Modifikované cytokíny na použitie pri terapii rakoviny

Tento vynález sa týka modifikovaných cytokínov na použitie pri liečbe rakoviny. Vynálcz sa týka najmä cytokínových derivátov schopných zacieľovaniď nádorových ciev a buniek predstavujúcich antigén.Protinádorová aktivita niektorých cytokínov je dobre známa a opísaná. Niektoré cytokíny už boli terapeuticky použité aj u ľudí (Fiers, W. Biologická terapia s TNF predklinické štúdie. In V. de Vita, S. Hellman a S. Rosenberg Eds). Biologické terapia rakoviny princípy a prax. J.B. Lippincott Company, Philadelphia,1995. P. 295-327). Napríklad, také cytokíny ako interleukín-2 (IL-2) a interferón o(IFNoz) ukazujú pozítívnu protínádorovú aktivitu u pacientov s rôznymi typmi nádorov, ako je metastázový karcinóm ľadvín, leukémia vlasových buniek, Kaposi sarkórn, melanóm, mnohopočemý mielóm a podobne. Iné cytokíny ako IFNB, faktor nádorovej nekrózy (TNF)(x, TNFB, IL-l, 4, 6, 12, 15 a faktory stimulujúce kolónie (CFS) ukazujú určitú protinádorovú aktivitu na niektoré typy nádorov, a teda sú predmetom ďalších štúdií.Vo všeobecnosti terapeutické použitie cytokínov je silne obmedzené ich systémovou toxicitou. Napríklad,TNF bol pôvodne objavený pre svoju kapacitu vyvolania hemoragickej nekrózy niektorých nádorov (Carswell, E.A., et al., Endotoxínom vyvolaný sérový faktor, ktorý spôsobuje nekrózu nádorov. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 1975, 723666-70), a pre svoj in vitro cytotoxický efekt na rôzne nádorové línie (Helson, L., et al.,Efekt faktora nádorovej nekrózy na kultivované ľudské melanómové bunky. Nature 1975. 2582731-732), ale následne sa dokázalo, že má sihiú prozápalovú aktivitu, ktorá môže v prípade nadprodukčných podmienok,nebezpečne pôsobiť na ľudský organizmus (Tracey, K.L., and A. Cerami. Faktor nádorovej nekrózy, iné cytokíny a ochorenia. Ann. Rev. Cell Biol, 1993, 9 z 3 l 7-43).Keďže systémová toxicita je základným problémom použitia farrnakologicky aktívnych množstiev cytokínov u ľudí, teraz sú vo vývoji deriváty a terapeutické stratégie zamerané na redukovanie toxických efektov tejto triedy biologických efektorov pri udržiavaní ich terapeutickej účinnosti.Niektoré prístupy sú zamerané naa) rozvoj zmesových proteínov, ktoré môžu dodávať TNF do nádoru a zvýšenie miestnej koncentrácie. Napríklad, boli vyrobené zmesové proteíny obsahujúce TNF a pre nádor špecifické protilátky (Hoogenboom, H. R., et al., Konštrukcia a expresia protilátky faktora nádorovej nekrózy alebo spojených proteínov. Mol. Immunol. 1991. 28 1027-37), b) rozvoj TNF mutantov, ktoré udržujú protinádorovú aktivitu a majú redukovanú systémovú toxicitu. Podľa toho, boli už pripravené mutanty schopné Selektívne rozoznávať len jeden receptor (p 55 alebo p 75) (Loetscher, H., et al., Mutanty ľudského faktora nádorovej nekrózy alfa (TNF alfa) s výlučnou špecifickosťou pre 55-kDa TNF receptory. J . Bíol. Chem. 1993. 26826350-7), c) použitie anti-TNF protilátok schopných redukovať niektoré toxické efekty TNF bez ohrozenia ich protinádorovej aktivity. Také protilátky už bolí opísane v literatúre (Rathjen, D.A., et al., 1992. Selektívne zvýšenie nádorovej nekrotickej aktivity TNF alfa s monoklonálnou protilátkou. Brit. J . Cancer 65852), d) použitie TNF derivátov s vyšším polčasom rozpadu (napríklad TNF konjugované s polyetylénglykolom).Nedávno bola zaznamenané príprava TNF derivátov schopných selektívne pôsobiť na nádorové miesta. Napríklad, bol opísaný zmesový proteín získaný spojením génu veľkého reťazca antitransferínového receptora mAb a TNF génu (Hoogenboorn, H. R., et al., Konštrukcia a expresia protilátky faktora nádorovej nekrózy alebo zmesových proteínov. Mol. Immunol. 