Spôsob identifikácie transmembránových proteín interagujúcich zlúčenín

Číslo patentu: E 5392

Dátum: 11.04.2003

Autori: O'dowd, George

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

vynález sa týka spôsobov skríningu zlúčenín na ich schopnosť interakcie stransmembránovými proteínmi. Vynález sa ďalej týka spôsobov skríningu transmembránových proteínov na ich schopnosť dimerizácie alebo oligomerizácie doskupín dvoch alebo viacerých proteínov.ą/nasledujúcom opise sú odvolávky na niektoré citácie literatúry, ktoré súuvedené na konci špecifikácie a ktoré sa zahŕňajú do tejto prihlášky odkazom.Transmembránové proteíny boli klasitikované do niekoľkých významných tried,kam patria receptory viazané s G proteinom, transportéry, tyrozínkinázové receptory,cytokínové receptory a receptory LDL. Receptory viazané s G proteínom (GPCR - G protein coupled receptors) možno zoskupiť na základe štruktúrnej a sekvenčnej homológie do niekoľkých rodín. Rodina 1 (označovaná aj ako rodina A aleborodopsínová rodina) je ďaleko najväčšou podskupinou a obsahuje receptory pre maléA molekuly, napriklad katecholaminy, dopamín a noradrenalin, peptidy, napriklad ópioidy, somatostatín avazopresín, glykoproteinové hormóny, napríklad hormón stimulujúci tyrotropín a celá trieda zápachových molekúl (George a kol., 2002). Rodina 2 alebo rodina B obsahuje receptory, napriklad na glukagón, hormón prištítnych teliesok asekretin. Tieto GPCR sa vyznačujú dlhým aminokoncom, ktorý obsahuje niekolko cysteínov, ktoré môžu tvoriť disulfidícké mostíky. Rodina 3 alebo rodina C obsahuje receptory, napríklad receptory metabotropného glutamátu, senzorové receptory Ca a receptory kyseliny v-aminobutánovej (GABA)B. Aj tieto receptory sú charakterizované zložitým aminokoncom. Hoci všetky GPCR majú rovnakých sedem závitnic prechádzajúcich cez membránu, rôzne rodiny GPCR nevykazujú žiadnu vzájomnúGPCR sú najväčšou známou skupinou povrchových bunkových mediátorov prenosu signálov a nachádzajú sa vkaždej bunke vtele. Pôsobenie GPCR reguluje celé spektrum fyziologických funkcií, napriklad funkcii zahŕňajúcich mozog, srdce. obličky, pľúca, imunitné aendokrinné systémy. Vrámci rozsiahleho úsilia počasuplynulého desaťročia sa identiñkoval veľký počet nových GPCR, vrátane viacerýchreceptorových subtypov pre predtým známe Iigandy a početných receptorov, pre ktoré endogénne Iigandy ešte nie sú identiñkované a ktoré sa označujú ako receptory siroty alebo oGPCR (orphan GPCR) (Lee a kol., 2001 Lee a kol., 2002 Bailey a kol., 2001).GPCR sú úspešnými cieľmi početných liečiv na rôzne poruchy, ktoré sú už dnes v klinickom používaní, pričom odhadom 50 aktuálneho trhu s iíečivami sa zameriava na tieto molekuly. Spomedzi známych GPCR je približne 335 receptorov potenciálnymi cieľmi vývoja liečiv, zktorých 195 majú známe Iigandy azvyšných 140 sú oGPCR čakajúce na identifikáciu svojich ligandov. Hoci rôzne metodické pokroky urýchlili tempo objavovania nových receptorov, rýchlosť objavovania ligandov a liečiv ďaleko zaostáva. Spočiatku sa na objavovanie ligandov a liečiv pre mnohé GPCR používali konvenčné metódy farmakologického skriningu v malom rozsahu, ale sústavne sa hľadajú novšieKeďže GPCR tvoria vyše 80 povrchových bunkových receptorov, predstavujú podstatný zdroj a tvoria vysoko relevantnú skupinu proteínových cieľov pre objavovanie nových