Mikroorganizmus čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida, spôsob jeho pestovania a rekombinantná DNA

Vymilez sa týka transfomácie mikroorganizmu čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida a rekombinovanej DNA.Enzým kreatinamidinhydrolaza EC 3,S,3.3 má priemyselné využitie pri stanovení kreatininn. Tento euzým je okrem iného možné využiť pri diagnóza ochorenia obličiek, pri ktorom sa v moči nachádza mnozstvo kreatininu, ktoré sa podstane liłi od množxtiev, ktoré je možné dokámt v moči zdravých jedincov. Sú tiež známe mikroorganizmy, napríklad z čeľade Pseudommna, u ktorých možno indukciou použitím kreatinu vyvolať tvorbu lcieatinamidinhydrolázy v mnobtve, ktoré možno ďalej spracovávať, dosiahnuteľnć výťažky a náklad na izoláciu takto ziskanćho enzýmu však stále ešte predstavuje limitujúci faktor na priemyselné využitie uvedeneho enzýmu.Bolo by teda potrebné najst milcroorganiany, pri pestovaní ktorých by nedochádmlo k vyššie uvedeným nevýhodám a ktoré by produkovali požadovaný enzýmheatinamidinhydmlázu konštitutivne, to jest bez až doteraz nutnej indukcie, čim by tiež bolo možte dosiahnuť podstatne vyššie výsledky ako v pripade použitia až doteraz známychv, ktoré sú schopne uvedený enzým vytvárať. Vynález si kladie m ciel vypestovat pri použití genetického inžinierstva taký mikroorganizmus, u ktoreho by gmetická informacia viedla ku zvýšenej tvorbe vyššie uvedeného enzýmu v mikroorganizme, ktorý je moàić ľahko pestovať,a z ktorého je tiež možné produkovaný enzým izolovaťPodstatu vynález tvorí mikroorganinnus čeľade Escherichia coli alebo Pseudoinonas putida, ktoré ob sahujú plannid pBT 2 a-l, DSM 3 I 48 P alebo pBT 306.16, DSM 3419 a konštitutivne produkuje kreati Podstatu vynálezu tvori tiež rekombittovaná DNA,ktorú obsahuje nasledujúci kódový reťazec báz pre bielkovinu, štiepiaci kreatin s reťazi-nm aminokyselín. | u 4 I I ll llclwllłyrllüswýlnliuząlmnçalaiiisiąuuulnelaaínil il si eccrmnmmcaąmtmoatcmmrtncmxmsscącmn m I Ú I u .uminmuterhzsurmzaiutsnxxeismmrscxispbcuvwrćti 5 ° m mccccmicntąccxcmcxunnrtnąąmmrtcmmw i 60 i | nimi I v lllehtilcsnzlln to l sanmynxgndqnimvnv I M I mmm m a n I u uniimpsiysijciuxurłgąrwgncvąicimxizpinutvniym t N 1 Hcĺĺmwmmçmĺu a. vtom 50. i . o m .hpüpclnhąlspksmłľhzhhlllllcilñlnhlllnłrnbyiłlwgêłn ot wmwnnmłcmcccnceu O m u-.ciyizacinampriamuateucmuam-rwłmilúh-xsłir 14 ° si ncosummmncćcuwmfcąatmfąciąmmfmcccmn 4.10 I lil i-xaumicnuz-muspvummtuacysiemsH-heütlägšě m ccccmcmeuwmiccmcccfrmuufnuiurmica . p 0 m gal 2519 VąlliatllłliqIiSClyHAlgĺlllllliplitcĺyçĺyllüll m mcmmcąccmmmmccmscccccccąicatcatcmgmmmf i I m vm, 15 juhjmlrnpcxąvnpzoclutvmlyiiulllilcnlizxl 1111 x 611 m ciçcmmccmcccaąccąoorttcouąrtmąaxtcćwmiłomcttłf I Im lllclvlurglhllúlmmmñlahphltřlnlalbulpłbrlrpht m Ni GKHG 1 W 1 GCC| 7 D 3 NU IWJTICRmIĽť ĺĺ l) I I D l l i Ill Ijěhěclnserclyľlaurďhrlspclylmislnŕrdľllnmrarçbyrvnl m(I) NGTICüHCCľůlll | Q j Í I ĺ ĺ z) Ajpbnülyuphlucâezbelłiltqükholłllllulůlfřjmłľhllll § 60 lži WIMMCGłĽlMG 430 i | I I I Í lil EmilmrkuêhllulsplirqrsarupłnpäšrlewgltuhpůlIll 13 ° 151 TK ĽĽ 1 KÍCG 2 