1991. 2821027-37), alebo zmesový proteín TNF so závcsovou oblasťou monoklonálnej protilátky proti s nádorom spojeným TAG 72 antigénom (Yang, J ., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová Fv/TNF molekula rnajúca protinádorovú imunreaktivitu Fv, ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 32873-8 l), alebo Fv-TNF zmesový proteín (Yang,J ., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová Fv/TNF molekula majúca protinádorovú imunreaktivitu Fv,ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 322873-81).EP 251 494 opisuje systém na podávanie diagnostického alebo terapeutického činidlá, ktoré zahrnuje protilátku konjugovanú s avidínom alebo streptavidínom, čínidlo schopné komplexovania konjugovanej protilátky a zlúčeniny obsahujúcej diagnostické alebo terapeutické čínidlo konjugované s biotínom, ktoré sú podávané postupne a primerane postupne tak, aby urnožňovali lokalizáciu terapeutického alebo diagnostického činidla prostredníctvom interakcie biotín-streptavidín na bunky pôsobenia rozoznávané protilátkou. Opísané terapeutické alebo diagnostické činidlá zahmujú cheláty kovov, najmä cheláty rádionuklidov a protinádorove činidlá s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je cis-platina, doxorubicin atď.EP 496 074 opisuje spôsob, ktorý uskutočňuje postupné podávanie biotinylovanej protilátky, avidín alebo streptavidín a bíotinylované diagnostické alebo terapeutické čínidlo. Hoci cytotoxicke činidlá, ako ricín, sú geneticky uvádzané, väčšinou je opísaná aplikácia týkajúca sa rádiooznačených zlúčenin.W 0 95/ 15979 opisuje spôsob lokalizovania vysoko toxických činidiel na bunky pôsobenia, na základe podávania prvého konjugátu zahmujúceho špecifickú molekulu pôsobenia konjugovanú s ligandom alebo antiligandom, po čom nasleduje podávanie druhého konjugátu zloženého z toxického činidla viazaného na antiligand alebo na ligand.W 0 99/ 13329 opisuje spôsob pôsobenia molekuly na nádorové angiogénne cievy na základe konjugácie tejto molekuly s ligandmi NGR receptorov. Bolo navrhnutých veľa molekúl ako možných kandidátov, ale špecificky opisaný je len doxorubicín. Nie je opísané žiadne použitie NGR receptorov ako vehikulov cytokínov na vyvolanie imunitnej reakcie.Teraz bolo prekvapujúco zistené, že terapeutický index určitých cytokínov môže byť značne zlepšený a ich irnunoterapeutické vlastnosti môžu byť zvýšené spojením s ligandom aminopeptidáza-N receptora(CD 13). CD 13 je trans-membránový glykoproteín s 150 kDa, vysoko zachovaný u rôznych druhov. Je expresovaný na normálnych bunkách, ako aj v myeloidných nádorových líniách, v angiogénnom endoteli a v niektorých epiteloch. CD 13 receptor je bežne označovaný ako NGR receptor, pretože jeho peptidové ligandy majú rovnaký prvok NGR ako aminokyseliny.Podľa prvého aspektu vynález uskutočňuje konjugačný produkt cytokínu vybraný z TNF a IFNy a ligandu CD 13 receptora. Tento ligand môže byť protilátka alebo jej fragment, ako je Fab, Fv, jednoreťazcová Fv,peptid alebo peptido-mymetická, konkrétne peptidu podobná molekula schopná viazať CD 13 receptor, prípadne obsahujúca modifikované, níe prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny. Ligand je prednostne priamy alebo cyklický peptid zahrnujúci NGR prvok, ako je CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cykloC-VLNGRMEC alebo cyk 1 oCNGRC, alebo prednostnejšie peptid CNGRC. Peptíd môže byť spojený