Sekvencie DNA, rekombinantné molekuly DNA a spôsob výroby polypeptidov podobných rastovému hormónu ošípanej

Vynález sa týka sekvencií DNA, rekombinantných molekúl DNA a spôsobov výroby rastového hormónu ošípanej a polypeptidov s účinnosťou rastového hormónu ošípanej. Vynález sa predovšetkým týka DNA sekvencií exprimovaných v určenom hostiteľovi a produktov získaných touto expresiou. DNA sekvencie a rekombinantné DNA molekuly podľa vynálezu sú charakteristické tým, že kódujú polypeptidy s bíologickou účinnosťou rastovévho hormónu ošípanej. sekvencie DNA, rekombinantnć molekuly DNA a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu využiť pri výrobe polypeptidov určených pre ošípané ako všeobecne anaboliká, najmä na zintenzívnenie rastu, zvýšenie hmotnostného prírastku a zvýšenie produkcie mäsa týchto zvierat.Rastový hormón ošípanej (SGH) je polypeptidovýhormón syntetizovaný a vylučovaný predným lalokom hypofýzy. SGH sa zrejme syntetizuje ako proteínový prekurzor (prekurzor rastového hormónu ošípanej) a potom v priebehu vylučovania a uvoľňovania hormón dozrieva na rastový hormón ošipanej. Hotový hormón sa potom uvoľňuje do krvného obehu. Čiastkové. sekvencia aminokyselín rastového hormónu ošípanej je opísaná v publikácii J.B.Mills a ďalší, Cyanogen Bromide Cleavage and Partial Amino Acid Sequence of Porcine Growth Hormone, J.Biol. Chem., 245, str. 3407-15(1970), a ďalej v publikácii A.E. Wilhelmi a LB. Mills,Studies On The Primary Structure Of Porcine Growth Hormone, ed. A.Pecils and E.E.Muller, Amsterdam,Excerpta Medica Foundation, 1972, str. 38-41, Intern. Congr. Ser. 244. Rastové hormóny sa normálne produkujú v priebehu životného cyklu, pričom zjavne vo väčšom množstve v priebehu dospievania. Hormóny tohto typu sú známe tým, že podporujú rast kostry, retenciu dusíka, syntézu proteínov, a tiež ovplyvňujú metabolizmus glukózy a lipidov. Rastové hormóny sa preto obvykle uznávajú ako anabolíckć látky.Rastové hormóny sú čiastočne špecifické, pokiaľ ide o živočíšny druh. Rastový hormón jedného druhu však môže byť biologicky účinný pre iný živočíšny druh, ktorý sa nachádza nižšie vo vývojovom rade. Napriek tomu,že mechanizmus účinku rastových hormónov nie je dostatočne známy, bolo preukázané, že po podaní rastového hormónu dochádza k urýchleniu rastu, k zvýšeniu hmotnostných prírastkov a k zvýšeniu produkcie mäsa zvierat. Napríklad pri pokuse s priememými prírastkami ošípaných bol priememý prírastok pri dennom injekčnom podávaní čistého rastového hormónu 1,08 kg denne (v porovnaní s prírastkom 1,05 kg u kontrolných zvierat). Dôležitejšia bola skutočnosť, že pokusné zvieratá spotrebovali denne štatisticky význartme menej krmiva ako kontrolné zvieratá (pokusné zvieratá 6,3 kg a kontrolné zvieratá 7,5 kg krmiva denne). Okrem toho bolo možné pozorovať u pokusných zvierat zvýšenú kvalitu karkasu,u pokusných zvierat išlo o dĺžku karkasu 80 cm a luúbku tuku na chrbte 3,7 cm, ale pri kontrolnom pokuse išlo o dlžku karkasu 76 cm a 4,5 cm chrbtového tuku. Chemické zloženie požívateľného