ĽÉICCKCECIU 5124 x 2310 H 0 O I I I i | H) AIIVIlGlil/ullirtllłhñlykulyrlaulltląlłrdllyłlahfyrsarłrp G 0 il leroramm KMECCCMNĽGCGHKNCQT W a o u o c v N lIMLhýllhlhůllllIPhIlAIluyIIiIAIpłVIlMK-imrłlmľřil 320 INłIüNXťľlľ ll I l | | I ĺ 321 G młflyěliútrüłĺšlmrkihľlĺlłfmülflłçůlülllůlt/LĽ-Iün 340 351 WFÄNGCCMXCTÍGUŠIÄIÍĚĽĚĽCÄCĚKĽILŘĽWÍBÄEĽÍGGGŤNM 1 D I Q ł Í V O m mkzgůlusptehmrvallnñlnłtoclytlcwrlllalserľgtclnłmltut m 1 mmcuofmmummmwmwćlľmmüůwmm. Q f su I 1 mLnłrocluclymrrcclfĺmlmmľkfĺlllĺüľřĺťäłě 19 HC., . r o f m nmmimnciynicmsnunxrysnurmnñlrłtoől 1 mm lg nu m mQ e v 0alebo jeho ekvivalent, ktorý je podľa genetického kódu kódovým reťazeom pre rovnaký reťazec aminokyselín.Táto rekombinovaná DNA je výhodne vo forme plazmidu pBT 2 a-l, DSM 3418 alebo pBT 306.16,DSM 34 l 9 P.Mikroorgartizmus s obsahom vyššie uvedeného plazmidu je schopný produkovať kreatlnanridlnhydrolázu v množstve, ktoré sa rovná 50 celkového nmožxtva bielkovín, ktoré je vyššie uvedeným mikroorganizmom vytvárané.Vyššie uvedené mikroorganizmy a tiež zodpovedajúce plazmidy možno ñskat podľa zásad genetického inänierstva. Pri získavaní mikroorganizmov, ktoré konštitutívne vytvárajú kreatinamidínhydrolázu, je teda možné postupovať napriklad tak, že sa DNA z Pseudomonas putidaa) čiastočne štiepi enzýmom EcoRI m vzniku fragmentu s 5,8 kilobázarrli, alebo sab) štiepi enzýmami EcoRI s Pvul n vzniku fragmentu s 2,2 kilobázami,fragrnent, úskaný spôsobom a) alebo b) sa potom klonuje za použitia vcktora, rozštiepenćho rovnakou reštrikčnou endonukleaznu, ziskaným materiálom sa transformuje vhodný kmeň Escherichia coli alebo Pseudomonas putida a izolujů sa kmene, ktoré kmštitutivne vytvárajú kreatínarnidinhydrolàm. Pod pojmom kilobàza sa rommie v tejto prihláška tisic párov nukleotidových búz.Infonnácia pre expresiu kreatínamidlnhydmlázy sa nachádza na fragmente s dĺžkou 5,8 kilobáz a na podfragmente s dĺžkou 2,2 kílnbáz, ktoré možno získat Štiepením pôsobením enzýrnu EcoRI alebo spoločným pôsobením enzýmov EeoRI a Pvull. Vyššie uvedené tragmen Sty sa podrobia klonovaniu známym spôsobom za použitia vektora, ktorý je rozštiepe-ný tou istou reštrikčnou endonukleázou tak, aby boli získané ukončenia, ktoré možno vzájomne opäť naviamť. Možno tiež postupovať tak, že sa rozštiepia vektory, vhodné na použitie pre čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida inými reštrikčnými endonuklećmmi tak, že pri vhodnom usporíadanl miest na štiepenie je zachovaná schopnosť replikácie pre Vektor, doplnený niektorým z vyššie uvedených fragmentov a uložený do uvedeného miesta po štiepeni inými endonukleázami i schopnosť transformácie vyššie uvedených čeľadl mikroorganizmov týmito vektormi. Ako Vektor sa výhodne použije plazmid pBR 322, transfonnovaný včlenenlm niektorého z dvoch vyššie uvedených fragmentov a zavedený do vhodného kmeňa Escherichia coli. Každý odbomlk môže uviesť celý rad kmeňov E. ooli, ktoré sú vhodné na transformáciu plaznidom pBR 322 a jeho derivátmi. Ďalším výhodným vektorom na toto použitie je fág Charon 10. Plazmid pBR 322 a jeho deriváty sa rovnako ako ďalšie vhodné vektory