Prostriedky na orálne podanie s riadeným uvoľňovaním levosimendanu

Predkladaný vynález sa týka orálnych fannaceutických prostriedkov, ktoré uvoľňujú levosimendan riadeným spôsobom so zníženým výskytom nežiaducich účinkov. Levosimendan, čiže (-) 4-(l,4,5,ó-tetrahydro-4-metyl-6-oxo-3-pyridazinyl)fenyl-hydrazonopropándinitril, je použiteľný na liečbu mestnavého srdcového zlyhania.Levosimendan, čo je (-)-enantiomér 4-(l,4,5,6-tetrahydro-4-metyl-6-oxo-3-pyridazinyl)fenylhydrazonopropándinitrilu, a spôsob jeho prípravy, je opísaný V EP 545546 B 1. Levosimendan je účinný pri liečbe mestnavého srdcového zlyhania a má významnú väzbu na troponin závislú od vápnika. Levosimendan má vzorecHemodynamické účinky levosimendanu u ľudí sú opisané v Sundberg, S., et al., Am. J. Cardiol., 1995, 75 1061 až 1066. Farmakokinetika levosimendanu u človeka po i. V. a oràlnom podani sú opísané v Sandell, E. P. et al. , J. Cardiovase. Pharmacol. 26 (Supll. l), S 57 - S 62, 1995. Použitie levosimendanu pri liečbe myokardiálnej ischémie je opísané vo W 0 93/21921. Klinické štúdie potvrdili priaznivé účinky levosimendanu u pacientov s mestnavýrn srdcovým zlyhaním.Orálne podanie levosimendanu sa ukázalo ako ťažké,najmä Vtedy, ak je cieľom dosiahnutie terapeutického účinku na dlhšie obdobie. V prvom rade, eliminačný polčas levosimendanu u človeka je krátky, približne l hodina. Preto by pri použití zvyčajných orálnych prostriedkov s okamžitým uvoľňovaním obsahujúcich levosimendan bolo nutné podávať takéto prostriedky mnohokrát denne. V druhom rade, absorpcia levosimendanu V gastrointestinálnom systému je rýchla. Preto sú pri použití zvyčajných orálnych prostriedkov s okamžitým uvoľňovaním dosiahnuté vrcholové plazmatické koncentrácie levosimendanu rýchlo a dočasne, zvyčajne počas l hodiny. Vysoké plazmatické koncentrácie levosimendanu zvyšujú srdcový pulz, čo nie je žiaduce u pacientov so srdcovým zlyhaním.Dlhodobo pôsobiace orálne prostriedky majú mnoho výhod oproti zvyčajným orálnym prostriedkom s rýchlym uvoľňovaním. Medzi takéto výhody patria menšie variácie V plazmatických koncentráciách lieku, a preto stabilnejšia terapeutická odpoved, nižšia frekvencia dávkovania a zníženie nežiadaných účinkov. Zvyčajne sú dlhodobo pôsobiace prostriedky pripravené zmiešaním lieku, činidla kontrolujúceho uvoľňovanie a vhodných prísad, a stlačením zmesi do formy tabliet. Typické dlhodobo pôsobiace prostriedky uvoľňujú liek tak v homom, ako v dolnom gastrointestinálnom trakte.Pokusy o podanie levosimendanu vo Zvyčajných dlhodobo pôsobiacich prostriedkoch boli sklamaním. Pri podani levosimendanu V dlhodobo pôsobiacich prostriedkoch, ktoré sú v odbore zvyčajne používané na dosiahnutie dlhodobého terapeutického účinku, boli často pozorované nežiaduce účinky ako silná bolest hlavy, palpitácia a zrýchlený pulz. Preto existuje potreba nových spôsobov a prostriedkov na orálne podanie levosimendanu, konkrétne prostriedkov a spôsobov, ktoré umožnia dosiahnutie dlhodobého te rapeutického účinku levosimendanu bez nevýhod spojených s podaním levosimendanu vo zvyčajných dlhodobo pôsobiacich