Analógy 1-deamino-8-D-arginyl-vazopresínu

Opis Technický opis vynálezu0001 Analógy 1-deamino-8-D-arginyl-vazopresinu. Najmä analógy 1 deamino-8-D-arginyI-vazopresínu so substitúciami na pozíciách 4 a 5.(1967). Antídiuretická aktivita tohto peptidu je v danej problematike známa. Pozri Vavra a kol., Lancet, 1 948 (1968). Dezmopresín bol používaný na liečenie nedostatočného vylučovania antidiuretického hormónu (diabetes0003 Hemostatické a protibrinolytické vlastnosti tohto oligopeptidu sú v danej problematike tiež známe. Podávanie dezmopreslnu bolo spojené so zvýšením množstva vplazme faktora VIII zrážanlivosti, Von Vwllebrandovho faktora a plazminogénového aktivátora tkanivového typu. Pozri Mannucci a kol.,Br. J. Haematol., 30 81-93 (1975). Tieto vlastnosti dezmopresínu viedli kjeho aplikácii pri niekoľkých poruchách zrážanlivosti, najmä v priebehu operácií u pacientov s rizikom krvácania. Novšie tiež bolo objavené antitumorové pôsobenie dezmopreslnu. Použitie . tohto oligopeptidu bolo spojené s obmedzením metastatickej kolonizácie do vzdialených orgánov z obiehajúcich rakovinových buniek a inhibíciou vzniku metastáz vmiestnych Iyrnfatických uzlinách po operáciách. Pozri AR P 990100736 EP 1 031 352 US 200220013262 (Alonso a kol.) Alonso a kol., Breasť Cancer Res. Treat., 57 271-275 (1999) Giron a kol., J. Surg. Oncol., 81 38-44 (2002).0004 Existencia analógov dezmopreslnu s biologickými aktivitami rovnými alebo vyššími ako má dezmopresín je v danej problematike tiež známa. Tieto analógy boli odvodené napríklad metyláciou alebo substitúciou jednej aleboviacerých aminokyselín z peptidového reťazca dezmopresinu alebo jeho prekurzoru vazopresínu. Pozri Loukoti, J. Pept, Sci 6(3) 123-9 (2000) Kihlberg a kol., J. Med Chem., 38 (1) 161-9 (1995) Barth a kol., Eur J. Pharmacol., 232(2-3) 223-6 (1993) Barth, J. Recept. Res., 13 (1-4) 305-11 (1993) Lammek a kol., J. Med. Chem., 32 (1) 244-7 (1989) US 4 876 243 (Marshall a kol.). Avšak v doteraz nebola v danej problematike opísaná súčasná substitúcia aminokyselín na pozíciách 4 a 5 peptidového reťazca dezmopresinu súčasnes odstránením disulfidovej väzby medzi poziciami 1 a 6.0005 Predkladaný vynález patentovo nárokuje analógy 1-deamino-8-Darginyl-vazopresínu, ktoré nie sú známe v danej problematike. Niektoré zoligopeptidov opísaných vtomto dokumente vykazujú vysokú schopnosť inhibovať metastázy a migráciu rakovinových buniek. Dve ďalšie výhody oligopeptidov opísaných vtomto dokumente sú ich jednoduchá syntéza a ichrelatívne nízke náklady na výrobu.0006 Oligopeptidy patentovo nárokované podľa predkladaného vynálezu boli syntetizované spôsobom podľa Houghtena (metóda čajových vreciek). Pozri Houghten, Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 82 5131-35 (1985) Houghten a kol., lnt. J. Peptide Protein Res., 27 673-678 (1985) US 5 486 596 (Prochazka a kol.). Použitím spôsobu podla Houghtena bola peptidová syntéza uskutočnená použitím malých poréznych vreciek vyrobených z polypropylénu(čajové vrecká) obsahujúcich aminokyseliny viazané kživici. Vrecká sú ponorené do roztokov obsahujúcich aktivované aminokyseliny, aby sa vyvolalo pripojenie aminokyselín v roztoku k aminokyselinám viazaným kživici. V priebehu tohto kroku procesu boli aminokyseliny viazané k živici premyté a boli z nich odstránené chrániace skupiny, aby sa podporilo ich pripojenie k aktivovaným aminokyselinám v roztoku. Polypropylénové vrecko je Vybraté zroztoku prvej reakcie a ponorené do druhého