje pri rádioimunologickej metó de, ktorá sa môže realizovať len v laboratómych podmien kach pri náročnom prístrojovom vybavení aj chemikálií aUvedené nevýhody jednotlivých metodík a doterajšieho stavu techniky odstraňuje používanie dvozložlcovćho roztoku na zisťovanie optimálneho času, resp. času oplodnenia z krvi(krvnej plazmy - séra) u hospodárskych zvierat, podstatou ktorého je, že prvá zložka je tvorená 1,0 až 2,5 hmotnosti hydratátovej soli iónu síranu S 05, s chemickým prvkom dvojmocného katiónu medi, alebo zinku, alebo mangánu, alebo kobaltu, alebo horčíka, 1,0 až 2,5 objemu kyseliny octovej, alebo maslovej, alebo šťaveľovej, alebo palmitovej,alebo rnravčej, alebo síranovej, alebo chlorovodikovej a 95,0 až 98,0 objemu vody, s celkovým pH zložky roztoku 1,4 až 2,8, a druhá zložka je tvorená 1,3 až 3,5 hmotnosti bielkoviny - kazeínu a 98,7 až 96,5 objemu vody, s celkovým pH zložky roztoku 1,8 až 3,0.Výhody vynálezu oproti doterajšiemu stavu techniky sú evidentne. Môže sa využívať u tých druhov a plemienhospodárskych zvierat, ktoré v čase oplodňovania neprodukujú mlieko, alebo u mladých zvierat, ktore sa prvýkrát zaraďujú do reprodukčnćho procesu na otestovanie funkčnej činnosti reprodukčných orgánov, má jednoduchý pracovný postup bez prístrojovej techniky a zariadení (jedine odstredivka na získanie krvnej plazmy z odobratej krvi),vzorky môže spracovávať osoba bez nárokov na špeciálnu kvalifikáciu a náročného zacvičovania, rozbory možno robiť priarno v každom stáde, výsledky rozborov sú známe za 5 až 30 minút, Účinok roztoku sa prejavuje priamou väzbou voľných iónov síranov sof vo vzorke krvnej plazmy na kazeín akatióny pridané roztokom z vynálezu v kyslom prostredí. Pri tejto reakcii vzniká zrazenina kyseliny s bielkovinou - kazeínom, na ktorú sa viažu uvedené katióny a ióny síranov, ako na prenášač. Zrazenina z bielkovín krvi sa rozpustí v kyslom prostredí.Prítomnosť voľných iónov síranov so v krvi (plazme) pri skúške sa prejavuje tým, že vzniknutá zrazenina je zo začiatku rozptýlená po celej dĺžke tekutiny v skúmavke s pribúdajúcim množstvom voľných iónov síranov so j v krvi vzniknutú zrazenina pri skúške v skúmavke pláva. V prípade, že ióny síranov 503- sú v elektrickej väzbe s katiónmi v krvi, zrazenina sada na dno skúmavky. Množstvo síranov v krvi neovplyvňuje rýchlosť pohybu zrazeniny pre príslušnú polohu, ale množstvo voľných iónov síranov soft Voľne ióny síranov soj vznikajú v organizme zvierat - samíc v priebehu ovulácie prerušením elektrickej väzby medzi katiónmi a iónmi. Opis postupu dôkazu prerušenia elektrickej väzby a účinnosť väzby iónov síranov soš sa preverovalo in vitro.Konkrétne vyhotovenie vynálezu sa urobí ako dvozložkový roztok, kde prvá zložka - 1000 ml roztoku obsahuje- 15 g (1,5 hmotnosti) hydrátovej soli síranu horečnatého 15 ml (1,5 objemu) kyseliny palmitovej 970 ml (97,0 objemu) vody pH roztoku je 2,0 alebo- 16 g (1,6 hmotnosti) hydrátovej soli síranu zinočnatěho 16 ml (1,6 objemu) kyseliny šťaveľovej 968 ml (96,8 objemu) vody pH roztoku je 1,72 alebo- 20 g (2,0 