Spôsob izolácie faktora VIII

Číslo patentu: 278640

Dátum: 10.12.1997

Autor: Kaersgaard Per

Je ešte 1 strana.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Izolácia faktora VIII gélovou filtráciou spočíva v tom, že objem pridanej plazmy sa rovná aspoň 5 % objemu vrstvy materiálu na filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu na filtráciu gélu za hodinu, pričom ako prostriedok na filtráciu na géli sa použije materiál s časticami, inertnými vzhľadom na faktor VIII s frakcionačným rozmedzím v intervale 1 x 10exp(3) až 1 x 10exp(8). Faktor VIII sa získa vo vysokom výťažku a s vysokou čistotou. Je možné ho spracovať na farmaceutické prostriedky na použitie pri určitých formách krvácavosti typu hemofílií.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu izolácie faktora VllI z telesných tekutín ako plazmy pri použití filtrácie na geli ako prveho izolačného stupňa.Faktor VIIl, známy tiež ako antihemofilický faktor A alebo AHF, je bielkovina plazmy, ktorá sa zúčastňuje vnútomeho mechanizmu zrážania krvi.Faktor VIII je prítomný V krvnej plazme vo veľmi nízkych koncentraciách vo forme nekovalentnćho komplexu dvoch bielkovín s koagulačnou účinnosťou faktora VlII (F aktor VIII C) a s účinnosťou ristocetlnu ako pomocného faktora (z Willebrandovho faktom (vWF),komplex má molekulovú hmotnosť l až 20 x 106.Faktor VIII chýba alebo je ho veľmi málo u osôb, trpiacich na hemofiliu A, ide približne o 5 osôb zo 100000.Faktor von Willenbradov sa viaže na aktivovanć krvně doštičky takým spôsobom, že podporuje zhlukovanie aktivovaných doštičiek. Tento účinok je možne preukázať in vitro zhlukovaním doštičiek indukovaným ristocetínom. Preto je možné pozorovať v prípade Willebrandovej choroby predĺžený čas krvácania V dôsledku toho, že chýba alebo je znížené množstvo Willebrandovho faktora.Chorí, trpiaci na hemoñliu A a s ťažkými príznakmi Willebrandovej choroby, sú dnes liečení koncentrátmi s obsahom faktora VlIl C/vWF, táto liečba zvýši kvalitu ich života a ich práceschopnosť podstatným spôsobom a prispieva tiež k predĺženiu ich života.Farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú faktor VIll (faktor VIIIC a/alebo vWF), je možné získať z krvi alebo z krvnej plazmy. Tieto prostriedky je možné vyrábať rôznym spôsobom, ale vždy je výroba spojená s nízkym výťažkom, hlavne v prípade faktora VIllC. Takmer všetky postupy vyžadujú počiatočné čistenie vrátane kryoprecipitácie, pri tomto čistení sa plazma rozmrazí pri teplote 0 až 4 °C, čím dôjde k vzniku zrazeníny, ktorá obsahuje faktor VllI, ktorý je možné oddeliť napríklad odstredením. I ked ide o pomemc jednoduchý postup, má tento postup veľké nevýhody pri použití vo veľkom meradle, napríklad pri zmesiach plazmy s hmotnosťou viac ako 5 kg poskytuje tento postup nízke výťažky faktora VIIIC (30 až 45 obsahuje V plazme), čo znamená, že konečný výťažok je nízky bez ohľadu na to, aké čistiace postupy sa potom použijú.Okrem toho sa pri výrobe faktora VlII zvyčajne zaraďuje stupeň, pri ktorom dochádza k inaktivácii vírusov. Tieto stupne zvyšujú bezpečnosť použitia týchto prostriedkov, ale vo väčšine prípadov tiež znižujú ešte viac výťažok faktora VIIIC.Celkovo veľmi nízke výťažky faktora VIII viedli k jeho nedostatku v rôznych miestach. Je zrejmé, že by boli potrebné nové postupy na čistenie faktora VllI pre jeho získanie vo väčších množstvách pre potreby hemofilikov.Najvhodnejšie nové metódy na izoláciu faktora VIII by boli priamo z plazmy, vzhľadom na to, že až 70 obsahu tohto faktora v plazme sa stráca v počiatočných stupňoch, t.j. pri kryoprecipitácii alebo ešte pred ňou.V súčasnosti boli vykonávané pokusy izolovať faktor Vlll z plazmy priamo pri použití afinitnej chromatografie podľa publikácie Thromb. Haemost. 61 (2), 234 až 237(1989), bol však dosiahnutý výťažok menej ako 60 a špecifická účinnosť l IU (medzinárodná jednotka) faktora VIII/mg bielkoviny vo frakcií s obsahom faktom VIII.Gélová filtrácia alebo chromatograĺia na géli, pri ktorej zvyčajne dochádza tiež k deleniu podľa veľkosti molekúl, je riadený postup, ktorý sa používa na delenie rozpustených látok podľa ich veľkosti. Rozpustenć materiály sa nechajú prejsť porćznymi časticamí gélu s veľkosťou pórov, vylučujúcou najväčšie molekuly, pričom menšie molekuly difundujú do stacionárnej fázy vnútri častíc gélu. To znamená, že najväčšie častice, celkom vylúčené z gćlových častíc, sa vymývajú ako prve spolu s prázdnym objemom, pričom male molekuly sa vymývajú až