PCV2 imunogénne kompozície na použitie v spôsobe prevencie PCV2 infekcie

Táto prihláška obsahuje zoznam sekvencií vpapierovej verzii avo formáte čitateľnoml Vakcínu obsahujúcu 4 až 400 g/dávku rekombinantného PCV 2 ORF 2 proteínu na použitie V spôsobe prevencie PCV 2 infekcie u prasiat, pričom uvedený spôsob zahŕňa podanie jednej dávky uvedenej vakcíny danému prasaťu.2 Vakcínu z l na použitie podľa l, pričom uvedená vakcína obsahuje adjuvans.3 Vakcínu z l alebo 2 na použitie podľa l alebo 2, pričom uvedené adjuvans je vybrané zo skupiny obsahujúcej polyméry akrylovej kyseliny alebo polyméry metakrylovej kyseliny.4 Vakcínu z 2 alebo 3 na použitie podľa 2 alebo 3, kde uvedené adjuvans je karbomér, výhodne Karbopol.5 Vakcínu z ktoréhokoľvek bodu 2 až 4 na použitie podľa ktoréhokoľvek z bodov 2 až 4 kde uvedené adjuvans obsahuje asi 500 g až asi 5 mg Karbopolu na dávku.6 Vakcínu z ktoréhokoľvek bodu l až 5 na použitie podľa ktoréhokoľvek z l až 5,pričom uvedená vakcína obsahuje 4 g až 200 g rekombinantného PCV 2 ORF 2 proteínu.7 Použitie vakcíny obsahujúcej 4 až 400 g/dávku rekombinantného PCV 2 ORF 2 proteínu na výrobu liečiva na použitie v spôsobe prevencie PCV 2 infekcie u prasíat, pričom uvedený spôsob zahŕňa podanie jednej dávky spomínanej vakcíny danému prasaťu.8 Použitie z 7, kde uvedená vakcína obsahuje adjuvans.9 Použitie z 7 alebo 8, kde uvedené adjuvans je vybrané zo skupiny obsahujúcej polyméry akrylovej kyseliny alebo polyméry metakrylovej kyseliny.10 Použitie 8 alebo 9, pričom uvedený adjuvansje karbomér, výhodne Karbopol.l l Použitie z ktoréhokoľvek bodu 8 až 0, kde uvedené adjuvans obsahuje asi 500 g až asi 5 mg Karbopolu na dávku.12 Použitie z ktoréhokoľvek bodu 7 až l l, kde uvedená vakcína obsahuje 4 g až 200 g rekombinantného PCV 2 ORF 2 proteínu.Jeden aspekt predkladaného zverejnenia sa týka získania proteínu exprimovaného pomocouotvoreného čítacie rámca 2 (ORF 2) prasacieho cirkovírL 1 su typ 2 (PCV 2). Výhodne, proteín jerekombinantný proteín exprimovaný pomocou transfektovaného vírusu obsahujúceho rekombinantné kódujúce sekvencie pre prasací cirkovírus typu 2, otvorený čítací rámec 2. Výhodnejšie, transfektovanému vírusu je umožnené infikovať bunky vrastovom médiu a proteín exprimovaný pomocou otvoreného čítacieho rámca 2 je získaný zo supernatantu,skôr ako z prostredia buniek. Najvýhodnejšie, spôsob zahrnuje kroky ampliñkácie otvoreného čítacieho rámca 2 génu z prasacieho cirkovírusu typu 2, klonovania tejto amplifikovanej časti do prvého vektora, odstránenia časti otvoreného čítacieho rámca 2 z tohto prvého vektora a klonovania do prenosového vektoru, kotransfekcie prenosového vektora s vírusovým vektorom do buniek V rastovom médiu, a kroky vedúce k tomu, aby sa bunky stali infekčné prostredníctvom vírusového vektoru, čím dôjde kexpresii otvoreného čítacieho rámca 2,a kroky vedúce k získaniu exprimovaného rekombinantného proteínu kódovaného otvorenýmVďalšom aspekte, sa predkladané zverejnenie týka imunogénnej kompozície účinnej na vyvolanie imunitnej odpovede proti PCV 2, a spôsobov prípravy týchto imunogénnych kompozícii. Výhodnejšie, predkladané