hmotnosti) hydrátovej soli síranu manganateho 19 m 1 (1,9 objemu) kyseliny mravčej 961 ml/96,1 objemu vody pH roztoku je 2,26 alebo- 22 g (2,2 hmotnosti) hydrátovej soli síranu kobaltnatěho 24 ml (2,4 objemu) kyseliny maslovej 954 ml (95,4 objemu) vody pH roztoku je 1,98 alebo- 10 g (1,0 hmotnosti) hydrátovej soli síranu meďnatćho 10 ml (1,0 objemu) kyseliny sírovej 980 ml (98,0 objemu) vody pH roztoku je 1,65 alebo- 21 g (2,1 hmotnosti) hydrátovej solí síranu manganatého 17 ml (1,7 objemu) kyseliny octovej 962 ml (96,2 objemu) vodypH roztoku je 1,97 alebo- 13 g (1,3 hmotnosti) hydrátovej soli síranu horečnatěho 12 ml (1,2 objemu) kyseliny chlorovodíkovej 975 ml (97,5 objemu) vody pH roztoku je 1,69- 25 g (2,5 hmotnosti) kazeínu 975 ml (97,5 objemu) vody pH roztoku je 2,0Uvedené príklady sú len jednou z možných kombinácií z celkového veľkého počtu možných variant hydrátovej soli iónu síranu so s uvedenými chemickými prvkami dvojmocných katiónov a jednotlivých kyselín v rámci ich Vo-tuálneho rozpätia.Uskutočniteľnosť skúšky sa urobí tak, že do skúmavky sa dá 1,0 ml vzorky krvnej plazmy (séra ), k tomu sa pridá 0,5 m 1 z roztoku so zložkou kazeínu a vody (obsah tekutiny sa premieša 2 až 3 krát obrátením skúmavky o 180 °) a 2,0 ml z roztoku so zložkou síranu, kyseliny a vody (obsah skúmavky sa znovu premieša 2 až 3-krát obrátením o 180 °). Skúmavka sa odloží stojato aby sa neprevrátila a V tekutine v pokoji mohlo prebiehať rozloženie zrazeniny na čas 5 až 30 minút, kedy sa zisťuje výsledok skúšky.Výsledok sa hodnotí na základe polohy zrazeniny v skúmavke. Ked zrazenina sadá na dno skúmavky, vz.i 1 ik voľných íónov siranov so sa ešte neprejavil, aj ked sú priznaky ovulácie - ruje. Krček maternice nie je otvorený. Ked je zrazenina v skúmavke rozptýlená po celej dĺäce v tekutine,krček maternice sa začína otvárať, resp. zatvárať - ked sa končí ovulačnć obdobie. Keď zrazenina pláva na povrchu tekutiny, krček maternice je otvorený. Oplodňovanie sarníc pritom má byť rozdielne u jednotlivých druhov hospodárskych zvierat, V závislosti od dĺžky trvania ovulačnćho času obdobia, napr. u hovädzieho dobytka a koní.V prípade, že prvá odobratá vzorka krvi ešte nepoukazuje na správny čas oplodnenia, je potrebné skúšku opakovať po určitom časovom odstupe.Roztok po rozboroch účinkuje na báze kvalitatívnych ukazovateľov so semikvantitativnou úrovňou. Preto preclznosť a náročnosť pracovného postupu pri rozboroch je odlišná a podstatne jednoduchšia ako pri kvantitatívnych rozboroch.Dôkaz in vitro na prerušenie elektrickej väzby medzi katiónmi a iónmi sirariov so v krvi u hospodárskych zvierat mimo ovulačnćho obdobia sa urobí tak, že vzorka krvnej plazmy - séra sa prepustí cez kolónku iontomeniča katex, kde sa preruší elektrická väzba medzi katiónmi a iónmi. Tým pH plazmy sa zmení na 7,29 až 7,5 l na 1,80 až 3,51. Podobne sa upraví druhá zložka roztoku, ktorá. je na báze kazeínu a vody tým, že sa tiež prepustí cez kolónku iontomeniča katex, čím sa upraví pH na 2,0 až 2,6 a preruší sa elektrická väzba medzi katiónmi a iónmi síranov sof.Zo