dnes už bežne dodávajú.Menej výhodný je spôsob, pri ktorom sa plazmid pBR 322 roůtiepi pôsobením enzýmu EcoRI a Pvull,takto vzniknutý fragment s 2,3 kilobazami sa izoluje a spojl sa s ůagmentom s 2,2 kilobázami z P. putida po štiepenl enzýmami EooRl a PvuIl za vmiku nového plaznidu, omačovanélro pBT 3-2, ktorý sa potom použije na transfonnáciu vhodného kmeňa E. coli. Týmto spôsobom sa získa kmeň E. ooli Kl 2 ED 8654 DSM 3144.Kmene E. coli, získané vyššie uvedeným spôsobom transfonnáciou derivátom plazrnidu, odvodenćho odplazmidu pBR 322 možno veľmi ľahko podrobiť selekcii na zaklade ich rezistencie proti ampicilínu Vzhľadom na to, že dskané kmene sú odolné proti ampicilínu a súčasne vytvárajú enzýrn kreatínarnidinhydrolazu, nemôbr netransformované btmky rásť a medzi rastúcimi bunkami sa spôsobom, ktorý bude ďalej podrobne oplsaný,ľahko nájdu tie bunky, ktoré produkujú požadovaný enzym.Zvlášť dobré výsledky možno spôsobom podľa vynálezn získať tak, že sa na bunky, Vybraté z vhodného kmeňa E. coli s obsahom plannidu pBT 3-2 pósoblv období amplifikácie plazmidu nitromguanidínom, potom sa plazmid izoluje, znovu sa transformujú bunky E. coli,cyklus sa prípadne opakuje a z takto získaných klonov s vyjadrenou tvorbou kreatínamidinhydrolázy sa izoluje plazmid BT 2 a-1, DSM 31489, ktoreho spôsob výroby je tiež predmetom vynálecu. Ako už bolo uvedené vyššie, produkujú bunky Escherichia coli, transformované vyššie uvedeným plazrnidom kreatínamidínhydrolam v množstve, ktoré zodpovedá S 0 celkového množstva bielkovín, produkovaného týmito bankami.Vmiknutć klony mikroorganizmov je možné identifikovať ako kmene. produkujúce vysoké množstvo kreatínamidínhydrolázy tak, že sa tieto klony privedú do styku s agarózovými pladíami, ktoré obsahujú kreatín, sarkozinoxinázu, peroxidázu a farebný indikátor na dôkaz peroxidu vodíka. Jednotlivé klony je v tomto systéme možné identifikovať podľa silného sfarbcnia, ktoré zodpovedá vysokej tvorbe enzýmu. Ako indikatorový systém pre peroxid vodíka sa výhodne použije 4-aminoantipyrín v kombinácii s N-etyl-N-(sulfoetylyłmetylalanínovou soľou, výhodne vo fomie draselnej soli.Pri použití spôsobu podľa vynalezu je tiež možné skonštruovať plazmidy, ktoré sú vhodné nielen na expresiu v mikroorganizmoch E. coli, ale tiež v mikroorganinnoch P. putida. Výhodne sa postupuje tak, že sa z plazmidu pBT 2 a-1 získa štiepením reštrikčnou endonukleázouPvulaPvullfragrnentsLkkilobanmia tento fragment sa naviaže na ďalší tragment s 10 kilobázarni, získaný z plannidu pBT 306.1 štiepením enzýmamiPvuIaSmaI. Týmto spôsobomsaziskaplannid pBT 306.16, DSM 3149 P, ktorý vyvoláva konštitutívnu tvorbu kreatínamidínhydrolazy ako u mikroorganizmovJe prekvapujúce, že spôsobom podľa vynáleau je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie tvorby enzýmn Už niekoľkokrát bolo síce oznámená, že zvýšením počtu kópií určitého génu možno dosiahnuť zvýšenú expresiu tohto géuu. Z toho však nebolo možné predpokladať, že ipriprenesení génuzčeľadePseudomonasdočeľadeE. coli bude pravdepodobne možné dosialmuť vyššiu expresiu génu. V skutočnosti boli podávané správy o tom,že pri prenesení nových génových kombinácii z čeľade Pseudomonas do čeľade E. coli došlo k zníženiu expresic génu, ako bolo uvedené napríklad v publikaciach B. Stanisisch a J. Oril 7, I. Gen. Mierobiol. 