roztoku obsahujúceho iné aktivované aminokyseliny, aby sa týmto spôsobom zabudovali ďalšie aminokyseliny do peptidového reťazca. Proces je opakovaný niekoľkokrát, abysa získal peptid, ktorý nás zaujíma. Tento postup vrátane jeho variácií je v danej probiematike známy. Pozri Grant, G., editor, Synthetic Peptides (W. H. Freeman Co., New York, 1992) strany 78-142.0007 Podľa predkladaného vynálezu sa patentovo nárokované analógy 1 deamino-8-D-arginyl-vazopresinu vyznačujú tým, že majú disultidovú väzbu medzi Mpa skupinou na pozícii 1 a cysteínom na pozícii 6. Vtýchto prípadoch sa analógy 1-deamino-8-D-arginyI-vazopresľnu vyznačujú všeobecnýmv ktorom X je alanín alebo valín a Y je glutamín.0008 Ako je používané v predkladanom opise, Mpa znamená zvyšok 3 merkaptopropánovej kyseliny vzorca SH-CH 2-CH 2-COOH.0009 Peptidy patentovo nárokované vpredkladanom vynáleze boli syntetizované podľa nasledujúcich uvedených postupov0010 Peptidy boli zostavené použitím živice zmetylbenzhydrylamínu použitím techník Boc/Benzyl podľa nasledujúceho postupu1) Polypropylénové vrecká boli naplnené metyibenzhydrylamínovou živicou. Potom boii vrecká umiestnené do fľaše Nalgene a bol pridaný dichlórmetán,pokiaľ neboli ponorené. Fľaša Nalgene potom bola trepaná počas piatich minút, aby sa živica nasýtila. Dichlórmetánový roztok bol extrahovaný.2) Polypropylénové vrecká z predchádzajúceho kroku boli premyté trikrát dichlórmetánom obsahujúcim 5 díizopropylamínu. Každé premytie trvalo dve minúty. Polypropylénové vrecká boii potom premyté trikrát dichlórmetánom vždy počas 1 minúty, aby sa odstránil nadbytok díizopropylamínu.3) Polypropylénové vrecká z predchádzajúceho kroku boli umiestnené do fľašeNalgene obsahujúcej roztok aminokyseliny, ktorá nás zaujíma, v dichlórmetáne. Potom bolo pridané rovnaké množstvo diizopropylkarbodimidu rozpusteného v dichlórmetáne, aby sa aktivovalo pripojenie rozpustenej aminokyseliny kmetylbenzhydrylamínovej živici. Flaša Nalgenem bola pretrepávaná počas 1 hodiny, pokiaľ reakcia neprebehla.4) Reakčný roztok zpredchádzajúceho kroku bol vyliaty. Polypropylénové vrecká zpredchádzajúceho kroku boli premyté MN-dimetylformamidom dvakrát, vždy počas jednej minúty, aby sa odstránil nadbytok aminokyselín a5) Polypropylénové vrecká zpredchádzajúceho kroku boli premyté dvakrát dichlórmetánom, vždy počas jednej minúty, aby sa odstránil nadbytok N,Ndimetylformamidu. Chrániaca skupina N-a-terc-butyloxykarbonyl (N-a-t-Boc) bola odstránená pomocou kyseliny použitím 55 roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne. Polypropylénové vrecká boli vystavené pôsobeniu kyseliny trifluóroctovej počas 30 minút. Táto reakcia viedla ktrifluóroctovej soli o aminoskupiny.6) Polypropylénové vrecká z predchádzajúceho kroku boli postupne premyté a) dichlórmetánom, jedenkrát počas jednej minúty, b) izopropanolom, dvakrát,vždy počas jednej minúty a c) dichlórmetánom, jedenkrát počas jednej minúty.0011 Predchádzajúci postup bol zopakovaný pre každú jednu z aminokyselín vtakom poradí, aby sa získali analógy dezmopresínu opísané2. Extrakcia 0012 Peptidy zostavené podľa predchádzajúceho postupu boli odštiepenézo živice metylbenzhydrylamínu podla nasledujúceho postupu1) Peptid viazaný k živici z predchádzajúceho postupu bol podrobený pôsobeniu kyseliny fluorovodíkovej za prítomnosti anizolu pri 0 °C počas jednejhodiny, aby sa takýto peptid uvoľnil zo živice.2) Fluorovodíková kyselina z reakčnej zmesi bola odstránená prúdom dusíka pri