liečiv. Liečivá interagujúce s GPCR majú potenciál vysokej selektivity, kedže interakcie budú obmedzené výlučne na povrch bunky a na tkanivá, ktoré majú receptory. Objavenie GPCR spolu so zistenim, že sú dôležitýmí cieľmi liečiv, viedli k intenzívnemu farmaceutickému záujmu o návrh lepších spôsobov detekcie a skriningu zlúčenín interagujúcich s GPCR. Preto vytvorenie zlepšených testovacich metód je naliehavou požiadavkou na ceste k cieľu rýchlejšieho skriningu a objavovaniu liečiv. Existuje potreba optimalizovať schopnosť detekcie interakcie medzi testovanými zlúčeninami a receptormi, ktorá je základným počiatočným krokom v procese vývojaZlepšené stratégie identifikácie ligandov na urýchlenie charakterizácie všetkých GPCR určia ich fyziologické funkcie azrealizujú ich potenciál pri objavovani nových liečiv. Aj pri identifikovaných GPCR existuje nedostatok objavovaných vysoko selektívnych subtypovo špecifických liečiv afarmaceutické firmy čelia nedostatku slubných tzv. rodičovských molekúl napriek bohatstvu definovaných cieľov liečiv. Zoznam schválení nových liečivových produktov pre prvých dvadsať farmaceutických spoločností vobdobi rokov 1999 - 2001 v porovnaní s predchádzajúcim trojročným obdobím značne klesol (Smith, 2002). Existuje teda reálna potreba zlepšených,praktických testovacich systémov, kde možno testovat a identifikovať nielen endogénneIigandy, ale aj nové .zlúčeniny interagujúce sreceptonni, pričom testovaniea identifikácia sú rýchle a efektívne a sú automatizovateľné.Keďže cestu prenosu signálov potrebnú na aktiváciu oGPCR nemožno predpovedať, je potrebný testovací systém na interagujúce systémy, ktorý je nezávislý od predchádzajúcich predpokladov vsúvislosti s tým, ktorý efektorový systém(napríklad aktivita adenylylcyklázy, PLC, cGMP, fosfodiesterázy) daný receptor využíva. Priraďovanie Iigandov ku GPCR a oGPCR je dôležitou úlohou rôznorodosť Iigandov GPCR aj efektorových systémov však môže obmedzovať vhodnosť niektorých existujúcich testov na identifikáciu Iigandov, čo si vyžaduje nové prístupy k objavovaniuNedávno sa pomocou niekoľkých metód využívajúcich rañnované testovacie systémy testujúce tkanivové extrakty, velké Iigandové knižnice a špecifické zaujímavé ligandy úspešne objavili endogénne ligandy pre niekoľko týchto oGPCR. Také metódy sa spoločne označujú ako reverzná farmakológia (Howard a kol., 2001). Použili sa rôzne metódy na testovanie indukovanej bunkovej aktivity v rámci reakcie na agonistíckú zlúčeninu vrátane testu Fluorescence Imaging Piate Reader (FLlPR,Molecular Devices Corp., Sunnyvale, USA) a Barak a kol., (1997), a patentov USA č. 5,891,646 a 6,110,693, ktoré publikujú použitie jS-arestínového zeleného fluorescenčného fúzneho proteínu na zobrazovanie translokácie arestínu na bunkový povrch pri stimulácii GPCR.Potenciálnymi nevýhodami takýchto metód sú 1) vizualizácia nie je vizualizáciou receptora 2) translokácia proteínu vyžaduje zložité počítačové analytické technológie 3) pred ídentitikovaním agonistu je potrebné uskutočniť skríning antagonistov a 4) nagenerovanie signálu je potrebné špecifické naviazanie na G proteín.Mechanizmy viazania Iigandov a prenosu signálov prostredníctvom GPCR boli tradične modelované na základe predpokladu, že na procese sa zúčastňujú monomérne receptory a monomémy model GPCR bol všeobecne akceptovaný. Od polovice