1976, 94, str. 281-289, Nakazawa a ďalší, J. Bacteriol. 1978, 134, str. 270-277, Ribbons a ďalší, Soc. Gen. Microbiol. Quart. 1978, 6, str. 24-25 a Franklin a ďalší, Microbiological Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger Cook, Htltter und Nuesch Hrsgb., 1981,109-130. Skutočnosť, že nebolo možné očakávať zlepšenie uvedeného typu je moďné doložiť prehľadom najrôznejších niekoľkostupňových syntćz, na konci ktorých sa äska enzymatícky účinná bielkovina.Informácia na vmik bielkoviny je uložená v dezoxyribonukleovej kyseline (DNA). Táto DNA sa prevádzapôsobením RNA-polymerúzy na mRNA. Takto syntetimvaná mRNA sa v ribozomoch prevádza na bielkovinu, pričom vždy tri nukleotidy (triplet alebo kodón) sú podľa usporiadania genetického kódu kľúčom na tvorbu jednej určitej aminokyseliny.Riadiace oblasti na úrovni DNA určujú, na ktorom mieste sa začne reťazec DNA prevádzať na mRNA(sled promotora) a tiež na ktorom mieste sa syntém mRNA nastaví (terminačný sled).Sledy pre začiatok a pre ukončenie sa nachádzajú tiež na úrovni syntézy bielkovín (mnslácia). Všeobecne moňno uviesť, že kodůn ATC (ktorý sa prevádza na f-metionin) mamena mčiatok bielkoviny a napriklad kodóny TAA alebo TAC znamenajú terminačný kodón pre ukončenie translacie.Miera expreaie polypeptidového sledu závisí od celého radu faktorov, okrem iného aj od kvality sledu promóton, stálosti mRNA, sekundárnej a terciárnej štruktúry mRNA, kvality miesta vttzby na ribozóm,odstup miesta väzby na ribozóm od kodónu pre ničiatok translácie (ATG), od sledu nukleotidov medzi miestom vazby na ribozóm a medzi kodónom pre učiatok translácie (ATG) a medzi signálom pre ukončenie translacie na úrovni transkripcie aj translacie. Bez presnejmalostiprimámejštruktúrygćnuaštruktúry bielkoviny, pre ktorú je gén kódom, nie je možné cielene msialmuť do vyššie opísaných riadiacich procesov expresie gćnu. Pretože tieto presné vedomosti neboli v danom prípade k dispodcii, nebolo možné predpokladať ani vyšší výťažok syntézy pri použití vyššie uvedených míkroorganizmov a plannidov, získaných spôsobom podľa vynalezu.Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa ako kmeň Escherichia coli použije výhodne E. coli K 12, a to najmłtE. coli K 12, w 3 so (thi, galK, 3 m, rpsl, 12 Tiollais, DSM 3141), E. coli (12. ED 8 654 (trp R, hsdMÄ hsd R, sup E, sup F, K. Muľľlyl, DSM 2 102), E. coli Kl 2, CSH 1 (thi, trp, lac L rpsl zbierka mikroorganizmov Cold Spring Harbor, DSM 3 142).Z. kmeňov Pseudomonas putida je možné použiť izoláty divých kmeňov aj lonene laboratóriu. Zvlášť dobré výsledky je možné dosiahnuť pri použití Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981,237-247).Ako vektorové systémy pre expresiu v E. coli sa pri uskutočñovaní spôsobu podľa vynálezu výhodne používajú genetickou manipuláciou získané deriváty bežne dodávaného plazmidu pBR 322 (Gene 1977, 95-1 l 3). Pre