Systém CRISPR-CAS a spôsoby modifikácie expresie génových produktov

0001 Predkladaný vynález sa všeobecne týka systémov, spôsobov a kompozícii používaných na kontrolu génovej expresie zahŕňajúcich zacíelenie sekvencie, ako je perturbácia genómu alebo génové editovanie, ktoré môže využívať vektorové systémypríbuzné so zoskupenými pravidelne rozmiestnenými krátkymi palindromickými repetíciami0002 Tento vynález bol uskutočnený za vládnej podpory z NIH Pioneer Award DPI MH 100706 udelenej Národnými zdravotnými ústavmi (National Institutes of Health). Vládamá určité práva na tento vynález. DOTERAJŠÍ STAV TECHNIKY0003 Nedávne pokroky v technikáeh sekvenovania genómu a analytických metódach výrazne zrýchlili schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozmanitou škálou biologických funkcií a chorôb. Technológie presného zacielenia do genómu sú potrebné na to, aby umožnili systematické reverzné inžinierstvo príčínných genetických varíácií tým, že umožnia selektívne zmeny (perturbácíu) jednotlivých genetických elementov,ako aj pokrok v syntetickej biológii a biotechnologických a lekárskych aplikáciách. Aj ked techniky editovania genómu, ako sú napríklad zinkové prsty (designer zinc fingers),efektory podobné transkripčným aktivátorom (TALE) alebo navádzane (homing) meganukleázy sú k dispozícii na produkciu cielených perturbácií genómu, zostáva potreba nových technológií cieleného pozmeňovanía genómu, ktoré sú cenovo dostupné, ľahko nastaviteľné, škálovateľne a prístupné na zacíelenie do viacerých polôh v rámci0004 Existuje naliehavá potreba altematívnych a robustných systémov a technik na zacíelenie sekvencíí so širokou škálou aplikácií. Tento vynález sa zameriava na túto potrebu apatentovej prihláške navzájom zameniteľné) nevyžaduje generovanie upravených proteínov na zacielenie do špecifických sekvencií, ale skôr sa jediný enzým Cas môže naprogramovať krátkou RNA molekulou, aby rozpoznal konkrétny cieľ (target) na DNA, inými slovami enzým Cas sa môže upraviť pre konkrétny cieľ na DNA pri použití uvedenej krátkej RNA molekuly. Pridanie systému CRISPR-Cas do repertoára techník sekvenovania genómu a analytických metód môže výrazne zjednodušiť metodiku a urýchliť schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozmanitou škálou biologických funkcií a chorôb. Ak sa má systém CRISPR-Cas efektívne využívať na editovanie genómu bez škodlivých účinkov,je dôležité pochopiť aspekty inžinierstva a optimalizácie týchto nástrojov upravujúcichgenóm, ktore sú aspektmi nárokovaného vynálezu.0005 Podľa predkladaného vynálezu sa poskytuje skonštruovaný prirodzene sa nevyskytujúci CRISPR-Cas-vektorový systém podľa nároku l. Ďalšie aspekty vynálezu sú opísané v závislých nárokoch. Vynález tiež poskytuje použitie systému podľa nárokov 13 až 15.0006 V jednom aspekte spôsob predkladá spôsob vykonávania zmien alebo modifikácie expresie molekúl DNA kódujúcich jeden alebo viacero génových produktov konštruovaných prirodzene sa nevyskytujúceho CRISPR-Cas systému, ktorý môže zahmovať Cas proteín a jednu alebo viacero vodiacich RNA, ktoré zacieľujú na DNA molekuly, čím táto jedna alebo viacero cieľov vodiaca RNA cieli na genomický lokus DNA molekúl kódujúcich jeden alebo viacero génových produktov a Cas proteín štiepi genomický lokus molekúl DNA kódujúcich tento jeden alebo viacero génových produktov, ktorými je expresia jedného alebo viacerých génových produktov menená alebo modifikovaná a kde sa Cas proteín a vodiaca RNA prirodzene nevyskytujú spoločne. Opis ďalej zahmuje, že sa môže meniť alebo modifikovať expresia dvoch alebo viacerých génových produktov. Vynález ďalej zahmuje, že vodiaca sekvencia RNA zahrnuje vodiacu sekvenciu fúzovanú so sekvenciou tracr. Vo výhodnom uskutočení je bunkou eukaryotická bunka, vo výhodnejšom uskutočnení je bunkou cicavčia bunka a vešte výhodnejšom uskutočnení je cicavčou bunkou ľudská bunka. Vynález tiež zahmuje, že Cas proteín môže obsahovať jeden alebo viacero jadrových lokalizačných sígnálov (NLS(s. V niektorých uskutočneniach je Cas proteín enzymovým systémom typu II CRISPR. V niektorých uskutočneniach je proteínom Cas proteín Cas 9. V niektorých uskutočneniach, proteinom Cas 9 je Cas 9 z S. pneumoniae, Spyrogenes alebo S. thermophilusa môže zahmovať mutovaný Cas 9 odvodený od týchto organizmov. Tento proteín môže byťhomológom alebo ortológom Cas 9. V niektorých uskutočneniach je Cas proteín kodónovo optímalizovaný na expresiu v eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach riadi enzým CRISPR štíepenie jedného alebo dvoch reťazcov V mieste cieľovej sekvencie. V ďalšom aspekte vynálezu je expresia génového produktu znížená a génovým produktom je proteín. Vynález zahmuje zavedenie do bunky prostredníctvom doručovacíeho systému, ktorý môže0007 V ďalšom aspekte sa opisuje