prostriedkoch.Bolo zistené, že levosimendan je citlivý na metabolizáciu V dolnom gastrointestinálnom trakte, najmä v hrubom čreve, pôsobením črevných baktérií. Táto metabolizácia vedie nakoniec k tvorbe aktívneho metabolitu prvého priechodu, (R)-N-4-(l,4, 5,6-tetrahydro-4-metyl-6-oxo-3-pyridaziny|)fenyl-acetamidu (II), ktorý má eliminačný polčas významne vyšší ako levosimendan. Bolo zistené, že akumulácia aktívneho metabolitu je príčinou nežiaducich účinkov spojených s použitím dlhodobo pôsobiacich levosimendanových prostriedkov. Objav aktívneho metabolitu a spôsobu jeho vzniku, umožňuje teraz navrhnúť prostriedky s riadeným uvoľňovaním, ktoré majú nižší výskyt nežiaducich účinkov a ktore sú vhodné na liečbu pacientov so srdcovým zlyhaním.Preto sú predmetom predkladaného vynálezu orálne prostriedky, najmä prostriedky umožňujúce dosiahnutie dlhodobého terapeutického účinku, z ktorých sa levosimendan uvoľňuje rovnomerne a výhodne celkom pred dosiahnutím dolnej časti gastrointestinálneho traktu, presnejšie hrubého čreva, takže tvorba aktívneho metabolitu zostáva na nízkej úrovni. Preto zostáva koncentrácia aktívneho metabolitu v plazme na dostatočne nízkej úrovni, takže nedochádza ku vzniku nežiaducich účinkov spojených s akumuláciou aktívneho metabolitu, zatial kým je dosiahnutý dlhodobý terapeutický účinok, Plazmatické koncentrácie metabolitu (Il) dobre korelujú s výskytom nežiaducich účinkov, ako je silná bolesť hlavy, palpitácia a zrýchlený tep. Pri optimálnej liečbe pacientov so srdcovým zlyhaním levosimendanom by mali byt rovnovážne plazmaticke koncentrácie metabolitu (ll) nižšie ako 20 ng/ml, výhodnejšie nižšie ako 10 ng/ml.Tieto výhody sú V predkladanom vynáleze dosiahnuté pomocou prostriedku s riadeným uvoľňovaním, ktorý obsahuje a) terapeuticky účinné množstvo levosimendanu a b) zložka kontrolujúca uvoľňovanie účinnej látky, ktorá spôsobuje uvoľňovanie levosimendanu počas dlhého obdobia a umožňuje dosiahnutie rowiomemých plazmatických koncentrácii metabolitu (II), ktoré sú nižšie ako 20 ng/ml,výhodnejšie nižšie ako 10 ng/ml.Termín dlhé časové obdobie značí obdobie dlhšie ako aspoň jedna hodina, lepšie aspoň dve hodiny, po podaní. Rovnomemá plazmatická koncentrácia metabolitu (ll), ako je definovaná, značí priemernú hodnotu pre skupinu pacientov.Výhodne umožňuje zložka kontrolujúca uvoľňovanie účinnej látky V podstate celkové uvoľnenie levosimendanu predtým, ako prostriedok dosiahne hrubé črevo.Termín zložka kontrolujúca uvoľňovanie lieku označuje Všeobecne rôzne technológie, ktoré môžu byt použité na kontrolovanie a predĺženie uvoľňovania levosimendanu v prostriedku podľa predkladaného vynálezu. Medzi takéto technológie patria matricove prostriedky (napríklad matricové tablety, granuly alebo pelety) alebo potiahnuté prostriedky (napriklad potiahnuté tablety, granuly alebo pelety,alebo mikrokapsuly). Zložky kontrolujúce uvoľňovanie lieku, ako sú poťahy a matrice, a spôsoby prípravy matricových a potiahnutých prostriedkov, sú V odbore dobre známe. Voľba materiálu a použitého množstva závisí od požadovaného charakteru uvoľňovania