zverejnenie sa týka imunologickej kompozície účinnej pri poskytovaní imunitnej odpovede, ktorá chráni zviera, ktorému bola kompozícia podaná aredukuje alebo zmierňuje prejavy klinických symptómov spojených s PCV 2 infekciou. Najmä sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozícii na báze proteínu, ktorá poskytuje účinnú ochranu pred PCV 2 infekciou. Obzvlášť sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozície obsahujúcej ORF 2-PCV 2, pričom podanie of PCV 2-ORF 2 má za následok ochranu pred PCV 2 infekciou. Ďalej sa predkladané zverejnenie týka imunologickej kompozície, ktorá prepožičiava účinnú imunitu ošípaným, ktorým bola podaná, pričomkompozícia obsahuje proteín exprimovaný ORF 2-PCV 2. Opis doterajšieho stavu technikyPrasací circovírus typu 2 (PCV 2) je malý (17 -22 nm v priemere), ikozahedrálny, nezabalený DNA vírus, ktorý obsahuje jednovláknový kruhový genóm. PCV 2 zdiela približne 80 sekvenčnú identitu s prasacím cirkovírusom typu l (PCVI). Avšak, na rozdiel od PCVI,ktorý je vo všeobecnosti nevirulentný, ošípané infikované PCV 2 vykazujú syndróm bežne nazývaný ako syndróm multisystémového chradnutia prasíat po odstavení od materského mlieka (Post-weaníng Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS. PMWS je klinickycharakterizované stratou hmotnosti, bledosťou kože, stratou schopnosti sat materské mlieko, respiračnou bolesťou, hnačkou, žltačkou. U niektorých nakazených ošípaných sa prejavila kombinácia všetkých príznakov. zatial čo uníektorých sa vyskytol len jeden alebo dva symptómy. Počas pitvy sa pozorovali mikroskopícke amakroskopické lézie na viacerých tkanivách a orgánoch, najčastejším miesto výskytu lézíí boli lymfatické orgány. Silná korelácia bola pozorovaná medzi množstvom PCV 2 nukleovej kyseliny alebo antigénom arozsahom lymfatických lézií. Percento úmrtnosti uošípaných infikovaných PCV 2 je približne 80. Okrem syndrómu PMWS, sa PCV 2 vyskytuje aj pri niekoľkých ďalších infekciách zahrnujúcich pseudobesnotu, prasací reprodukčný a respíračný syndróm (PRRS),Glasserovo ochorenie, streptokokovú meningitídu, salmonelózu, kolibacilózu po odstavení odProtein otvoreného čítacieho rámca 2 (ORF 2) z PCV 2, majúci molekulovú hmotnosť približne 30 kDa zistenú na základe reakcie na SDS-PAGE gély, bol V minulosti využívaný ako antigćnová zložka vo vakcínach pre PCV 2. Typické metódy získania ORF 2 na použitie v takýchto vakcínach vo všeobecnosti zahrnujú amplifikáciu PCV 2 DNA, ktorá kóduje ORF 2,transfekciu vírusového vektora s ORF 2 DNA, inñkovanie buniek vírusovým vektorom obsahujúcim ORF 2 DNA, umožnenie vírusu exprimovať ORF 2 proteín vo vnútri bunky,a extrakciu ORF 2 proteínu z bunky prostredníctvom bunkovej lýzy. Tieto postupy vo všeobecnosti trvajú asi štyri dni po infekcií buniek pomocou vírusového vektoru. Avšak, tieto postupy majú nevýhodu vtom, že extrakčné postupy sú finančne náročné atiež časovo náročné. Navyše, množstvo ORF 2 získaného z buniek nie je veľmi veľké takže je potrebné veľké množstvo buniek, ktoré by mali byť infikované veľkým počtom vírusových vektorov,aby sa získalo dostatočné množstvo rekombinantného exprimovaného