spôsob zmeny alebo modifikácia expresie jedného alebo viacerých génových produktov zahmujúci, že sa do bunky obsahujúcej a exprimujúcej molekuly DNA kódujúce jeden alebo viacero génových produktov uvedie skonštruovaný,prirodzene sa nevyskytujúci vektorový systém, ktorý môže zahmovať jeden alebo viacero vektorov obsahujúcich a) prvý regulačný element operatívne napojený na jednu alebo viacero vodiacich RNA sekvencii systému CRISPR-Cas, ktorý hybridizuje s cieľovou sekvenciou v génomovom mieste DNA molekúl kódujúcich tento jeden alebo viacero génových produktov, b) druhý regulačný element operatívne napojený na Cas proteín , kde zložky a) a b) sú umiestnené na rovnakých alebo rôznych vektoroch systému, pričom vodiaca sekvencia RNA cieľa genomického lokusu DNA molekúl kódujúcich jeden alebo viacero génových produktov a proteín Cas štepi génomický lokus molekúl DNA, kódujúcichjeden alebo viacero génových produktov, ktorými je expresia jedného alebo viacerých génových produktov menená alebo modifikované a kde sa Cas proteín a vodiaca sekvencia RNA prirodzene nevyskytujú spoločne. Vynález ďalej zahmuje prípadnú zmenu alebo modifikáciu expresíe dvoch alebo viacerých génových produktov. Vynález ďalej zahrnuje variant, že vodiaca RNA zahmuje vodiacu sekvenciu fúzovanú so sekvenciou tracr. Vo výhodnom uskutočnení je bunkou eukaryotická bunka, vo výhodnejšom uskutočnení je bunkou cicavčia bunka a V ešte výhodnejšom uskutočnení je cicavčou bunkou ľudská bunka. vynález taktiež zahmuje, že vektory systému môžu ďalej zahmovať jeden alebo viacero NLS(s). V niektorých uskutočneniach je proteín Cas enzýmový systém typu II. V niektorých uskutočneniach je Cas proteínom Cas 9 proteín. V niektorých uskutočneniach je Cas 9 proteín S. pneumoniae, S. pyogenes, alebo S. thermophilus Cas 9, a môže zahmovať mutované Cas 9 odvodené z týchto organizmov. Tento proteín môže byt homológom alebo ortológom Cas 9. Vniektorých uskutočneniach je proteín Cas kodónovo Optimalizovaný na expresiu veukaryotických bunkách. V niektorých uskutočneniach riadi Cas proteín štíepenie jedného alebo dvochřeťazcov v mieste cieľovej sekvencie. V ďalšom aspekte vynálezu je expresia génovéhoproduktu znížená a génovým produktom je proteín. Vynález zahmuje zavedenie do bunky prostredníctvom doručovacieho systému, ktorý môže zahmovať vírusové častice, lipozómy, elektroporáciui, mikroinjekciu alebo konjugáciu.0008 Vynález predkladá skonštruovaný prirodzene sa nevyskytujúci vektorový systém, ako je opísaný v nároku 1, ktorý môže zahmovať jeden alebo viacero vektorov zahmujúcich a) prvý regulačný element operatívne napojený najednu alebo viacero vodiacich RNA sekvencii systému CRISPR-Cas, ktorý hybridízuje s Cieľovou sekvenciou v genomickom lokuse DNA molekúl kódujúcich tento jeden alebo viacerých génových produktov, b) druhý regulačný element operatívne napojený na Cas proteín, kde zložky a) a b) sú umiestnené na rovnakých alebo rôznych vektoroch systému, pričom vodiaca sekvencia RNA cieľa génomického lokusu DNA molekúl kódujúcich jeden alebo viacero génových produktov a proteín Cas štiepi génomický lokus molekúl DNA, kódujúcich jeden alebo viacero génových produktov,ktorými je expresia jedného alebo viacerých génových produktov menená alebo modifikované a kde sa Cas proteín a vodiaca sekvencia RNA prirodzene nevyskytujú spoločne. Vynález ďalej zahmuje prípadnú zmenu alebo modifikáciu expresie dvoch alebo viacerých génových produktov. Vynález ďalej zahrnuje, že vodiaca RNA zahrnuje vodiacu sekvenciu fúzovanú so sekvenciou tracr. Vo výhodnom uskutočnení je bunkou eukaryotická bunka, vo výhodnejšom uskutočnení je bunkou cicavčia bunka a v ešte výhodnejšom uskutočnení je cicavčou bunkou ľudská bunka. Vynález taktiež zahmuje variant, že vektory systému môžu ďalej zahmovať jeden alebo viacero NLS(s). V niektorých uskutočneniach je proteín Cas enzýmový systém typu II. V niektorých uskutočneniach je Cas proteínom Cas 9 proteín. V niektorých uskutočneniach je Cas 9 proteín S. pneumoniae, S. pyogenes, alebo S. thermophilus Cas 9, a môže zahmovať mutované Cas 9 odvodené z týchto organizmov. Tento proteín môže byť homológom alebo ortológom Cas 9. V niektorých uskutočneniach je proteín Cas kodónovo optimalízovaný pre expresiu v eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach riadi Cas proteín štiepenie jedného alebo dvoch řeťazcov v mieste cieľovej sekvencie. V ďalšom aspekte vynálezu je expresia génového produktu znížená a génovým produktom je proteín. Vynález zahmuje zavedenie do bunky prostredníctvom doručovacieho systému, ktorý môže zahmovať vírusové častice, lipozómy, elektroporáciu, mikroinjekciu0009 Veštč ďalšom aspekte vynález predkladá skonštruovaný, programovateľný, prirodzene sa nevyskytujúci systém CRISPR-Cas, ktorý môže zahmovať proteín Cas a jednu