priamo s cytokínom alebo nepriamo prostredníctvom vložky, ktorou môže byť jedna aminokyselina, aminokyselinová sekvencia alebo organické rezíduum, ako je 6-aminokapryl-N-hydroxysukcínimid. Spájacie postupy sú známe odborníkom v stave techniky a zahrnujú techniky genetického inžinierstva alebo chemickej syntézy.Peptidový ligand je prednostné viazaný s N-ukončenim cytokínu, takto minimalizujúc všetky prekážky pri viazaní modiñkovaného cytokínu s jeho receptorom. Alternatívne, peptid môže byť viazaný na arninokyselinové rezíduum, ktorým sú amidové alebo karboxylové väzbové receptory, prirodzene sa vyskytujúce na molekula alebo umelo vsunuté technikami genetického inžinierstva. Modiñkovaný cytokin je prednostné pripravený použitím cDNA zahmujúcej Sízdmžujúcu sekvenciu kódujúcu peptid.Podľa prednosrného uskutočnenia je uskutočnené konjugačný produkt TNF a CNGRC sekvencie. Prednostnejšie, amino-ukončenie TNF je viazané s CNGRC peptidom prostredníctvom vložky G (glycín).Výsledný produkt (N GR-TNF) dokázal, že je aktívnej ší než TNF na RMA-T lymfóm zvieracích modelov. Ďalej, zvieratá liečené NGR-TNF boli schopné neprijať ďalšie nádorotvomé dávky RMA-T alebo RMA buniek. Zvýšenie protinádorovej aktivity, v porovnaní s normálnym TNF, mohlo byť pozorované u imunity schopných zvierat, ale nie u zvierat s chýbajúcou irnunitou. Toto ukazuje, že zvýšenie protinádorovej aktivity TNF konjugovaného s NGR peptidmi je viac vďaka imunitnej reakcii než priamej cytotoxickej aktivite konjugátu.Tiež bolo ukázané, že in vivo imunimé efekty vyvolané prostredníctvom NGR-TNF sú priamo vo vzťahu k CD 13 receptoru. Bolo napríklad pozorované, že protilátka proti CD 13 receptoru, ako aj GNGRC ligand konkuruje NGR-TNF in vivo, takto naznačujúc receptorový mechanizmus pôsobenia pomocou NGR-TNF.Terapeutický index TNF/CD 13 ligandových konjugátov môže byť ďalej zlepšený použitím mutantnej formy TNF schopnej selektívneho viazania na jeden alebo dva TNF receptory, p 75 TNFR a p 55 TNFR. Tento TNF mutant môže byť získaný prostredníctvom na miesto zameranej mutagenézy (Loetscher, H., et al., Mutanty ľudského faktora nádorovej nekrózy alfa (TNF alfa) s výlučnou špecíñckosťou pre 55-kDa TNF receptory. J. Biol. Chem. 1993. 268226350-722 Van Ostade, X., et al., Ľudské TNF mutanty s elektívnou aktivitou na p 55 receptor. Nature 1993. 3612266-9).Farmakokinetika modifikovaných cytokínov podľa vynálezu môže byť zlepšená pripravením polyetylénglykolových derivátov, ktoré umožňujú rozšíriť plazmatický polčas rozpadu samotných cytokínov.Ďalšie uskutočnenie vynálezu je uskutočnené difunkčnými derivátrni, v ktorých sú cytokíny modifikované s CD 13 ligandom konjugované s protilátkami, alebo ich fragmentmi, proti nádorovým antigénom alebo iným nádorovým angíogénnym rnarkerom, napríklad av integríny, metaloproteázy alebo vaskulárny rastový faktor, alebo protilátky alebo ich fragmenty zamerané proti zložkám mimobunkovej materskej pôdy, ako sú antitenaskínové protilátky alebo antiñbronektínová EDB doména. Nedávno bola zaznamenana príprava zmesového produktu medzi TNF a závesovou oblasťou mAb proti s nádorom spojeným TAG 72 antigénom expresovaným žalúdočným a vaječníkovým adenokarcinómom (Yang, J., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová Fv/TNF molekula majúca protinádorovú imunreaktivitu F v, ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 32873-81).