proteínu na použitie voSúčasné spôsoby PCV 2 imunizácie zahrnujú vakcíny na báze DNA, také ako tie, ktoré sú opísané v U.S.Patente č. 6,703,023. Avšak, takéto vakcíny boli neúčinné z hľadiska získania ochrannej imunity proti PCV 2 infekcii a z hľadiska klinických indikácii spojených s týmitoTeda, to čo je potrebné vtomto odbore, je spôsob získania ORF 2 proteínu, ktorý by nevyžadoval extrakciu ORF 2 proteínu z vnútra infikovaných buniek. Čo je ďalej potrebné, sú spôsoby získania rekombinantného ORF 2 proteínu v množstvách dostatočných na účinnú prípravu vakcínových kompozícii. Čo je ešte ďalej potrebné, sú spôsoby získania ORF 2proteínu, ktoré si nevyžadujú komplikované aprácne postupy, ktoré sú nevyhnutne presúčasné extrakčné postupy pre proteín ORF 2. Nakoniec, s ohľadom na kompozície, to čo je potrebné v danom odbore sú imunogénne kompozicie, ktoré vykazujú ochrannú imunitu proti PCV 2 infekcii a zmierňujú intenzitu klinických príznakov alebo predchádzajú klinickýmPredkladaný vynález rieši problémy vyplývajúce zo stavu techniky aposkytuje odlišný prístup kich riešeniu. Konkrétne, vtomto texte sú opísané vylepšené spôsoby prípravy a/alebo opätovného získania rekombinantnćho PCVZORFZ proteínu zahrnujúce i) infikovanie náchylných buniek v kultúre rekombinantným vírusovým vektorom obsahujúcim PCVZORF 2 DNA kódujúcu sekvencie, pričom ORF 2 proteín je exprimovaný pomocou rekombinantnćho vírusového vektoru, a ii) následne získanie ORF 2 zo supernatantu. Neočakávane sa zistilo, že ORF 2 sa uvoľňuje do supernatantu vo veľkých množstvách, ak infekcia a následná ínkubácia infikovaných buniek začne prebiehať po typickom predošlom PCV 2 ORF 2 obnovovacom procese, pri ktorom sa vylučuje PCV 2 ORF 2 zvnútro buniek. Ďalej bolo prekvapujúco zistené, že PCV ORF 2 proteín je odolnejší proti typickej degradácii mimo produkovaných buniek. Obidve uvedené zistenia umožňujú obnovu veľkého množstva PCV 2 ORF 2 proteínu zo supernatantu bunkových kultúr infikovaných rekombinantnými vírusovými vektormi obsahujúcimi PCV 2 ORF 2 DNA a exprimujúcimi PCV 2 ORF 2 proteín. Pod pojmom veľké množstvá PCV 2 ORF 2 proteínu sa uvádza množstvo viac než asi 20 g/m 1 supernatantu,výhodne viac než asi 25 g/ml, výhodnejšie viac než asi 30 g/ml, výhodnejšie viac než asi 40 g/ml, výhodnejšie viac než asi 50 g/ml, výhodnejšie viac než asi 60 g/mI, výhodnejšie viac než asi 80 g/ml, výhodnejšie viac než asi 100 g/m 1, výhodnejšie asi 150 g/m 1,najvýhodnejšie asi 190 g/ml. Tieto hodnoty je možné dosiahnuť tiež napríklad metódamiPreferované bunkové kultúry obsahujú medzi asi 0,3 - 2,0 x 106 buniek/ml, výhodnejšie asi 0,35 - 1,9 x 106 buniek/m, ešte výhodnejšie asi 0,4 - 1,8 x 10 ° buniek/ml, ešte výhodnejšie asi 0,45 - l,7 x 106 buniek/ml, a najvýhodnejšie asi 0,5 ~ 1,5 x 105 buniek/ml. Preferované bunky boli určené odborníkmi vdanom odbore. Preferovane bunky sú tie, ktore sú náchylne na inñkovanie s vhodným rekombinantným vírusovým vektorom, obsahujúcim PCV 2 ORF 2 DNA a exprimujúcim PCV 2 ORF 2 proteín. Výhodné bunky sú bunky hmyzu, a výhodnejšie tieto bunky zahrnujú bunky hmyzu zakúpené pod obchodnou značkou Sf hmyzie bunky