vzorky plazmy - séra sa urobí skúška podľa opisu z vynálezu do 1,0 m 1 plazmy sa pridá 0,5 ml z roztoku z vynálezu so zložkou kazeínu a vody, tekutina v skúmavke sa premieša, pridá sa z roztoku so zložkou sírariu, kyseliny a vody 2,0 ml, tekutina v skúmavke v ktorej vznikol zákal(nie zrazenina) sa znovu premieša v a skúmavka sa odloží na stojato, aby v tekutine v pokoji mohlo prebiehať rozloženie zákalu. Výsledok skúšok ukázal, že pri všetkých takto upravených vzoriek plazmy od zvierat mimo ovulačně obdobie, zákal nesadal na dno skúmavky, ale začal plávať, ako ked sú výsledky v ovulačnom období u sarníc.Čas trvania vytvorenia ustálenej polohy zákalu bol 1 až 2 hodiny oproti zrazenine z ovulačného obdobia, kde to býva 5 až 30 minút, čo vyplýva z rozdielneho fyzikálneho stavu.Hľadanie dôkazu in vitro s podobnými účinkami ako s roztokom z vynálezu medzi ovuláciami, sa nezistilo ani pri jednom z horrnónu, ktorí sa zúčastňujú v rámci ovariálneho cyklu, ani ich kvantitatívnymi zmenami.Overovanie funkčnej spoľahlivosti roztoku z vynálezu na zisťovanie z krvnej plazmy sme urobili na viac druhoch hospodárskych zvierat.- U bahníc pri homionálne riadenej ovulácii sa vyhodnotilo 36 kusov zvierat. Reakcia ovulácie bola rozdielna. Večer bol vhodný čas na oplodnenie u 17 ks a ráno u ks, u l ks sa ovulácia nevyvolala. Spoľahlivosť rozborov sa porovnávala s rektálnym vyšetrenim.- U 48 kráv sa porovnávali vzorky mlieka a krvnej plazmy (tiež rektálne vyšetrenie otvorenosti krčka matemice) roztokom z vynálezu. Výsledky rozborov boli jednotné.- U kobýl sa overoval roztok z vynálezu s porowianim folikulometrie zo sonografu, ale len u 6 kusov. Zistené výsledky bolí jednotné.- Roztok z vynálezu sa overoval aj u králikov - len 4 ks,kde je prorokovaná ruja - ovulácia, ktorá sa uskutočňuje cca 13 hodín po oplodňovaní sarníc. Sledovanie sa robilo z krvnej plazmy každé 2 hodiny a výsledok ukázal, že na 11 až 13 hodinu zrazenina plávala.Roztok podľa vynálezu sa má využívať na zisťovanie optimálneho času oplodňovania z krvi u všetkých druhov hospodárskych zvierat, hlavne ktoré v čase oplodňovania neprodukujú mlieko, predovšetkým kone a tiež dobytok, ošípané, ovce, kozy, alebo ktoré boli prvýkrát vybraté na oplodňovanie. Tiež u mladých sarníc všetkých druhov hospodárskych zvierat pred ich zaradením do reprodukcie na otestovaníe funkčnej činnosti ovarialných cyklov.Dvojzložkový prostriedok na zisťovanie optimálneho času oplodňovania z krvi u hospodárskych zvierat, v y značujúcí sa tým, žeprvázložka,1000 ml roztoku pozostáva z 1,0 až 2,5 hmotnosti hydratátovej soli iónu síranu 50- s chemickým prvkom dvojmocnéhokatiónu medi, alebo zinku, alebo mangánu, alebo kobaltu,alebo horčíka, z 1,0 až 2,5 objemu kyseliny octovej, alebo maslovej, alebo šťaveľovej, alebo palmitovej, alebo mravčej, alebo sírovej, alebo chlorovodikovej a z 95,0 až 98,8 objemu vody, s celkovým pH zložky roztoku 1,4 až 2,8, a druhá zložka, 1000 ml roztoku pozostáva z 1,3 až 3,5 hmotnosti bielkoviny - kazeínu a z 96,5 až 98,7 objemu vody, s celkovým pH zložky roztoku 1,8 až 3,0.