a je rutinná pre odbomi SK 285427 B 6kov. Ako zložka kontrolujúca uvoľňovanie lieku môžu byť použité akékoľvek kontrolujúce materiály, napríklad matricové alebo poťahové materiály, alebo ich kombinácie, ktoré sú vhodné na dosiahnutie požadovaného charakteru uvoľňovania v predkladanom vynáleze, Medzi typické zložky kontrolujúce uvoľňovanie použiteľné v predkladanom vynáleze patria, napríklad, hydrofilné gelotvorné polyméry ako je hydroxypropylmetylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, karboxymetylcelulózy, kyselina algínová a ich zmesi rastlinné tuky a oleje vrátane pevných rastlinných olejov,ako je hydrogenovaný sójový olej, stužený ricínový olej alebo olej z ricínových semien (predávaný pod obchodným názvom Cutina HR), olej z bavlníkových semien (predávaný pod obchodným názvom Sterotex alebo Lubritab) alebo ich zmesi estery mastných kyselín, ako sú triglyceridy alebo nasýtené masme kyseliny, alebo ich zmesi, napríklad glyceryltristearáty, glyceryltripalmitáty, glyceryltrimyristáty, glyceryltribehenáty (predávané pod obchodným názvom Compritol) a glycerylové estery kyseliny palmitosteárovej.Podľa predkladaného vynálezu je tiež možné použiť prostriedky, ktoré sú navrhnuté tak, aby mali dlhší čas zotrvania v hornom gastrointestinálnom trakte, napríklad v žalúdku. Toto znižuje riziko metabolizácie levosimendanu v hrubom čreve a nasledovnú tvorbu aktívneho metabolítu(II). Takéto prostriedky, napriklad plávajúce alebo napúčacie prostriedky, majú tú výhodu, že celkový čas uvoľňovania lieku môže byt podstatne dlhší, pretože trvá podstatne dlhšie, ako prostriedok dosiahne dolnú časť gastrointestinálneho traktu.Prostriedky zotrvávajúce dlhší čas v žalúdku sú opísané napríklad v US 4126672, US 4814178, US 4777033, US 5232704 a EP 539059.Tak môže byť podľa predkladaného vynálezu použitý akýkoľvek prostriedok s riadeným/predĺženým uvoľňovaním obsahujúci levosimendan, ktorý umožňuje dosiahnutie rovnovážnej plazmatickej koncentrácie metabolítu (II) nižšej ako 20 ng/ml, výhodnejšie nižšej ako 10 ng/ml.Rovnovážne plazmatické koncentrácie metabolítu (Il) môžu byť merané pre akýkoľvek prostriedok pomocou podávania - raz alebo niekoľkokrát za deň - prostriedku obsahujúceho levosimendan dobrovoľníkovi alebo skupine dobrovoľníkov dovtedy, kým je dosiahnutá rovnovážna koncentrácia metabolítu (Il). Plazmatická koncentrácia aktívneho metabolítu (II) môže byt potom meraná postupom podrobne opisanými v príklade 2.Jedným aspektom vynálezu je prostriedok s riadeným uvoľňovaním obsahujúci levosimendan určený na orálne podanie, ktorý má charakteristický charakter rozpúšťania in vitro.Presnejšie, vynález sa týka prostriedku s riadeným uvoľňovaním na orálne podanie, ktorý obsahuje a) terapeuticky účinné množstvo levosimendanu a b) zložku kontroluj úcu uvoľňovanie účinnej látky umožňujúcej dosiahnutie uvoľňovania levosimendanu počas dlhšieho časového obdobia, kde tento prostriedok má celkový čas rozpúšťania in vitro, stanovený USP XXll košíčkovou metódou vo fosfátovom pufri s pH 5,8 (pri 50 alebo l 00 min), medzi l až 4 hodinami, pre aspoň 90 