Nový spôsob prípravy G-CSF (granulocytové kolónie stimulujúci faktor)

0001 Tento vynález sa týka nového spôsobu izolovania a puritikovania granulocytové kolónie stimulujúceho faktora (G-CSF - granulocyte colony stimulating factor) z mikroorganizmu produkujúceho G-CSF, špecifickejšie je G-CSF rekombinantný metionylový humánny G-CSF (rmetHuGCSF).0002 Granulocytové kolónie stimulujúci faktor (G-CSF) je protein 175 aminokyselín vyrábaný technológiou rekombinantnej DNA. G-CSF produkujú baktérie Escherichia coli (E. coli), do ktorých sa vložil gén stimulujúci granulocytové kolónie. Protein má sekvenciu aminokyselín, ktorá je totožná s prirodzenou sekvenciou predikovanou z analýzy sekvencie humánnej DNA, s výnimkou pridania metioninu N-konca nevyhnutného na expresiu v E. coli. Pretože G-CSF sa produkuje v E. coli,produkt je neglykosylátovaný a preto sa líši od G-CSF izolovaného z ľudskej bunky.0003 G-CSF sa dodáva bud v Iiekovkách, alebo v naplnených striekačkách. Produkt je dostupný v jednorazových Iiekovkách a naplnených striekačkách. Jednorazové Iiekovky obsahujú bud 300 g alebo 480 g G-CSF pri plniacom objeme 1,0 ml resp. 1,6 ml. Jednorazové naplnené striekačky obsahujú bud 300 g alebo 480 g G-CSF pri plniacom objeme 0,5 ml resp. 0,8 ml.0004 Sekvencia aminokyselín humánneho G-CSF je zobrazená na obrázku 1. Prvá aminokyselina zrelého proteínu sa určila priamym sekvenovanim aminokyselín purifikovaných proteínov. mRNA humánneho G-CSF kódujú hydrofóbnu vedúcu sekvenciu 30 aminokyselín typickej pre sekrétované proteíny. G-CSF má dve disulfidové väzby vytvorené homológnymi cysteínovými reziduami (obrázok 1) a ďalšie cysteínové reziduum v pozícii 17, ktoré sa nemôže zúčastnil na vnútrobunkových disulñdových väzbách. Disulfidové väzby v týchto molekulách stabilizujú štruktúry a robia ich odolnými voči relatívne drsnému zaobchádzaniu (niektoré proteázy, vysoké teploty,denatúračné rozpúšťadlá, extrémne pH), ktoré vedú k denaturácii po redukcii disulñdových väzieb(Nicos A. Nicola, The Walter and Elíza Hall Institute of Medical Research, Granulocyte Colony Stimulating Factor (Granulocytové kolónie stimulujúci faktor), s. 77-100).0005 Humánny G-CSF možno produkovať v eukaryotických organizmoch (bunkové línie kvasiniek a cicavcov) a prokaryotických organizmoch ako sú baktérie. Forma, ktorou sa G-CSF produkuje,závisí od typu hostitelského organizmu použitého na expresiu. Ak sa G-CSF exprimuje v eukaryotických bunkách, produkuje sa v rozpustnej forme a sekrétuje. Keď sa G-CSF produkuje v prokaryotických bunkách, produkt sa vytvorí ako neaktívne inklúzne telieska (IB - inclusion body). Normálne inklúzne telieska majú sekundárnu štruktúru a sú husto agregované. Odhalilo sa, že kombináciu takýchto mnohých faktorov fyziologického stavu hostítelskej bunky a rastových podmienok ovplyvňuje tvorba inklúznych teliesok.0006 G-CSF produkovaný v prokaryotických bunkách, ako sú bunky E. coli, je v inklúznych telieskach. inklúzne telieska sú jadrové alebo cytoplazmatické agregáty farbiteľných látok, zvyčajne proteínov. Purifikácia exprimovaných proteínov z inklúznych teliesok si zvyčajne vyžaduje dva hlavné kroky extrakcia inklúznych teliesok z baktérií, za ktorou nasleduje solubilizàcia puriñkovaných inklúznych teliesok.0007 Produkcia proteínu biologicky aktívneho humánneho G-CSF z neaktivnych inklúznych teliesok exprimovaných technológiou rDNA v obvykle používaných prokaryotických hostiteľských bunkách je velmi ťažká. Žiaduce sú efektívne procesné metodiky na výrobu terapeuticky užitočného G-CSF v priemyselnom meradle. Vo vedeckej literatúre sa uvádzajú rôzne metódy na produkciu G-CSF v bunkách E. coli, kvasníc alebo v cicavčich bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO). 