expresiu v kmeňoch Pseudomonas sa výhodne používajú geneticky pomreriené deriváty plazmidu pRSF 1010 (Gene 1981, 237-247). Pri použití vyššie uvedených reštrikčných mdonukleaz na konštrukciu geneticky pozmenených plannidov podľa vynálem sa získajú úseky génu, ktoré sú kódom pre kreatínamidlnhydrolám a obsahujú ešte systémy pre expresiu vektora, riadiaci system pre začiatok translacie v cieľovej bunke a gén, podľa ktorého je mobié výsledné mikroorganizmy ľahko podrobiť selekcii, napriklad gén pre odolnosť proti antibiotikám.vynález bude ďalej opísaný v súvislosti s priloženýmiPrehľad obrázkov na výkresochNa obr. 1 je sehematicky znázornená konštrukcia plaanidu pBT 3-2 pri použití üagmentu s veľkosťou 2,2 kilobáz z DNA Pseudornonas putida a plazmidu pBR 322 ako východiskových materiálov pre túto konštrukcru.Na obr. 2 je znázornená konštrukcia plazmidu pBT 306.1 zplaznidu RS 1 010 a pACYC 177 spôsobom podľa vynálezu.Na obr. 3 je mázomená konštrukcia plannidu pBT 306.16 z plazrnidu pBT 306.1 a pBT 2 a-l spôsobom podľa vynálezu.Na obr. 4 je znázornený výsledok nanesenia bunkoveho extraktu na SDS gel, a toStlpec 1 .- východiskový kmeň Pseudornonas putida stlpec 2 cieľový vytržiteľný kmeň E. coli ED, ktorý nesie plazmid pBT 2 a-l.Na obr. 5 je mázomeny sled DNA, ktorý je kódom pre enzým kreatinanridínhydrolázu a bielkovinový sled.,ktorý je výsledkom použitia vyššie uvedeného sledu DNA.Aby bolo možne nájsť pozitívne klony, to znamená klony, ktoré konštitutívne produkujú kreatinamidinhydrolázu, je možné pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu použiť zvláštny triediaci system, ktoreho princípom je imunologický test na enzým. Pri trskutočňovaní tohto postupu sa ľrxujú na vhodný nosič, napríklad na polyvinylovů fóliu, špecifické protilátky proti kreatínamidinhydroláze, fólia sa priloži na rozrušenć kolónie alebo tiež na plaky. Po premytl vodou sa fólia inkubuje s tou istou špeciiickou protilátkou vo forme enzymatickćho koujugátu napríklad s peroxidázou V prípade, že je prítorrmy klon produkujúci enzýrn, vmiká uavrstvenie antigénu-protilátky a enzymaticky značenej protilátky.Konjugát protilátky a pemxidázy poskytuje vo vhodnom systéme s obsahom farebného indikátor sfarbenie,napríklad pri použití indikátoroveho systemu s obsahom tetrametylbenzidinu, dioktylsulfojantaranu sodnćho a peroxidu vodíka v želatíne zeleno sfarbene škvrny. Rozsah stanoviteľnéłm množstva pri použití tohto systemu je 10 až 100 pg antigénu bielkovinovej povahy. Systém tohto typu možno vytvoriť na základe poznatkov, ktoré sú uvedenie v publikácii Testkombination Genexpression Boeliringer Marmheim GmbH.vynález bude osvetlený nasledujúcim príklodmi.DNA z chromozómov kmeňa Pseudomonas putida DSM 2106 sa po rouušeni buniek izoluje a po dvojnásobnej fenolizácii a po vyzrážanl etanolorn sa rozpustl na koncentráciu 600 ug/rnl (Cosloy a Oisni, Molec. Gen. Genet, 1973, 124, 1-l 0).10 chromozomálnej DNA sa čiastočne štiepi pôsobením piatich jednotiek reštrikčnej endonukleázy EcoRI, E.C. 3.1.2111 počas 30 minút a mieru štieperlia sa sleduje na agarózovom geli.B) Izolácia a