hmotn. obsahu levosimendanu.Presnejšie, prostriedok podľa predkladanćho vynálezu má celkový čas rozpúšťania in vitro v podstate medzi l až 3 hodinami, pre aspoň 90 hmotn. obsahu levosimendanu.Zložka kontrolujúca uvoľňovanie lieku môže byť vybratá uvedeným spôsobom. Opäť, medzi typické zložky kontrolujúce uvoľňovanie použiteľné v predkladanom vynáleze patria, napríklad hydrofilné gelotvomé polyméry ako je hydroxypropylmetylcelulóza, hydroxypropylceluló za, karboxymetylcelulózy, kyselina algínová a ich zmesi rastlinné tuky alebo oleje alebo estery mastných kyselín,ako je hydrogénovaný sójový olej, stužený ricínový olej alebo glycerylpalmitostearát.Spôsob na stanovenie charakteru rozpúšťania prostríedkov podľa predkladaného vynálezu in vitro je opísaný v príklade 3. Prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť napríklad, vo fonne tabliet, kapsúl, granulátov alebo prášku.Najmä výhodné uskutočnenie predkladaného vynálezu je získané kombinovaním zložky s rýchlym uvoľňovaním levosimendanu, voliteľne s prísadami, so zložkou s riadeným uvoľňovaním obsahujúcim levosimendan a zložky kontrolujúcu uvoľňovanie účinnej látky. Zložka kontrolujúca uvoľňovanie účinnej látky môže byt vybratá uvedeným spôsobom, ale výhodne je ňou hydroñlný gelotvorný polymér. Najmä výhodný je prostriedok obsahujúci a) časť s rýchlym uvoľňovaním vo forme prášku obsahujúceho levosimendan spolu s aspoň jednou prísadou a b) časť s riadeným uvoľňovaním vo forme granulátu obsahujúceho levosimendan a hydrotilný gelotvomý polymér kontrolujúci uvoľňovanie. Časť s rýchlym uvoľňovaním vo forme prášku a časť s riadeným uvoľňovaním vo forme granulátu sú výhodne vo voľne tečúcej zmesi, ktorá môže byt plnená do kapsúl, ako sú želatínové kapsuly alebo HPMC kapsuly.Najmä výhodný prostriedok podľa predkladaného vynálezu obsahuje 0,05 až 20 hmotn., výhodnejšie 0,1 až 10 výhodnejšie a ešte výhodnejšie 0,2 až 3 hmotn. levosimendanu vzhľadom na hmotnosť prostriedku. Dávka lieku je rozdelená medzi časti s rýchlym uvoľňovaním a riadeným uvoľňovaním. Zvyčajne je 25 - 75 , lepšie 30 až 70 a najlepšie 40 - 60 hmotnosti lieku v časti s riadeným uvoľňovaním.Zvyčajne je denná dávka levosimendanu u človeka pri orálnom podaní od 0,1 mg do 20 mg, výhodnejšie od 0,5 mg do 10 mg, v jednej dennej dávke alebo v niekoľkých dávkach za deň. Dávka závisí napríklad od veku, telesnej hmotnosti a stavu pacienta. Prostriedky podľa výhodného uskutočnenia obsahujú 0,1 mg až 5 mg, výhodnejšie 0,2 mg až 2 mg, levosimendanu rozdelené medzi časti s rýchlym uvoľňovaním a riadeným uvoľňovaním. Výhodné vrcholové plazmatické koncentrácie levosimendanu v rovnovážnom stave pri liečbe mestnavého srdcového zlyhania sú v rozmedzí od l do 100 ng/ml, výhodnejšie od 5 do 60 ng/ml a najvýhodnejšie od 10 ng/ml do 50 ng/ml.Vhodnou prísadou v časti s rýchlym uvoľňovaním je plnivo, ako je mikrokryštalickà celulóza alebo laktóza. Milcrolcryštalická celulóza je výhoclnou prísadou a je dostupná v rôznych stupňoch ako Avicel PHl 0 l, Avicel PHIOZ alebo Avicel PH 200. Množstvo prísad v časti s rýchlym uvoľňovaním je 20 hmotn. až 70 