0008 Mnohé patenty opisujú rôzne hladiska exprimovania a purifikácie proteínu G-CSF z rôznych expresných systémov, ako sú prokaryotické a eukaryotické bunky. Expresia G-CSF v bakteriálnych systémoch je opisaná v US 4,810,643 (03.03.1986, Kirin-Amgen lnc.) a US 4,999,291 (23.08.1985,Amgen lnc.). Vo výhodných spôsoboch sa gén G-CSF syntetizuje, klonuje a transformuje do E. coli. Protein sa exprimuje vyvolanim kultivácie zvýšením teploty do 42 °C. Podmienky a parametre klonovania a exprimovania fermentàciou nie sú jasné. V konštrukcii klonov je zapojených množstvo krokov. Spôsob sa vykonáva v podmienkach banky a úroveň exprimovania proteínov je len 3 až 5 °/o na báze celkového bunkového proteínu.-2 0009 Farmaceutický produkt s názvom NUPOGEN obsahuje protein 175 aminokyselín vyrábaný technológiou rekombinantnej DNA. informácie o produkte, ktoré sa dajú vyhľadať na webovej stránke htt //dailvmed.nIm.nih.aov/dail med/archives/fdaDruaInfo.cfmarchiveid 10056, uvádzajú,že NEUPOGEN produkujú baktérie Escherichia coli (E. coli), do ktorých sa inzertoval humánny gén granulocytové kolónie stimulujúceho faktoru. Formulácia produktu obsahuje filgrastím, acetát,sorbitol, polysorbát 80, sodík a vodu vo forme vhodnej pre vnútrožilové a podkožne podávanie. 0010 WO 2008/096370-A 2 opisuje spôsob izolovania a purifikovania proteínu G-CSF z E. coli produkujúcich G-CSF, zahŕňajúci Iýzovanie mikroorganizmov a separovanie G-CSF, izolovanie inklúznych teliesok obsahujúcich G-CSF, solubilizovanie G-CSF koncentrovaným chaotropným činidlom a redukčným činidlom, akým je di-tiotreitol (DTT), oxidovanie G-CSF, opätovné zvinutie jeho reťazca - jeho koncentrovanie a odsoľovanie, jeho podrobenie lonexovej chromatografii a regenerovanie purifikovaného G-CSF v stabilnej forme.0011 Getz E. B a kol. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry (Porovnanie medzi sulfhydrylovými redukčnými čínidlami tris(2-karboxyetyl)fosfin adi-tiotreitol pre použitie v biochémii proteínov) Analytical Biochemistry 15. aug. 1999 LNKD-PUBMED 10452801, zv. 273, č. 1, strany 73-80 prezentujú porovnanie medzi di-tiotreitolom (DTT) a tris(2-karboxyetyI)fosfínom (TCEP) vzhľadom na (1) stabilitu pri neutrálnom pH, (2) schopnost zachovať enzymatickú aktivitu, (3) interferenciu pridaním značiek k proteínovým tiolom, (4) redukciu sond nitroxidového spinu a (5) schopnosť pôsobiť nechcenú degradàciu proteínu pri zvýšených teplotách použitých v prípravkoch gélovej elektroforézy. TCEP však nie je navrhovaný na zvýšenie výťažku spôsobu účinným rozbitím disulñdových väzieb aktivitou rozvinutia reťazca v procedúre, napríklad na produkciu granulocytové kolónie stimulujúceho faktoru (G-CSF).0012 EP 0 220 520 (30.09.1985, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha), W 0 87/01132 (23.08.1985,Kirin-Amgen lnc.) a W 0 88/01297 (11.08.1986, Cetus Corporation) opisujú klonovanie G-CSF. 0013 US 5,055,555 (05.01.1989, Sassenfeld, Helmut) opisuje zjednodušený spôsob produkcie humánneho G-CSF z eukaryotických buniek. Dosiahnutie sekrécie proteínov extracelulárnymi eukaryotíckými organizmami vytvára úplne odlišnú technológiu v porovnaní s expresiou