Ďalšie uskutočnenie vynálezu je uskutočnené predpôsobiacim systémom biotín/avidín na nádory. Podľa tohto prístupu je získaný ternárny komplex na nádorovom antigémiom mieste, v rôznych štádiách, ktorý je vytvorený l) biotinylovaným mAb, 2) avidínom (alebo streptavidínom) a 3) divalentným cytokínom modifikovaným CD 13 ligandom a biotínom. Množstvo publikácií dokázalo, že prístup predpôsobenia, v porovnaní s konvenčným pôsobením imunokonjugátmi môže súčasne zvýšiť pomer aktívnej molekuly cíelenej na pôsobenie na neviazanú aktívnu molekulu, takto redukujúc toxicitu liečby (Colombo, P., et al., Imunoscitigrafia s anti-chromogranín A protilátkou u pacientov s endokrínnými/neuroendokrinnými nádormi. J. Endocr. Invest. 1993. 1684 l-3 Paganelli, G., et al., Trojstupňovvá monoklonálna protilátka pôsobenia na nádor u karcinoembryonálnych antigénpozitívnych pacientov. Cancer Res. 1991. 5125960-6 Modoratí, G., et al., Imunoscitigrafia s trojstupňovou monoklonálnou predpôsobiacou technikou pri diagnóze uveálneho melanómu predbežné výsledky. Br. J. Opthalm. 1994. 7819-23 Pagancllí, G et al., Klinická aplikácia avidíii-biotín systému pri pôsobení na nádor. In D. Goldenberg (Ed. Cancer therapy with radiolabeled antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995. P. 293-253). Tento prístup produkoval priaznivé výsledky pri biotinylovanom TNF, ktorý je schopný vyvolať cytotoxicitu in vitro a zníženie rastu nádorových buniek pri podmienkach, v ktorých normálne TNF bolo neaktívne (Moro, M., et al., Nádorové bunky pôsobiace s protilátkou avidínových komplexov a biotinylovaný faktor nádorovej nekrózy alfa. Cancer Res. 1997. 5721922-8 Ljunggren, H. G., a K. Karre. Hostiteľská odolnosť zameraná selektívne proti H-Z-deñcitných lymfómovým variantám Analýza mechanizmu. J. Exp. Med. 1985. 162 1745-59). Prístup predpôsobenia môže byť tiež uskutočnený dvoj fázovým postupom použitím dvojšpecifickej protilátky, ktorá súčasne viaže nádorový antigén a modifikovaný cytokín. Nedávno bolo opísané použitie dvojšpecifickej protilátky zameranej proti karcinoembryonálnemu antigénu a TNF ako prostriedok pre TNF nádorové predpôsobenie (Robert, B., et al., 1996. Cytokínové pôsobenie u nádorov použitím dvojšpecifickej protilátky zameranej proti karcinoembryonálnemu antigénu a faktora nádorovej nekrózy alfa. Cancer Res. 564758).Podľa ďalšieho uskutočnenia vynález zahmuje TNF molekulu konjugovanú s CD 13 ligandorn, ako aj protilátkou, alebo jej fragmentom (priamo alebo nepriamo cez mostík biotín-avidín), na rôznych TNF podjednotkách, kde protilátka alebo jej fragmenty sú zamerané proti antigénu expresovanému na nádorových bunkách alebo iných zložkách nádorovej strómy, napríklad tenaskínovej a ñbronektínovej EDB domény. Toto vyúsťuje do ďalšieho zlepšenia cieľových vlastností modifikovaných cytokínov u nádoru a do pomalého uvoľňovania posledne uvedených v nádoroch mikroprostredia cez prechodné štádiá trimér-monomér-trimér. Ako je ukázané v predchádzajúcich prácach, v skutočnosti, modifikované podjednotky TNF konjugátov môžu disociovať z pôsobiacich komplexov a znovu asociovať tak, aby vytvárali nemodifikované tiiméme TNF molekuly, ktore potom vykonávajú difúziu v nádorovom prostredí. Bolo ukázané, že uvoľňovanie bioaktivneho TNF sa vyskytuje v rámci 24-48 hodín po pôsobení.Na použitie v terapii budú modifikované cytokíny podľa vynálezu vhodne formulované vo farmaceutických prípravkoch na orálne alebo parenterálne podávanie. Formulácie na parenterálne podávanie sú preferované a zahmujú inj ektovateľné roztoky alebo suspenzie a tekutiny pre infúzie. Na prípravu parenterálnych foriem bude aktívna zložka rozpustená a suspenzovaná v sterilnom nosiči, prípadne pridaním excipientov, ako