mäsa bolo tiež výhodnejšie pri pokusných zvieratách, a to 13,5 proteínov, 49,13 vody a 36, 76 tuku, ale pri kontrolných zvieratách išlo o 10,8 proteínov, 39,43 vody a 49,27tuku, ako bolo opísanć v publikácii EJ. Tunnan,Some Effects of Pituitary Anterior Growth Hormone On Swine, Thesis Purdue University, April 1953.Nanešťastie nie je možné použiť V širokom meradle výsledky pokusov, ktoré boli získané pri použití rastového hormónu ošípaných, pretože nie je k dispozícii dostatočné množstvo tohto hormónu. Pri súčasnom stave sa SGH izoluje z hypofýz ošípaných, čo mamená, že tento zdroj nepokrýva ani zlomok požiadaviek na účinné využitie hormónu.Posledné pokroky molekulárnej biológie umožňujú použiť DNA ako kód pre špecifické proteíny nebakteriálneho pôvodu pri prenesení tohto kódu do bakteriálnych buniek. Všeobecne možno uviesť, že v prípade, ak sa nejde o DNA získanú chemickým spôsobom, konštrukcia rekombinantných molekúl DNA spočíva v tom,že sa najprv získa kópia DNA s jednotlivým reťazcom(cDNA) z templátu RNA (mRNA), kódujúceho výsledný proteín, potom sa cDNA prevedie na DNA s dvojitým reťazcom, cDNA s dvojitým reťazcom sa nadviaže na vhodné miesto v príslušnom klonovacom vektore pri vzniku rekombinantnej molekuly DNA a potom sa vhodný hostiteľ transforrnuje touto rekombinanmou molekulou DNA. Pri pestovaní hostiteľa, transformovaného zhora uvedeným spôsobom je potom možné dosiahnuť expresiu uvedenej sekvencie DNA, a tým i produkciu požadovaného proteínu.Produkcia niektorých proteínov nebakteriálneho pôvodu technológiou s použitím rekombinantnej DNA bola už opísaná . Napríklad V prípade prekurzora rastového hormónu dobytka ide o publikáciu W. L. Miller a ďalší, Molecular Cloning of DNA Complementary to Bovine Growth Hormone mRNA, Joumal Biological Chem., 255, str. 7521 - 24 (1980), európska patentová prihláška č. 476000 a anglická patentová prihláška č. 2 073 245 A. V prípade prekurzora ľudského rastového hormónu ide o publikáciu J. A. Martial a ďalší,Human Growth Hormone Complementary DNA Cloning and Expression In Bacteria, Science 205, str. 602 - 06 (1979) a európska patentová prihláška č. 20 147.Žiadny z uvedených postupov s rekombinantnou DNA sa netýka spôsobu výroby rastového honnónu ošípanej, ani polypeptidov, ktoré sú svojím účinkom tomuto rastovému hormónu podobné, ani zvýšenej produkcie mäsa v prípade, že by bolo možné získať uvedený rastový hormón nebo polypeptid s podobným účinkom vo väčšom množstve, ktoré by mohlo byť priemyselne využiteľné.Riešenie uvedeného problému podľa vynálezu spočíva v izolácii sekvencií DNA, ktoré sú kódom pre SGH alebo polypeptidy, blízke svojím účinkom SGH a v expresii týchto sekvencií v príslušnom hostiteľovi za produkcie polypeptidov, ktore majú biologický účinok,pokiaľ ide o zvýšenie rastu, podobný SGH.Výhodou vynálezu je predovšetkým možnosť získať polypeptidy vykazujúce účinnosť SGH, V komerčných množstvách pre použitie v rôznych aplikáciách na zrýchlenie rastu a zvýšenie produkcie mäsa ošípanej.Ako vyplynie s nasledujúceho textu, sekvencie DNA a rekombínantnć molekuly DNA podľa tohto vynálezu sú schopné riadiť v príslušnom hostiteľovi produkciu rastového hormónu ošípanej alebo polypeptidovpodobných rastovému hormónu ošípanej, t.j. polypeptídov vykazujúcich, pokiaľ ide o zvýšenie rastu, biologický účinok podobný SGH. Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa, po produkcii v hostiteľovi, používajú buďsamé osebe, alebo po ďalšej derivatizácii alebo modifikácii V prostriedkoch alebo spôsoboch na zvýšenie rýchlosti rastu v produkcii mäsa ošípaných.Ako už bolo vysvetlenć, kladným aspektom vynálezu je príprava sekvencie DNA, ktorá je charakteristická tým, že kóduje polypeptid vykazujúci, pokiaľ ide o zvýšenie rastu, biologický účinok SGH. Takýmito sú sekvencie DNA obsahujúce inzerty vybrané zo skupiny zahŕňajúcej DNA inzerty pBR 322 (Pst)/SGH-9 D, pSGH-A 7, pSGH-(Met-Phe), DNA sekvencie, ktoré hybridizujú k uvedeným inzertom, a ktoré kódujú polypeptidy podobne SGH, a DNA sekvencie ktoré, pri expresii kódujú polypepctid, kódovaný tiež pri expresii niektorou z už uvedených sekvencií DNA alebo niektorým z inzertov.Prehľad obrázkov na výkresochNa obr. l je schematicky znázomene jedno z uskutočnení spôsobu podľa vynálezu na výrobu zmesí rekombinantných molekúl DNA, z ktorých niektoré sú charakteristicke inzertmi DNA, ktoré sú kódom pre polypeptidy s účinkom blízkym účinku rastového hormónu ošípanejNa obr. 2 sú schematicky znázomené ďalšie dve uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu, pri ktorých dochádza k selekcii sekvencií DNA v procese skríningu klonov. V prvom prípade sa sekvencia cDNA, príbuzná SGH, podrobuje selekcii hybridizáciou k vzorke z rastoveho hormónu dobytka. V druhom prípade sa používa vzorka, získaná štiepením cDNA, príbuznej SGH.Na obr. 3 je schematicky znázomený spôsob stanovenia nukleotidovej sekvencie DNA sekvencie SGH-9 D podľa vynálezu.Na obr. 4 a 5 je znázomená nukleotidová sekvencia a sekvencia aminokyselín podľa DNA sekvencie SGH-9 D,podľa vynálezu.Na obr. 6 je znázomený čiastkový zoznam reštrikčných miest získaný po počítačovej analýze nukleotidových sekvencií, znázornených na obr. 4 a 5.Obr. 7 je schematickým znázomením jedného uskutočnenia konštrukcie rekombinantnej molekuly DNA pSGH -A 7 podľa vynálezu.Obr. 8 znázorňuje zodpovedajúce nukleotidové a aminokyselinové sekvencie pBGH- A 9(Ser), pSGH -9 D a pSGH -A 7.Obr. 9 až O schematicky znázorňujú jedno z uskutočnení konštrukcie rekombinantnej molekuly DNA pSGH-(Met-Phe) podľa vynálezu.Aby bolo možné úplne porozumieť nasledujúcemu opisu spôsobu podľa vynálezu, je potrebne vysvetliť niektoré menej bežne terminy, ktoré sa budú V opise používaťNukleotid - monomćma jednotka DNA alebo RNA,ktorá pozostáva z cukoru (pentózy), fosfátu a dusíkatej heterocyklickej bázy. Báza sa viaže na cukor cez uhlíkový atóm glykozidu (uhlík ľpentózy). Táto kombinácia bázy a cukru sa nazýva nukleotid. Každý nukleotid je charakterizovaný svojou bázou.