proteínov intracelulárnymi prokaryotickými organizmami. Hoci opis opísaný v US 5,055,555 je jednoduchší,nedá sa lahko aplikovať na rekombinantný G-CSF exprimovaný v E. coli alebo iných bunkách, kde sa G-CSF produkuje vo forme inklúzneho telieska. Vyššie uvedená metóda sa vyvinula pre rozpustný G-CSF exprimovaný a sekrétovaný rekombinantnými kvasnicami do fermentačného média. Pre G-CSF odvodený z E. coli, solubilizácia inklúznych teliesok a opätovné zvinutie reťazca G-CSF sú dodatočné kroky, ktoré sa musia brat do úvahy. Okrem toho, získanie prípravku G-CSF terapeutickej čistoty bez lipopolysacharidových endotoxinov, ktoré sú pravdepodobne kontaminantmi, keď sa E. coli používa ako hostitel, sa dosiaľ neuvádza v jednoduchej rozšíritelnej procedúre. V komerčnej mierke straty výťažku z viackrokového spôsobu sa stávajú nanajvýš významnými. Preto zjednodušená procedúra s menej krokmi dá vyššie výťažky za kratší čas okrem toho, že je hospodárna.0014 Produkcia rekombinantných terapeutických proteínov pomocou Escherichia coli, ako hostiteľského systému, je priechodná, ak možno ustanoviť jednoduchý a nákladovo efektívny poprúdny spôsob. Vysokoúrovňová expresia eukaryotických proteínov v E. coli často vedie k tvorbe nerozpustných inklúznych teliesok v cytoplazme. Tvorba inklúznych teliesok môže nastať ako následok intracelulárneho nahromadenia foriem čiastočne nerozvinutého reťazca rekombinantného proteínu. Vlastnosti proteínu, ako je priemerný náboj, frakcia rezíduí tvoriacich otočky, frakcie cysteínu a prolínu, hydrofilnost a celkový počet rezídui koreluje s tvorbou inklúznych teliesok. Kultivačné podmienky ako je teplota pH ako prívod živín, hrajú dôležitú úlohu pri regulovaní delenia rekombinantného proteínu na rozpustnú a nerozpustnú trakciu. Často je ťažké regenerovat protein z inklúznych teliesok kvôli problémom súvisiacich s počiatočnými krokmi regenerácie, solubilizácia a denaturácie.0015 Rôzne purifikačné protokoly preberane vo vyššie spomenutých patentoch znamenajú viaceré chromatograñcké a iné kroky pre purifikovaníe G-CSF. Žiadny z vyššie súvisiacich patentov neuvádza ekonomický a komerčne jednoduchší spôsob produkcie G-CSF v komerčne uskutočniteľnej mierke, ktorá garantuje stabilitu produktu získaného spôsobom. Spôsoby opísané v doterajšom stave techniky sú komplikované, zdĺhavé ajednotkové náklady sú vysoké.0016 Preto na prekonanie hlavných problémov, súvisiacich s výrobou G-CSF, sa teraz v tomto vynálezu vyvinul a zverejnil jednoduchý, hospodárny, priemyselne aplikovateľný a stabilnejší spôsob vysokej regenerácia G-CSF.0017 Tento vynález sa týka nového spôsobu izolovania a purifikovania granulocytové kolónie stímulujúceho faktora (G-CSF) z mikroorganizmu produkujúceho G-CSF a opisuje priemyselne uplatniteľný, jednoduchý, nákladovo efektívny a časovo úsporný spôsob produkovania granulocytové kolónie stímulujúceho faktoru (G-CSF).0018 Hlavným cieľom tohto vynálezu je poskytnúť nový spôsob izolovania a puriñkovania granulocytové kolónie stímulujúceho faktora (G-CSF) z mikroorganizmu produkujúceho G-CSF, ktorý pozostáva z nasledujúcich krokova) Iýzovanie mikroorganizmu upravením hustoty a teploty suspenzíe bunkovej pasty a separovanie nerozpustného materiálu obsahujúceho G-CSFb) izolovanie inklúznych teliesok (IBs) obsahujúcich G-CSF za prítomnosti iónového povrchovo aktívneho činidlac) solubilizovanie G-CSF prítomného v nerozpustnom materiáli pomocou vysoko