hmotn., výhodnejšie 30 hmotn. až 60 hmotn. prostriedku. Vhodným klzným činidlom je kyselina stearová alebo stearán horečnatý, ktoré môžu byť pridané do časti s rýchlym uvoľňovaním. Výhodnýrn klzným činidlom je kyselina stearová.Medzi hydrofilné gelotvomé polyméry kontrolujúce uvoľňovanie patrí, napríklad hydroxypropylmetylcelulóza,hydroxypropylcelulóza, karboxymetylcelulózy, kyselina algínová a ich zmesi. Výhodná je zmes kyseliny algínovej s iným hydrofilným gelotvomým polymérom, konkrétne zmes kyseliny algínovej s hydroxypropylmetylcelulózou. Komerčne sú dostupné rôzne typy hydroxypropylmetylcelulózy, napríklad Methocel K 100 (m. h. 26000 g/mol),Methocel K 4 M (m. h. 86000 g/mol), Methocel Kl 5 M (m. h. 120000 g/mol) a Methocel KIOOM. Viskozita týchto ty SK 285427 B 6pov je vo 2 vodnom roztoku (20 °) 100 cP, 4000 cP,15000 cP a 100000 cP, v príslušnom poradí. Výhodná je viskozita hydroxypropylmetylcelulózy medzi 50 - 2000 cP. Výhodným typom hydroxypropylmetylcelulózy je Methocel K 100.K časti s riadeným uvoľňovaním môžu byt pridané kĺzne činidlá, ako je kyselina stearová alebo stearán horečnatý. Výhodným klzným činidlom je kyselina stearová.Množstvo hydroñlněho gelotvomého polymćru vo výhodných uskutočneniach predkladaného vynálezu je približne 20 - 80 , lepšie 30 - 70 , vzhľadom na hmotnost prostriedku. Výhodným hydroñlným gelotvomým polynérom je zmes kyseliny alginovej s hydroxypropylmetylcelulózou. Výhodne množstvo kyseliny alginovej je od približne 10 do 50 , lepšie od približne 20 do 40 , vzhľadom na celkový objem hydrofilného gelotvomého polyméru.Množstvo časti s rýchlym uvoľňovaním vo výhodných uskutočneniach predkladaného vynálezu je približne 20 až 80 , lepšie približne 30 - 70 , ešte lepšie približne 40 až 60 , vzhľadom na hmotnosť prostriedku. Množstvo klzného činidla, pokial je pritorrmé, je približne 0,3 - 10 ,lepšie približne 0,5 až 5 , vzhľadom na hmotnosť prostriedku.Iné výhodné uskutočnenie vynálezu je získané zmiešaním zložky kontrolujúcej uvoľňovanie liečiva, levosimendanu a prísad, napriklad vo forme práškov, a plnenia zmesi do kapsúl, ako sú želatínové kapsuly alebo HPMC kapsuly. Zložka kontrolujúca uvoľňovanie lieku môže byt vybratá uvedeným spôsobom. Výhodné je zložkou kontrolujúcou uvoľňovanie lieku hydrofilný gelotvorný polymér, ktorý je vtomto uskutočnení použitý V množstve približne 10 až 70 , lepšie približne 15 až 60 /, najlepšie približne 20 až 40 , vzhľadom na hmotnosť prostriedku. Medzi hydrofilne gelotvomé polyméry kontrolujúce uvoľňovanie patria,napríklad, hydroxypropylmetylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, karboxymetylcelulózy, kyselina algínová a ich zmesi. Najvýhodnejšou zložkou kontrolujúcou uvoľňovanie lieku je hydroxypropylmetylcelulóza, najmä hydroxypropylmetylcelulóza s viskozitou medzi S 0 - 2000 cP, ako je Methocel K 100, a kyselina algínová alebo ich zmes. Množstvo prísady (napríklad mikrokryštalickej celulózy alebo laktózy) je v tomto uskutočnení približne 30 až 90 , lepšie približne 40 až 80 , najlepšie približne 50 až 70 ,vzhľadom na celkovú hmotnost prostriedku. Levosimendan