Štyri DNA bázy, sú adenín A, guanín G, cytozín C a tymín T. Bázy, ktoré sa vyskytujú v RNA sú A,G, C a uracil U.Sekvencia DNA - lineáme usporiadanie nukleotido 10vé navzájom spojených fosfodicsterovými väzbami medzi atómami uhlíka 3 a 5 susedných pentóz.Kodón - DNA sekvencia troch nukleotidov (triplet),ktorá cez mRNA kóduje aminokyselinu , signálom na začiatok translácie alebo na ukončenie translácie.Napríklad nukleotidové triplety TTA, TTG, CTT,CTC, CTA a CTG sú kódom pre aminokyselinu leucín(Leu), triplety TAG, TAA a TGA sú signály na ukončenie translácie a ATG je signál na začiatok translácie.Čítací rámik - charakteristické zoskupenie kodónov V priebehu translácie mRNA do sekvencie aminokyselín. V priebehu translácie je vlastný čítací rámik tohto zoskupenia nutné zachovávať. Napríklad sekvenciu GCTGGTTGTAAG možno prenášať v troch rôznych čítacích rámikoch alebo fázach, čo vedie k získaniu troch rôznych sekvencií aminokyselínGCT CGT TGT AAG - - - Ala - Gly - Cys - Lys G CTG GTT GTA AG - - - Leu - Val - Val GC TGG TTG TAA G - - - Trp - Leu - (Stop)Polypeptid - lineámy reťazec aminokyselín, ktoré sú medzi sebou navzájom spojené peptidovými väzba.rni medzi or-aminoskupinou jednej aminokyseliny a karboxylovou skupinou susednej aminokyseliny.Genóm - celá DNA bunky alebo vírusu. Zahŕňa okrem iného gény, ktoré kódom pre požadované polypeptidy a sú súčasne operátor, promótor, ribozómovú väzbu a interakčnć sekvencie vrátane sekvencií, ako je Shinc-Dalgamova sekvencia.Gén - sekvencia DNA, ktorá cez svoj templát alebo cez mRNA kóduje sekvenciu aminokyselín charakteristickú pre určitý polypeptid.Transkripcia - spôsob produkcie mRNA z gćnu.Translácia - spôsob produkcie polypeptidu z mRNA.Expresía - proces, ktorý podstupuje sekvencia DNA alebo gén pri produkcii polypeptidu. Ide o kombináciu transkripcie a translácie.Píazmid - nechromozomálna dvojitá sekvencia DNA, ktorá obsahuje intaktný replikón, umožňujúci replikáciu plazmidu v bunke hostiteľa. V prípade, že sa plazmid vloží do bunky jednobunkového hostiteľa,môže dôjsť k zmenám vlastností tohto organizmu a k jeho transformácii v dôsledku prítomnosti DNA plazmidu. Napríklad plazmid, ktorý nesie gén pre odolnosť proti tetracyklínu (TetR) transforrnuje bunku, ktorá bola predtým citlivá na tetracyklín tak, že sa stáva voči tetracyklínu rezistentnou. Bunka transformovaná plazmidom sa nazýva transfonnant.Fág alebo bakteriofág - bakteriäny vírus, niektorý z týchto vírusov obsahujú sekvencie DNA zapuzdrenć v proteínovom obale (kapsid).Klonovací Vektor - plazmid, fág DNA alebo iná sekvencia DNA, ktore sú schopne replikácie v bunke hostiteľa a sú charakteristické jedným miestom alebo malým počtom rozpoznateľných umiestnení endonukleázy, na ktorých je možné sekvencie DNA štiepiť určítým spôsobom bez podstatnej straty základnej biologickej funkcie DNA, napríklad replikácie, produkcie kapsidov alebo promótora, alebo väzbových miest, pričom sekvencia obsahuje markér, ktorý umožňuje jej identifikáciu V transformovaných bunkách, napríklad rezistenciu voči ampicilínu alebo voči tetracyklínu.Klonovanie - spôsob získavania populácie organizmov alebo