deväťdesiatych rokov však početné správy ukázali oligomerizáciu mnohých GPCR (prehlad napísali George a kol., 2002) ateraz prevláda presvedčenie, že oligomerizácia je inherentným aspektom štruktúry abiológie GPCR. Niektoré receptorové subtypy tiež tvoria heterooligoméry atieto receptory majú funkčné charakteristiky, ktoré sa líšia od homogénnych populácii receptorov. Vsúčasnostištúdie oligomerizácie GPCR nerozlišujú medzi dimérmi a väčšími komplexmi a pojem dimér sa používa zameniteľne spojmami oligomér amultimér. Neexistujú žiadne nezvratné údaje, ktoré by naznačovali, aké velké sú oligoméry funkčných GPCR. Čo je dôležité - tvorba nových vlastností prostredníctvom heterooligomerizácie naznačuje mechanizmus tvorby rôznorodosti funkcií medzi GPCR. Homooligomerízácia GPCR sa prijíma ako univerzálny jav a je známe, že niekoľko GPCR sa zhlukuje vo forme heterooligomeríckých receptorových komplexov (George a kol., 2002). Napríklad receptory GABA-B 1 a GABA-B 2 nie sú funkčné jednotlivo a tvoria funkčný receptor len pri koexpresii (White akol., 1998). Zhiukovanie heterooligomérnych receptorových komplexov môže viesť k novým vlastnostiam z hľadiska viazania receptorov a ligandov,signalizácie alebo medzibunkových prenosov. Napríklad kotransfekcia ~ a öópioidových receptorov viedla ktvorbe oligomérov s funkčnými vlastnosťami, ktoré sa líšili od vlastností každého jednotlivého receptora (George a kol (2000. Interakcia aö-ópioidových receptorov za vzniku oligomérov vytvárala nové farmakologické vlastnosti avlastnosti zhladiska viazania G proteínov. Keď sa - a ö-ópioidové receptory koexprimovali, vysoko selektívni agonisti (DAMGO, DPDPE a morfín) mali zníženú potenciu azmenené poradie, zatial čo niektoré endogénne Iigandy endomorfín-1 a Leu-enkefalin mali zlepšenú afinitu, čo naznačuje tvorbu nového priestoru viazania ligandov (George a kol., 2000). Na rozdiel od individuálne exprimovaných - a ö-ópioidových receptorov koexprimované receptory vykazovali prenos signálov necitlivý na toxín čierneho kašľa pravdepodobne vdôsledku iného subtypu G proteínu. Bolo by preto velmi užitočné mať zhladiska identifikácie potenciálnych cieľov liečiv k dispozícii prostriedok na určenie, či je konkrétny pár GPCRV mnohých správach boli heterooligoméry predbežne identifikované na základe schopnosti koimunoprecipitácie. Ked sa však ukáže, že dva GPCR koimunoprecipitujú,sú dve možné interpretácie, buď receptory priamo fyzicky interagujú, alebo oba interagujú prostredníctvom kontaktu so spoločným tretím proteínom (alebo proteínmi). Alternatívnym prístupom k detekcii receptorových oligomérov bol vývoj testov prenosov energií využitím prenosu bioluminiscenčnej rezonančnej energie (BRET) alebo prenosu fluorescenčnej rezonančnej energie (FRET). Hoci tieto metódy zisťujú prenos energie medzi dvoma receptorowmi molekulami označenými fluorofonni v blízkosti menšej ako 100 angströmov, nie je jasné, či možno spoľahlivo odlíšiť konformačné zmeny od

MPK / Značky

MPK: G01N 33/68

Značky: transmembránových, spôsob, zlúčenín, interagujúcich, proteín, identifikácie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/96-e5392-sposob-identifikacie-transmembranovych-protein-interagujucich-zlucenin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob identifikácie transmembránových proteín interagujúcich zlúčenín</a>

Podobne patenty