koncentrovaného chaotropného činidla a denaturačného činidla, ktorým je tris(2-karboxyetyI)fosfín hydrochlorid (TCEP)d) oxldovanie G-CSF za prítomnosti cystínu a cysteínu, pričom molárny pomerje 110e) opätovné zvinutie reťazca G-CSF v teplotne regulovaných podmienkach jednokrokovou metódouf) koncentrovanie roztoku opätovne zvinutého reťazca G-CSF systémom ñltrácíe pri tangenciálnom toku (TFF) pomocou kaziet alebo kartuší odrezávajúcich molekulovú hmotnost 5 až 12 kDag) odsoíovanie koncentrovaného roztoku G-CSF v teplotne regulovanej kolóne a separovanie roztoku G-CSF z chaotropu gélovou filtrácioui) regenerovanie puriñkovaného G-CSF vo formulačnom pufri v stabilnej formej) odstránenie endotoxínu pomocou silne bázlckej anexovej Chromatografia.0019 Vjednom uskutočnení vynálezu, G-CSF je rekombinantný metionylový humànny G-CSF0020 Vjednom uskutočnení vynálezu, hustota bunkovej pasty lýzovacieho kroku nie je menej než 8 ml resuspenzného pufra na gram inklúznych teliesok a teplota je od 5 °C do 20 °C, výhodne od 5 °C do 15 °C.0021 Ďalšie uskutočnenie vynálezu je iónové povrchovo aktívne činidlo (surfaktant), pričom je to deoxycholát sodný v lzolačnom kroku.0022 V jednom uskutočnení vynálezu, vysoko koncentrované chaotropne činidlo v solubilizačnom kroku je guanidín hydrochlorid v koncentráciách od 5,4 M do 6,6 M, výhodne 6 M.0023 Vjednom uskutočnení vynálezu, teplota v kroku opätovného zvinutia reťazca je od 7 °C do 15 °C, výhodne od 7 °C do 11 °C, výhodnejšie od 8 °C do 10 °C.0024 Podla ďalšieho uskutočnenia vynálezu, gélová filtračná kolóna je Sephadex G-25 Fine a velkost častíc (gulôčok) Sephadex G 25 Fine je od 20 m do 300 m, výhodne približne 8 m. 0025 Vjednom uskutočnení vynálezu, kolóna v odsoľovacom kroku je stabiíizovaná na teplote od 4 °C do 20 °C, výhodne od 7 °C do 15 °C, výhodnejšie od 7 °C do 13 C.0026 V jednom uskutočnení vynálezu, katexová Chromatografia pozostáva zo sulfopropylu a stabilného formulačného pufra v regeneračnom kroku vo vodnom roztoku 10 mM octanového pufra(alebo octanu sodného), 5 sorbitolu a 0,004 polysorbátu 80, ktorýje upravený na pH 4,0. 0027 V ďalšom uskutočnení vynálezu, krok silne bàzickej anexovej chromatografie, použitý pri odstraňovaní endotoxinov, pozostáva z kvartérneho amónia.0028 Vjednom uskutočnení vynálezu, pH v kroku c) je od 7,5 do 9,5, výhodne je 8,0 a v ďalšom uskutočnení vynálezu pH v kroku e) je od 7,0 do 8,0, výhodne je 7,5.0029 Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu, mikroorganizmus produkujúci G-CSF je E. coli. 0030 V ďalšom uskutočnení vynálezu spôsob zahŕňa ďalší krok forrnulovania rmetHuG-CSF na produkciu biofarmaceutického produktu pozostávajúceho zd) 0,01 až 0,10 mg polysorbátu 80 e) vody pre injekcie f) hydroxidu sodného alebo kyseliny octovej na úpravu pH.0031 v 1 ml sterílného roztoku, ktorý je akceptovateľný pre plnenie do príslušných podávacich zariadeni definovanej dávkovej intenzity na podávanie pacientom.0032 Vo výhodnom uskutočnení vynálezu, množstvo acetátu je 0,59 mg.0033 Biofarmaceutické produkty získané spôsobom podľa tohto vynálezu môžu byt užitočné pri liečbe neutrofénie, Ieukémie, mobilizácii buniek progenitoru periférnej krvi (PBPC), infekcií pri H|V,ako sú bakteriálne infekcie, a liečbe rakovinových pacientov, ktorí dostávajú cytotoxickú chemoterapiu, myeolosupresívnu chemoterapíu a transplantát kostnej drene.0034 V doterajšom stave techniky je opísaný odlišný typ mikroorganizmov, odlišný