sekvencií DNA, odvodených od týchto organizmov alebo asexuálnou reprodukciou.Rekombinantná molekula DNA alebo hybridná. DNA molekula je molekula, pozostávajúca zo segmen SK 278336 B 6tov DNA z rôznych genómov, ktoré boli spojené svojimi koncami z vonkajšej strany živých buniek a majú schopnosť infikovať bunky hostíteľa a udržať sa na nich.Sekvencia kontrolujúca expresiu - sekvencia nukleotidov, ktorá kontroluje a reguluje expresiu sekvencií DNA alebo génov v prípade, že je na tieto sekvencie nadviazaná . Obsahuje systémłc, systém trp, hlavné oblasti operátora a promótora fágu h, kontrolnú oblasť kapsidu fd a ďalšie sekvencie, o ktorých je známe, že kontrolujú expresiu gćnov prokaryotických alebo eukaryotických buniek a ich vírusov alebo ich kombinácie.Polypeptid, podobný SGH - polypeptid, ktorý má biologickú účinnosť SGH.Na obr. l je schematicky znázornená jedno uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu. Ide o prípravu zmesi rekombinanmých molekúl DNA, z ktorých niektoré obsahujú inzerty DNA sekvencii, ktoré sú kódom pre SGH alebo polypeptidy podobné SGH.Príprava mRNA rastovćho horrnónu ošipanej (SGR-mRNA) s obsahom poly A RNA4 až 6 g príslušného laloku hypofýzy ošípanej(Pelfreeze, Arkansas), zmrazených suchým ľadom, sa pridá k roztoku s obsahom 5 M guanidíniumtiokyanátu,50 mM citronánu sodného, 0,5 laurylsarkozilátu sodného a 0,1 M B-merkaptoetanolu (10 ml/g žľazy). Postup sa uskutočňuje spôsobom podľa publikácie J.M.Chirgwin a ďalší, Biochemistry 18, str. 5294 až 99Potom sa žľazy nechajú roztopiť pri teplote 4 °C v uvedenom roztoku a homogenizujú sa (Polytron) 6 x 20 sekúnd. Po odstredeníhomogenátu(Sorva 1 l, 6000 otáčok za minútu, 5 minút, izbová teplota) sa 7,0 ml supematantu s obsahom nukleových kyselín navrstvl na 2,5 ml CaCl (5,7 M v 0,1 M EDTA) a vrstva sa prekryje parafínovým olejom. Potom sa skúmavka odstredí (SW 41, 30 000 otáčok za minútu, 18 hodín, 20 °C), čím sa frakcia s obsahom RNA získa vo forme peliet.Po odložení supematantu sa peleta s obsahom celého množstva RNA uvedie znovu do suspenzie vo vode a vodný roztok sa dvakrát extrahuje rovnakým objemom zmesi fenolu a chloroformu v pomere 1 1 a dvakrát rovnakým obsahom éteru. Potom sa RNA vyzráža z vodnej fázy tromi objemami etanolu a výsledná zrazenina sa oddelí ñltráciou. Týmto spôsobom sa získa celkovo 8 mg RNA.4 mg uvedeného materiálu s obsahom všetkej RNA sa znova uvedie do suspenzie v l ml Tris-HCl (10 mM,pH 7,5) s 1 mM EDTA - pufer TE - a roztok sa potom zohrieva na teplotu 65 °C celkom 10 minút. Potom sa pridá ešte 2 M KCl do výslednej koncentrácie 0,5 M a takto získaný materiál sa potom nanesie na stĺpec oligo-dT-celulózy a stĺpec sa premyje 0,5 M KCl na odstránenie všetkých typov ribozomálnych RNA. Nakoniec sa poly A RNA, ktorá bola nadviazaná na stlpec, vymýva 10 mM Tris-HCl s pH 7,5 pri izbovej teplote, frakcie s obsahom poly A RNA sa spoja. Z týchto spojených frakcíí sa potom rovnako získa RNA vyzrážaním etanolom a soľami s následným odštiepením a opätovným suspendovaním vo vode. Týmto