je použitý v množstvách uvedených pre predchádzajúce výhodné uskutočnenia.Ešte iné výhodné uskutočnenie vynálezu je prostriedok vo forme matricovej tablety, ktorá je získaná zmiešaním zložky kontrolujúcej uvoľňovanie liečiva, levosimendanu a prísad, ako je mikrokryštalická celulóza, laktóza alebo kyselina stearová, a stlačením zmesi do formy tablety s použitím vhodného tabletovacieho lisu. Zložka kontrolujúca uvoľňovanie lieku môže byť opät vybrala uvedeným spôsobom. Výhodne je zložkou kontrolujúcou uvoľňovanie lieku hydrofilný gelotvomý polymér alebo rastlinný tuk,alebo olej, alebo ester mastnej kyseliny, ako boli opisaně. V tomto uskutočnení je zložka kontrolujúca uvoľňovanie liečiva použitá v množstve približne 0,5 až 60 , vzhľadom na hmotnosť prostriedku, a množstvo prísad (napríklad mikrokryštalickej celulózy) je približne 30 až 99 , vzhľadom na hmotnosť prostriedku, Pokiaľ je zložkou kontrolujúcou uvoľňovanie liečiva hydroñlný gelotvomý polymér,napríklad hydroxypropylmetylcelulóza, najmä hydroxypropylmetylcelulóza s viskozitou medzi 50 až 2000 cP, ako je Methocel K 100, a kyselina algínová alebo ich zmes, tak je použitá v množstve približne 5 až 60 , lepšie približne 10 až 50 , najlepšie približne 15 až 40 , vzhľadom nahmotnost prostriedku, a množstvo prísad (napríklad mikrokryštalickej celulózy) je približne 30 až 99 , lepšie približne 50 až 90 , najlepšie približne 60 až 85 , vzhl dom na hmotnost prosoiedku. Pokiaľ je zložkou kontrolujúcou uvoľňovanie liečiva rastlinný tuk alebo olej, alebo ester mastnej kyseliny, napríklad hydrogenovaný sójový olej,stužený ricínový olej alebo glycerylpalmitostearát, tak je zložka kontrolujúca uvoľňovanie liečiva použitá v množstve približne 0,5 až 30 , lepšie približne 2 až 20 , najlepšie približne 3 až 15 , vzhľadom na hmotnost prostriedku, a množstvo prísad (napríklad mikrokryštalickej celulózy) je približne 70 až 99 , lepšie približne 80 až 98 , najlepšie približne 85 až 97 , vzhľadom na hmotnost prostriedku. Levosimendan je použitý v množstvách uvedených pre predchádzajúce výhodne uskutočnenia.Prehľad obrázkov na výkresochObr. 1 ukazuje kalibračnú vzorku analyzovanú na aktívny metabolit (II) od dobrovoľnika, ako bol analyzovaný kvapalinovou chromatografiou v tandeme s hmotnostnou spektrometriou.Obr. 2 ukazuje vzorku plazmy po podani dávky analyzovanú na aktívny metabolit (Il) od dobrovoľnika, ako bol analyzovaný kvapalinovou chromatograñou v tandeme s hmotnostnou spektrometriou.Obr. 3 ukazuje krivku rozpustenia in vitro pre prostriedok l príkladu 1 vo fosfátovom pufri, pH 5,8.Obr. 4 ukazuje krivku rozpustenia in vitro pre prostriedok 2 príkladu 1 vo fosfátovom pufri, pH 5,8.Obr. 5 ukazuje krivku rozpustenia in vitro pre prostriedok 3 príkladu l vo fosfátovom pufri, pH 5,8.Obr. 6 ukazuje krivku rozpustenia in vitro pre referenčný prostriedok príkladu 3 vo fosfátovom pufri, pH 5,8.Nasledujúce prísady dokresľujú predkladaný vynález a nijako neobmedzujú jeho rozsah.Príklady uskutočnenia vynalezu Príklad l Príklady prostriedkovČast vo forme granúl Levosimendan 1,0 mg Kyselina alginová 