čistenie DNA z fágu lambda Charon 10.10 baktérií kmeňa E. ooli ED DSM 2 102 sa inkubuje s 5 x 10 fágu lambda Charon 10 počas 20 minút pri tepIoteJTCapOtomsamiesnecháráSťaždozačiatku ljhy buniek pri použití 500 rnl živnćho prostredia s dostatočným množstvom živín. Izolácia fágu a DNA sa potom uskutočňuje presne podľa návodu, ktorý je uvedený v publikácii Maniatisu a ďalších Molecular cloning, Cold Spring Hnrbor Laboratory,l 982,76-85.O ug DNA fágu Charun 10 sa úplne rozštiepi pôsobením reštrikčnej endonukleázy EeoRI. Potom sa spoločne inkubuje 1 čiastočne mzštiepenej DNA z cluomozómov Pseudomonas putida (odstavec A), 3 g DNA fágu Charon 10, roútiepene enzýmom EcoRI a 40 jednotiek enzýmu T 4 DNA ligázy. Uloženie naviazaných fmgmentov DNA do prednej a mduej časti bielkoviny fágu lambda možno uskutočniť in vitro. Výroba bielkovín, potrebných na tento účel a uloženie DNA je podrobne opísanć v publikácii Maniatisa a ďalších, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 256-291 (in vitro systémy pre DNA fágu lambda sa obchodne dodávajú - napríklad Boehringer Manheirn, DNA-Packing Kit). Približne 0,5 g m. kanćho produktu a DNA z Pseudomonas putida sa inkubuje s 20 1 systému, uskanćho in vitro, po 60 minútach sa pridá 0,5 ml putłu SE (Manialis a ďalší,Cold Spring Harbor Iaboratory 1932, 443) a moc objemu (2,5 l) systemu, získanćho in vitro s 200 l cez noc pestovanej kultúry kmeňa m (v 102 M síranu horečnatého) počas 10 minút pri teplote 37 °C. Suspenzia baktérií sa potom mieša s 3 ml LB (Miller,Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433), 0,6 Vo agarózy a nnes sa vleje na platne LB. Na l pouätej DNA sa získa približne 105 plakov.Na identifikáciu fágov, ktore obsahujú gén pre kreatinázu sa použije vyššie uvedený imunologický test na prítomnost enzýrnu. lndikátomvý systém sa skladá z 6 mglml tetrametylbenádínu, 20 rnglml dioktylsulfojantaranu sodného a 0,0 l 56 peroxidu vodíka v 6 želaline. Na 1000 plakov bolo možne preukázať dvaC) Reklonovanie genu pre kreatinám pri použití E. coli.Z piatich plakov, ktoré bolí dokánne ako poúllvne pri vyššie uvedenom irnunologickom teste bola izolovaná DNA tohto fágu. Plť matiek takto zlskanej DNA bolo rozštiepených pôsobením reštrikčného enzýrnu E-eoRI a okrem rôznych pásov bolo možné vo všetkých piatich vzorkách DNA dokánť spoločný pás pre DNA s veľkosťou 5,8 kilobáz. Tento fragment bol charakterizovaný pomocou štiepenia niekoľkými rômymj reš endonukleázami, ako je mázlornené na obr. l.Z približne 5 tohto ůagmentu, zlskaného štiepením enzýrnom EooRI sa odstiepi pôsobením enzýrnu Pvu 1 I liagment s veľkosťou 2,2 kilobáz. Vzniknuté fragmenty DNA sa delia na agarozovom géli s nízkou teplotou topenia a izoluje sa ůagment s 2,2 kilobázanri- Eco RI-Pvu II. Pri izolácii uvedeného fragmentu DNA z agarozoveho gélu sa postupuje tak, že sa zodpovedajúce pásy vyrežú, prenesú do reakčnej sklenenej nádoby (Eppen-dorfovej skúmavky) a zmiešajú s pribliàie dvojnásobným množstvom vody. Potom sa zmes inkubuje tuk dlho pri teplote 65 C, až dôjde k mzpusteniu agarozy (5 až 10 minút), vzorka sa krátko pretre