spôsobom sa získa poly ARNA v celkovom výťažku 200 g.Aby bolo možné skontrolovať účinnosť takto izolovanej poly A RNA, vykonala sa translácia 2 g tejto poly A RNA in vitro pri použití lyzátu králičích retikulocytov ako S-metionín-bezbunkovćho systému(NEN) podľa publikácie H.R.B. Pelham a RJ. Jackson,Eur. J. Biochem., 67, str. 247 a nasledujúca (1976) a produkt bol sledovaný na SDS/polyakrylamidovom géli autorádiograñcky. Týmto spôsobom možno preukázať,že uvedeným spôsobom izolovaná poly A RNA po translácii vyvoláva produkciu polypeptidov s molekulovou hmotnosťou, ktorá zodpovedá hmotnosti, predpokladanej pre prekurzor rastovćho horrnónu ošípanejle však samozrejme, že takto získaná poly A RNA je ešte zmesou veľkého množstva rôznych typov RNA,ako je zrejmé z priloženého obr. l. S výnimkou mRNA,špecifickej pre SGH alebo pre polypeptidy, podobne SGH, sú tieto typy RNA nežiaducimi kontaminantmi,ako je tiež zrejme z obr. 1. Je nepríjemné, že sa tieto nečistoty správajú v priebehu zvyšnej časti klonovacieho postupu podobne ako SGH-m-RNA. Táto skutočnosť je príčinou toho, že prítomnosť týchto nečistôt v poly A RNA povedie k vzniku veľkého počtu absolútne nepoužiteľných klonov a predstavuje skríningový problém vyselektovať správny klon, t.j. ten, ktorý je kódom pre SGH.Syntéza zmesi cDNA obsahujúcej SGH-cDNAAby bolo možne pripraviť DNA s jediným reťazcom, komplementárnu k získaným rôznym typom poly A RNA, zmieša sa 20 l poly A RNA (10 g v HgO) a 2 l 0,15 M CHgHg a výsledný roztok sa nechá stáť 15 minút pri izbovej teplote. Potom sa k tomuto roztoku pridá 10 l oligo dT (l mg/ml), 100 l dNTP (2,5 mM, t.j. do 0,5 mM konečnej koncentrácie), 20 l ot-nP-dATP (10 mCi/ml), 50 l reverznej transkriptázy(16 jednotiek na l, Life Sciences) a rovnaký objem pufru (100 mM Tris-HCl s pH 8,5, 20 mM MgClg, 140 mM KCl, 50 mM DTT vo vode). Celkový objem výsledného roztoku bol 404,4 l. Potom sa roztok inkubuje 90 minút pri teplote 42 °C, potom sa zahreje na niekoľko minút na teplotu 100 °C a potom sa odstreďuje 5 minút pri 10 000 G. Supematant obsahuje cDNA s jediným reťazcom, ktorá je komplementáma k uvedenej zlskanej poly A RNA. Celkový výťažok tejto cDNA je 1,438 g (cez zrážanie maleho alikvotného množstva kyselinou TCA).Je nutné opäť zdôrazniť, že takto získaná cDNA je komplexnou zmesou veľkého množstva rôznych cDNA, ktoré vznikli transkripciou zo zodpovedajúcich rôznych typov mRNA, ktoré boli prítomné V poly A RNA, ktorá bola zmesou týchto látok, ako je zrejmé z obr. l. Vznik zmesi cDNA komplikujú ešte ďalšie faktory. Ide napríklad o to, že nemusí dôjsť k úplnej transkripcii každého typu mRNA zo zmesí týchto látok V pôvodnej východiskovej poly A RNA. Tým môže dôjsť k tomu, že z každého typu mRNA, pôvodne prítomného v poly A RNA sa môže vytvoriť veľký rad rôznych typov cDNA. Táto skutočnosť na obr. l nie je znázornená . Pretože každá z týchto neúplných cDNA sa správa v priebehu zvyšnej časti celého postupu podobne ako žiadaná cDNA, spôsobuje jej prítomnosť V zmesí cDNA iba ďalšie skomplikovanie izolácie