typ kmeňa a taktiež odlišne modifikované génové sekvencie na produkovanie G-CSF. Každý spôsob má špecifické produkčná podmienky a svoje problémy, ktoré možno získat z procesných podmienok,alebo vyprodukovaných cieľových proteínov alebo prímesi. Vývoj purifikačných krokov pri produkcii proteínov závisí od špecifikácil nepuríñkovaných proteínov získaných z protiprúdneho spôsobu v rôznych podmienkach. Tento vynález súvisí s produkciou čistého a stabilného G-CSF (98 podľa metódy vylúčenia velkosti v elektroforéze) ako finálneho produktu pri zvážení spotreby času,práce a nákladov. Spôsoby, ktoré sú dodnes k dispozícii, všeobecne spotrebúvajú veľa času, práce a nákladov, pričom sú aj komplikovaná. Navyše, neposkytujú stabilné výsledky. Stále je potreba zlepšených výsledkov purifikácie.0035 Jednoduchý a inovatívny spôsob produkcie G-CSF, ktorým je rekombinantný metionylový humánny G-CSF (rmetHuG-CSF), sa uskutočňuje použitím buniek E. coli kvôli vysokej úrovni expresie proteínov a zabráneniu komplikácií s glykozyláciou.0036 Bunky E. coli sa získajú po fermentácii odstreďovaním a proteínový materiál, ktorý je vo forme inklúzneho telieska sa extrahuje z buniek lýzovaním bakteriálnych buniek pomocou vysokotlakového rozrušovača (disruptéra) buniek nastavením hustoty a teploty suspenzie v bunkovej pasci a separovaním nerozpustného materiálu, ktorý obsahuje G-CSF. Stena bakteriálnej bunky sa rozruší fyzickým prostriedkom, čím sa umožní inklúznym telieskam v bunkách volne sa suspendovat do pufra. lnklúzne telieska, ktoré sa suspendovali v roztoku pufra, sa sedimentujú vysokorýchlostnou centrifugácíou. G-CSF obsahujúce inklúzne telieska sa izoluje za prítomnosti iónového povrchovo aktívneho činidla. Po premývacom a odstreďovacom kroku sa inklúzne telieska solubilizujú vo vhodnom solubilizačnom pufri, ktorý obsahuje vysoko koncentrované chaotropné činidlo. Solubilizačný pufor je vodný roztok s hodnotou pH 8,0 obsahujúci 6 M gunaidín hydrochloridu ako chaotropného čínidla a 100 mM TRIS (tris-(hydroxymetynaminometán) ako pufrovacej soli. lnklúzne telieska sa solubilizujú s vyššie spomenutým pufrom pri izbovej teplote.0037 Po kroku solubilízácíe inklúznych teliesok existuje viacero rôznych proteínových materiálov nielen odlišných od G-CSF, ale taktiež viacerých izoforiem G-CSF. Je treba zmeniť konformáciu zle zvinutého reťazca G-CSF a rozbit medzimolekulové disulfidové mostíky, ktoré môžu vytvárať diméry, oligoméry a agregáty. Preto sa solubilizované proteíny denaturujú primeraným denaturačným činídlom, aby sa získali rozvinuté monomérové reťazce. Krok denaturácie proteínov je dôležitý a ovplyvňuje výťažnost a čistotu konečného produktu. Ak chybne zvinutý reťazec proteínu zostáva v roztoku, môže spustit agregáciu vo všetkých purifikačných krokoch. Preto sa 0,5 M tris-2 karboxyetylfosfín hydrochloríd (TCEP) alebo 0,5 M DTT zvolil ako silné denaturačné činidlo, aby sa získali požadované úrovne denaturácie. Jedna až dve hodiny miešania pri izbovej teplote umožňuje správne úrovne denaturácie.0038 DTT je páchnuca chemikália a pri styku so vzduchom sa môže lahko o×idovat. Kvôli oxidácii na vzduchu je DTT ťažké skladovať ako rozpúšťadlo a je relatívne nestabilná zlúčenina. Preto sa pre tento vynález zvolil TCEP. Prłekvapujúco sa zistilo, že má synergický účinok na rozvinutie reťazca proteínu, ktory je zobrazeny na obrázku 3. Ako dôsledok tohto efektu sa na konci spôsobu zvýšila výťažnosť.