sú rozpúšťacie látky, izotonické činidlá, konzervačne látky, stabilizátory, emulzifikátory alebo disperzné činidlá, a následne budú distribuované v liekovkách alebo ampulách.Príprava cytokínov vo forme lipozómov môže zlepšiť ich biologickú aktivitu. V skutočnosti bolo pozorované, že acylácia TNF aminoskupín vyvoláva zvýšenie hydrofóbnosti bez straty biologickej aktivity in vitro. Ďalej bolo zaznamenané, že TNF viazané na lipidy nespôsobilo cytotoxicitii in vitro, imunomodulačné efekty a redukovalo toxicitu in vivo (Debs, R.J., et al., S lipozómom spojený faktor nádorovej nekrózy zachováva bioaktivitu v prítomnosti neutralizujúcich protilátok faktora nádorovej nekrózy. J. Immunol. 1989. 14311927 Debs, R.J., et al., Imunomodulačné a toxické efekty samostatného a lipozómom opuzdreného faktora nádorovej nekrózy alfa u potkanov. Cancer Res. 1990. 502375-80).Maximálna tolerovaná dávka bolusu TNF u ľudí je 218-410 Lg/m (Fraker, D.L., Alexander, H.R. Pass,H 1., 1995. Biologická terapia s TNF systémové podávanie a izolačné premývanie. In Biologie teraphy of cancer principles and practice, De Vita, V., Hellman, S. Rosenberg, S. (eds) p.329-345, J. B. Lippincott Company Philadelphia) asi 10-násobne nižšia než efektívna dávka u zvierat. Na základe údajov od myších modelov sa uvažuje, že aspoň 10-krát vyššia dávka je potrebná na dosiahnutie protinádorového efektu u ľudí(Schraffordt Koops, et al., Hyperterrnické premývanie ízolovanej končatiny faktorom nádorovej nekrózy a melfalánom ako liečba lokálne postupujúcich a obvyklých sarkómov mäkkých tkanív končatín. Radiotherapy Oncology 1998. 4821-4). V prvých klinických štúdiách na hypertermícké premývanie ízolovanej končatiny boli získané vysoké rýchlosti odpovede pri špecifickej dávke 4 mg TNF v kombinácii s melfalánom a interferónom 7 (Lienard, D., et al., Pri prechodných metastázach malígneho melanómu liečeného vysokou dávkou rTNF alfa v kombinácii s interferón-gama a melfalán pri izolačnom premývaní. World Joumal of Surgery 1992. 162234-40). Ďalšie práce ukázali, že interferón y môže byť vypustený a že aj nižšie dávky TNF môžu byť dostatočné na vyvolanie terapeutickej odpovede (Hill, S., et al., Faktor nádorovej nelqózy alfa s nízkou dávkou a melfalán pri hypertermickom premývaní ízolovanej končatiny. Br. J . Surg. 1993. 802995-7 Egger SK 287550 B 6mont, A. M., et al., Premývanie izolovanej končatiny s faktorom nádorovej nekrózy a melfalán na záchranu končatiny u 186 pacientov s lokálne postupujúcoim sarkómom mäkkých tkanív končatiny. The cmnulative multícenter European experience. Ann. Surg. 1996. 2242756-65). Keďže tieto dva cytokíny vykazujú synergické efekty na endotelové bunky, ich kombinované, selektívne pôsobenie pravdepodobne vyústi do silnejšej protinádorovej aktivity, takto umožňujúc prekonať problémy systémovej toxicíty, s ktorou sa obvykle stretáva pri terapii rakoviny s týmito istými cytokinmi použitými v kombinácii. Ďalej je známe, že TNF môže znížiť bariérovú funkciu ciev endotelových línii, takto zvyšujúc ich priepustnosť do makromolekúl. Berúc výhodu nižšej toxicity liečby s modifikovanými TNF molekulami podľa vynálezu a ich cieľové vlastnosti nádorových ciev, altematívnou aplikáciou je ich použitie na zvýšenie príepustnosti nádorových ciev do iných zlúčenín, buď na terapeutické alebo diagnostické účely. Napríklad, modifikované TNF môže byť použitý na zvýšenie nádorového príjmu rádiooznačených protilátok alebo hormónov (nádor predstavujúce zlúčeniny) V rádioimunoscintigrañí alebo rádioimunoterapii nádorov. Altematívne, príjem