požadovaného klonu.Aby bolo možne získanú cDNA s jednoduchým reťazcom previesť na cDNA s dvojitým reťazcom, zmieša sa polovica získanej cDNA (0,7 mg), 50 l Klenowho fragmentu (0,7 jednotiek / l), 1,5 g MgClz (IM) a rovnaký objem pufru pre DNA-polymerázu (400 mM TrisHCI s pH 6,9, 150 mM KCl, 1 mM dNTP, 20 mM Bmerkaptoetanolu) a zmes sa inkubuje 17 hodín pri teplote 16 °C a potom ešte ďalších 30 minút pri teplote 37 °C. Potom sa DNA vyzráža pridaním 1/8 objemu 2 M octanu sodněho s pH 5,5 a 2,5 objemu etanolu a zmes sa schladí na 15 minút na teplotu -70 °C. Vzniknutá zrazenina sa izoluje odstredením 10 minút pri 10 000 G), získané pelety sa premyjú etanolom a znovu sa uvedú do suspenzie vo vode a nanesú sa na stlpec Sephadexu G-75. Stlpec sa potom vymýva pre získanie DNA pri použití 10 mM Tris-HCl - 0,1 mM HDTA a frakcie, ktoré obsahujú DNA sa spoja. Celkový objem frakcií, ktore obsahujú DNA je 377 l.Potom sa pridá 42 l roztoku 2 M chloridu sodnćho a 500 mM octanu sodného s pH 4,5, 10 mM síranu zinočnatěho a 8 l 81 (1000 jednotiek/ l) (Boehringer,Mannheim) k spojeným frakciám s obsahom DNA a roztok sa nechá stáť 30 minút pri teplote 30 °C. Potom sa zmes extrahuje trikrát rovnakým objemom fenolu a potom éterom a výsledná vodná fáza sa nanesie na stlpec s obsahom Sephadexu TM G-75 a zo stĺpca sa vymýva DNA pri použití 5 mM KCl. Frakcie s obsahom DNA sazlejú a zrážanie sa uskutočňuje etanolom rovnako ako je už uvedené.Pri klonovaní a expresii cDNA s dvojitým reťazcom možno použiť širokú škálu hostiteľov klonovacích vektorov. Okrem toho pri použití každého zo špecifických klonovacích vektorov možno zvoliť rôzne miesta pre inzerciu cDNA s dvojitým reťazcom. Čiastkový výber miest pre klonovanie a expresíu môže ľahko vykonať každý odbomík bez toho, aby sa odchýlil od základných princípov spôsobu podľa vynálezu.Pre počiatočné klonovanie bol zvolený bakteriálny plazmid pBR 322 (P - Bolívar a ďalší, Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II, A Multi-Purpose Cloning System Gene, str. 95 až 113, (1977) J.G. Sutcliffe, pBR 322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence Accurate DNA Size Markets Up To 4361 Nucleotide Pairs Long, Nueleic Acide Research,5, str. 2721-28 (1978), ďalej publikácie, ktoré sa týkajú miesta pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy Pst I, napríklad L. Villa-Komaroff a ďalší A Bacterial Clons Synthesizing Proinsulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,str. 3727-31, (1978) a E. coli Kl 2 MC 106 l M.Casadeban a S.N.Cohen, J. Mol. Biol., 138, str. 179 až 207 (1980).1. Príprava pBR 322 po štiepení Pst I so zakončením dG Plazmid pBR 322 sa zistil dvoma po sebe nasledujúcimi gradientmi CsCl a potom sa podrobil pôsobeniu endonukleázy Pst I pri použití štandardných podmienok,tak ako sú znázomenć na obr. l. Potom sa k plazmidu,rozštiepenému enzýmom Pst I pridá 50 l vody, 3 l DTT (10 mM), 1,5 l dGTP (10 mM), (10 m l želatíny (1 mg/ml), 10 l pufru pre terminálnu transferázu, t.j.10 mM CoClg, 1,4 M kakodylátu draselnćho a 0,3 M