18,0 mg Methocel KIOOLV 37,0 mgKyselina stearová 0,6 mg Časť vo forme prášku Levosimendan 1,0 mg Avicel PHIOI 84,0 mg Kyselina stearová 1,5 mg Prostriedok 2 Časť vo forme granúl Levosimendan 1,0 mg Kyselina algínová 23,0 mg Methocel KIOOLV 46,0 mg Kyselina stearová Časť vo forme prášku Levosimendan 1,0 mg Avicel PHl 01 69,5 mg Kyselina stearová 1,5 mg Prostriedok 3 Časť vo fome granúl Levosimendan 1,0 mg Kyselina alginová 28,0 mg Methocel KIOOLV 56,0 mg Kyselina stearová 0,9 mg Čast vo forme prášku Levosimendan 1,0 mgAvicel PHlOl 56,0 mg Kyselina stearová 1,5 mgČast vo forme granúl Levosimendan 1,0 mg Kyselina algínová 33,0 mg Methocel K 1 OOLV 66,0 mg Kyselina stearová 0,6 mgČasť vo forme prášku Levosimendan 1,0 mg Avicel PHl 01 43,0 mg Kyselina stearová 1,5 mgV uvedených príkladoch bol materiál pre časť vo forme granúl preosíaty a zmiešaný do homogenity vo vhodnej miešačke, ako je Turbula míešačka alebo Zanchetta kontajnerová miešačka. Zmes vo forme prášku sa preosiala cez 0,6 mm sito. Hmota sa granulovala za sucha rozdrvenim(bola lisovaná pomocou tabletovacieho lisu). V tomto postupe bola hmota zhutnená s použitím Bepex Pharapactor L 200/50 P, s lisovacou silou približne 45 kN. Zhutnená hmota sa preosiala a získali sa granuly s priemerom 0,7 až 1,7 mm.Materiál pre časť vo forme prášku bez kyseliny stearovej sa preosial a zmiešal sa do homogenity vo vhodnej miešačke, ako je Turbula miešačka alebo Zanchetta kontajnerová miešačka. Časť vo f 0 ľlTlC granúl a čast vo forme prášku a kyselina stearová sa zmiešali do homogcnity vo vhodnej míešačke, ako je Turbula miešačka alebo Zanchetta kontąnerová miešačka. Získané hmota sa plnila do kapsúl z tuhej želatíny č. 3. Namiesto kapsúl z tuhej želatíny môžu byt tiež použité HPMC kapsuly č. 3.Príklad 2 Stanovenie koncentrácie aktívneho metabolitu(II) v ľudskej plazme pomocou kvapalinovej chromatogratie V tandeme s hmotnostnou spektrometriou.Aktívny metabolit (Il) bol pridaný vo 20 l fosfátovom pufri, pH 7,2, do 0,5 m 1 plazmy neobsahujúcej analyt. Množstvá pridaného analytu boli 0,100, 0,250, 0,500, 1,00,2,50, 3,75, 5,0, 7,50 a 12,5 ng. Po dôkladnom premíešaní počas 20 sekúnd a odstátí počas 10 minút sa pridalo 2500 pg vnútorného štandardu, (R)-N-4-(1,4,5,6-tetrahydro-4-metyl-6-oxo-3-pyrida-zinyl)fenylacetamidu, vo 20 l fosfátovom pufri, pH 7,2. Zmes sa dôkladne premiešala počas 1 minúty a nechala sa ustát počas 15 minút, Kalibračné vzorky sa alkalizovali 50 l 0,1 M hydroxidu sodného a miešali sa počas 20 sekúnd. Kalibračné vzorky sa extrahovali 5 ml etylacetátu z hexánu (8 2) pomocou miešania počas 3 minút. Po odstredení počas 7 minút sa organická vrstva separovala a zahustila sa pri 40 °C s použitím TurboVap odparky. Po usušení kalibračných vzoriek sa pridalo 200 l etylacetátu hexánu, uskutočnilo sa miešanie počas l minúty a zahustenie pri 40 °C s použitím TurboVap odparky. Potom sa pridalo 200 l metanolu -2 mM octanu amónneho(1 1), kalibračné vzorky sa premíešali počas 1 minúty a nechali sa ustáť počas 5 minút. Po 7 minútovom odstredení sa supematant preniesol do nepoužitej kónickej