chemoterapeutických liečiv,imunotoxínov, lipozómov nesúcích liečivá alebo gény, alebo ich protirakovinové liečivá by mohol byt tiež zvýšený tak, že ich protinádorové účinky sú zosilnené.Podľa toho, cytokíny podľa vynálezu môžu byť použité pri liečbe alebo diagnostíkovaní rakoviny v kombinovaných, oddelených alebo po sebe nasledujúcich prípravkoch, tiež s inými diagnostickými alebo terapeutickými látkami.Konečný aspekt vynálezu sa týka cDNA kódujúcej konjugované cytokíny tu objavené, ktoré môžu byť pripravené z cytokínov cDNA pridaním 5- alebo ť-združujúcej sekvencie kódujúcej CD 13 ligand, prednostne cieľové peptidy opísané skôr. Kombinovaná cDNA môže byť použitá samotná, alebo po vsunutí vo vektoroch na génovú terapiu. Príprava a terapeutické aplikácie vhodných vektorov je opísané v (Mizuguchi, H., et al., Faktorom nádorovej nekrózy alfa-sprostredkovaná regresia nádoru pomocou in vivo prenosu génov do artétie, ktorá vedie k nádoru. Cancer res. 1998. 585725-30), ktoré sú týmto zahrnuté referenciou.Prehľad obrázkov na výkresochObr. 1 Efekt TNF a NGR-TNF na rast RMA-T lymfómov (a a b) a na hmotnosť zvierat (c a d). 5 zvierat/skupina bolo liečených jednou dávkou TNF alebo NGR-TNF (i.p.), 10 dní po implantácii nádoru. Hodnoty nádorovej oblasti na 14. deň ako funkcia dávky (b) a strata hmotnosti po liečbe (stred 11. a 12.dňa) (d) bola interpolovaná z logaritmickej krivky. Protinádorové efekty vyvolané 1 g alebo 9 ug NGR- .TNF na 14. deň boli väčšie než tie, ktoré boli vyvolané porovnateľnýnn množstvami TNF (P 0,024, resp. P 0,032), pričom strata hmotnosti po týchto líečbach bola podobná. Šírky označujú extrapolované dávky TNF a NGR-TNF, ktoré vyvolajú porovnateľné efekty.Obr. 2 Efekt mAb R 3-63 a CHGRC na protinádorovú aktivitu NGR-TNF (a) a TNF (b).MAb R 3-63 alebo CNGRC bolo zmiešané s NGR-TNF alebo TNF a podávané zvieratám s RMA-T nádorom, 12 dni po implantácii nádoru (n 5 zvierat/skupiny). V oddelených experimentoch (c) bolo TNF a NGK-TNF spolupodávané s CNGRC alebo CARAC (kontrolný peptid) zvieratám s ll-dňovým nádorom(n 5). Protinádorový efekt 1 g NGR-TNF bol silnejší než 9 g TNF (P 0,009, t-test na 20. deň) a bol výrazne inhibovaný CNGRC (P 0,035) a mAb R 3-63 (P 0,011).Obr. 3 Efekt obmedzenej trypsinovej digescie NGR-TNF a TNF na ich hmotnosť (a) a protinádorová aktivita (b).Trypsín-agaróza bola pripravená spojením 1 mg trypsinu s 1 m 1 Activated CH Sepharose (PharmaciaUpjohn), podľa výrobných inštrukcií. NGK-TNF a TNF (170 g každého v 300 l 0,15 M chloridu sodného,0,05 M fosfátu sodného, pH 7,3) bolo zmiešané s 15 l živicovej suspenzie (14) alebo pufra samotného a otáčané cez oba konce pri 37 °C po určený čas. Štyri produkty bolo ñltrované cez 0,22 m Spin-X zariadenie(Costar, Cambridge, MA) a uložené pri -20 °C až do použitia. (a) Analýza elektrosprejovej hmotnostnej spektrometrie. Hodnoty molekulovej hmotnosti a zodpovedajúcich produktov (sekvencie s N-ukončením) sú označené na každom vrchole. Šípky na sekvenciách označujú miesto štiepenia. (b) Efekt l alebo 3 (Lg NGRTNF a TNF, ínkubovaných bez (vrchné bloky) alebo s (dolné bloky) trypsínu, na rast RMA-T nádorov a hmotnosti zvierat (stredná hodnotałSE skupín liečených l a 3 g dávkami). Zvieratá boli liečené 13 dní po implantácii nádoru (n 5 zvierat/skupina).Obr. 4 SDS-PAGE a protinádorová aktivita ľudského NGR-TNF pred denaturáciou/preskladnení a po denaturácii/preskladaní.SDS-PAGE pri neredukujúcich podmienkach (A) ľudského TNF (a) NGR-TNF pred (b) a po (c) procese denaturácie/preskladania opísané v príklade V.