TrisHC s pH 7,6 a 0,9 l terminálnej deoxynukleotidyltransferázy (160 jednotiek/ml, Ratcliff Biochemicals). Poinkubácii 13 minút pri teplote 10 °C sa pridá 5 l EDTA (250 mM) a výsledná mes sa extrahuje dvakrát rovnakým objemom zmesi fenolu a chloroformu v pomere l l a trikrát rovnakým objemom ćteru.Vodná fáza sa uchová pre neskoršiu väzbu s cDNA s dvojitým reťazcom so zakončením dC.2. Príprava cDNA so zakončením dCZakončenia dC sa nadviažu na cDNA s dvojitým reťazcom tak, že sa približne l/5(l 0 O ng) získanej cDNA uvedie do suspenzie v 25 l vody, pridá sa 50 l vody, 3 l DTT (10 mM), 1,5 l dCTP (10 mM), 10 l želatíny (1 mg/mM), 10 l pufru pre terminálnu transferázu, t.j. 10 mM CoCll 1,4 M kakodylátu draselného,0,3 M Tris-HCl s pH 7,6 a 0,9 l termiriálnej dezoxynukleotidyltransferázy (160 jednotiek/ml, Ratcliff Biochemicals), ako je uvedené na obr.l. Zmes sa inkubuje celkom 13 minút pri teplote 10 °C a potom sa pridá 5 l EDTA (250 mM) a zmes sa extrahuje dvakrát rovnakým objemom zmesi fenolu a chlorofoimu v pomere l 1 a trikrát rovnakým objemom éteru. Vodná fáza sa opäť uschová pre reakciu s pBR 322 po štiepení PsT a po väzbe zakončení dG.3. Spojenie pBR 322 so zakončením dG a cDNA so zakončením dGl l plazmidu pBR 322 po štiepení Pst I a po nadviazaní zakončení dG (50 ng) a 2,5 l cDNA (1 ng) po nadviazaní zakončení dG sa mieša v 5 l pufru preuskutočnenie tejto reakcie, tj. 1 M chloridu sodného,200 mM Tris-HCl s pH 7,6, 10 mM EDTA, voda do výsledného objemu 50 1. Po zahriatí zmesi na teplotu50 °C na čas 3 minúty a na teplotu 45 °C na čas ďalších 2 hodín sa teplota zmesi nech klesnúť na 4 °C a potom sa zmes necha cez noc stáť.Je nutne opäť zdôrazniť, že iba nepatrnć množstvo rekombinantných molekúl DNA, získaných týmto spôsobom, obsahuje včlenenú cDNA, ktorá je kódom pre SGH, ako je zrejme z obr. l.Uvedený plazmid pBR 322 so ukončením dG a DNA so zakončením dG sa po spojení dialyzujú v koódiových vakoch (UH 100-25) proti l/l 0 uvedeného pufru pre uskutočnenie spojenia medzi oboma zložkami, a to počas 2 hodín pri teplote 4 C na vylúčenie nizkomolekulámyeh látok. Potom sa zmes pridá k 200 l E. coli Kl 2 MCl 061, mikroorganizmus je vopred spracovaný spôsobom podľa publikácie G.N. Buell a ďalší, J . Biol. Chem. 254, str. 927983 (1979).Pretože plazmid pBR 322 obsahuje gén, ktorý je kódom pre odolnosť proti tetracyklínu a gén, ktorý je kódom pre odolnosť proti ampicilínu, ako je zrejme z obr. l, a pretože druhý z uvedených génov je inaktivovaný v pripade, že dôjde k včleneniu cDNA do miesta pre pôsobenie enzýmu Pst I, je možne oddeliť kolónie,ktore boli transformovanć rekombinantnými molekulami DNA s včlenenou cDNA v mieste pôsobenia enzýmu Pst I od kolónií, ktoré týmto spôsobom neboli transformovane (obr. l). Z pôvodného množstva l ng cDNA bolo izolovaných približne 10 000 transformovaných kolónií.Tieto kolónie obsahovali celý rad rekombinantných molekúl DNA, ktoré boli úplnými alebo čiastočnými kópiami zmesi rôznych typov RNA v poly A RNA z obr. 1. Väčšina týchto molekúl však neobsahuje