skúmavky na analýzu kvapalinovou chromatograñou v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou.Príprava vzoriek Vzorky boli pripravené opísanýrn spôsobom, s tou výnimkou, že prvé pridanie pufra je bez analytu.Analýzy sa uskutočnili s použítím PE Sciex API 300 kombinovanćho kvadrupólového hmomostného spektrometra vybaveného zohrievaným nebulizačným rozhraním. Pre HPLC bol použitý Hewlett-Packard HPl 090 L systém. Bola použitá kolóna LiChrosorb RP-18 s reverznou fázou(250 x 4 mm ID, 10 um častice, E. Merck). Mobilná fáza sa skladá z metanolu-2-mM octanu amónneho, pH 5 (60 40 obj./bj.). Prietok je 1 ml/min. Podiel 100 l extraktu bol nastreknutý do kolóny pre kvapalinovú chromatograñu.Eluent z kolóny bol priamo zavedený do hmotnostného spektrometra. Vybíjací prúd ihly bol nastavený na 4 kV. Tlak plynu v nebulízátorí (dusiku) bol 5 barov. Teplota rozhrania bola 500 °C. Napätie na vstupnej clone bolo 25 V. Kladné ióny boli vzorkované do kvadrupólového hmotnostného analyzátora.Merania boli uskutočnené s použitím vybratej techniky na sledovanie reakcie. Prvý kvadrupólový filter hmotnostného spektrometra, Ql, bol nastavený tak, aby prcpúšťal protonízovane molekuly pri m/z 246 pre aktívny metabolit(II) a m/z 260 pre vnútomý štandard, pre kolíziami indukovanú fragmentáciu na Q 2. Príslušné vzniknuté ióny, pri m/z 204 a rn/z 218, sa potom nechajú prechádzať do Q 3 pre monitorovanie. Použila sa doba pokoja 200 ms a pauza 100 ms. Chromatogramy pre Vybraté reakcie bolí zaznačené pomocou PE Sciex API 300 Data Systému.Pomery plochy píkov analytu a jeho vnútomého štandardu boli vnesené do grafu v závislosti od koncentrácie. Stanovenie rovníc kalibračnej krivky a koncentrácii neznámych vzoriek boli uskutočnené s použitím PE Sciex API 300 Data Systému a PE Sciex MacQuan 1.4 programu. Limit kvantífikácie bol 0,200 ng/ml. Bola pripravená kalibračná krivka pre aktívny metabolit (11).ony produkované aktívnym metabolitom (11) a jeho vnútomým štandardom boli sledované s použitím vybratej techniky pre monitorovanie reakcie. Metóda je špecifická s ohľadom na pozadie spôsobené plazmou. V prázdnych plazmatických extraktoch neboli pozorované interferujúce piky. Obrázky l a 2 ukazujú kalibračnú vzorku plazmy a vzorku od dobrovoľníka po podaní dávky.Príklad 3 Testy prostriedkov podľa predkladaného vynálezu in vitro a in vivoProstriedky 1,2 a 3 z pnkladu 1 boli testované v teste rozpúšťania. Rýchlosť rozpúšťania prostriedkov bola testovaná spôsobom podľa U. S. liekopisu XXII (košíčková metóda) vo fosfátovom pufri, pH 5,8, pri 50 rpm. Výsledky pre prostriedky l, 2 a 3 sú uvedené na obrázkoch 3, 4 a 5, v príslušnom poradí. Prostriedky l, 2 a 3 z príkladu 1 boli potom podané zdravým dobrovoľníkom ako jediná orálna dávka obsahujúca 2 mg levosimendanu. Každá skupina sa skladala z 9 jedincov. Plazmatické koncentrácie metabolitu(II) boli určené 12 hodín po podaní. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.Plazmatické koncentrácie (pg/ml) metabolitu (II) u zdravých dobrovoľníkov 12 hodín po jedinej orálnej dávke levosimendanu (n 9). Klinická štúdia 3001047.