po dlhšom čase podľa svojej zmenšujúcej sa veľkosti so zvyšujúcim sa eluačným objemom.Filtráciu na géli je možné vykonávať dvoma rôznymi spôsobmiPri tomto postupe sa rozpustené látky delia do dvoch skupin s veľkým rozdielom v molekulových rozmeroch,jedna z týchto skupín sa vymýva už na začiatku s prázdnym objemom, pričom druha oveľa neskôr v objeme, ktorý často zodpovedá celkovému objemu použitej vrstvy. Tento postup sa používa predovšetkým na delenie bielkovín od rozpustených solí alebo na výmenu pufra a niekedy sa označuje ako odsolenie. Na tento účel sa používajú pevne gély s malým rozmerom pórov a postup je možné vykonávať pri použití veľkého množstva materiálu (objem vzorky môže byť 20 až 30 objemu vrstvy) a veľkých prietokových rýchlostí (približne objem vrstvy za hodinu), kapacita stĺpca je teda vysoká. 2. FrakcionáciaPri tomto postupe sa delia rozpustene látky s podobnou veľkosťou molekúl. Ide často o delenie bielkovín. Na tento účel sa používajú častice gélu s veľkými pónni a materiál na filtráciu gélom sa použije tak, aby bielkoviny boli vymývané medzi prázdnym objemom a objemom, ktorý je rovný celkovému objemu vrstvy. Jednotlivé látky sa vymývajú veľmi blízko seba a môžu sa prekrývať. Vysoká rýchlosť prietoku je nežiaduca, pretože pri nej nedochádza k účinnému deleniu bielkovín a zaťaženie stĺpca má byť malé, aby bolo možné dosiahnuť dostatočné oddelenie jednotlivých bielkovín. Tento postup je preto odporúčaný pri delení bielkovín až ako posledný čistiaci stupeň, v ktorom už objem, v ktorom sa frakcionácia vykonáva, je malý (Jagschics, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, zv. B 3(l 0), 1988 a Bio/Technol., 4, 954 až 958 (1986.Boli vykonané pokusy izolovať faktor Vlll z plazmy pri použití filtrácie na géli podľa J. Lab. Clin. Med., 72(6), 1968, 1007 - 1008 aJ. Clin. Invest. 48, 1969, 957 962. Získal sa veľmi čistý produkt, ale výťažok bol iba 40 až 50 . Zistilo sa, že čistota frakcií s obsahom faktora VIII závisí od východiskovej plazmy tak, že veľký počet chylomikrónov a vysoký obsah lipidov dáva vznik zakaleným frakciám s obsahom faktora VIII s nízkou špecifickou účinnosťou. Tiež sa pozorovalo, že použitý postup gćlovej filtrácie neumožňoval použitie väčších objemov plazmy, i ked predbežné pokusy ukazovali, že by týmto spôsobom bolo možné získať oveľa koncentrovanejšiu Cohnovu frakciu I.Okrem toho sa v publikácii Paulssen a ďalší,Thromb. Diathes. Haemorr. 22, 1969, 577 - 583 uvádza,že faktor VlII by bolo zrejme možné oddeliť od iných plazmatických bielkovín pri použití gélu Sepharose 6 B,ale že by zrejme chromatografiu na geli bolo možnépoužiť vo väčšom meradle len v tom prípade, ak by sa ako východiskový materiál použila zrazenina po kryoprecipitačnom stupni po svojom opätovnom rozpustení.V US patentovom spise č. 3 637 489 sa opisuje postup na delenie krvných zložiek pri použití filtrácie na gěli a poréznych sklenených guličiek. Postup je určený najmä na delenie imunologicky aktívnych materiálov od iných zložiek krvnej plazmy alebo séra.Vykonal sa ešte rad pokusov na použitie filtrácie na gćli na čistenie faktora VIII, ale tieto pokusy sa sústredili na filtráciu čiastočne čistených frakcií plazmy (znova rozpustenej zrazeniny po kiyoprecipitácii a iných čistiacich frakcií). Všetky pokusy boli vykonávané pri použití malého objemu vzorky vzhľadom na objem stĺpca a/alebo malú rýchlosť prietoku alebo pri kombinácii obidvoch týchto opatrení.F iltrácia na géli ako prostriedok na frakcionáciu bielkovín je známa od roku 1959 a je široko využívaná v biochemických výskumných laboratóriách ako postup na zisťovanie vlastností bielkovín a čistenie bielkovín zo vzoriek s malým objemom, napríklad menším ako 1 liter. Až doteraz nebol tento postup používaný vo veľkom meradle na frakcionáciu plazmy alebo delenia bielkovín, jediným použitím bolo odstránenie solí z etanolu a z albumínových roztokov. Uvádza sa napríklad Hlavným dôvodom, prečo sa nestala filtrácia na géli hlavným postupom pri frakcionacii plazmy, je nízky prietok bielkoviny v pomere k objemu st 1 pca ~ J. H. Berglöf Fractionation by gel filtration, str. 163 až 173 V J, M. Curling Methods in Plasma Protein F ractionation, Academic Press, Londýn 1980. lnde sa uvádzaNanešťastie je množstvo bielkoviny, ktoré je možné spracovať pomocou stlpcov s rozumným objemom, malé a nie je možne zanedbať zriedeníe vzorky. Z týchto dôvodov nie je postup príliš využívaný pri frakcionácii plazmy - J. J. Morganthaler a ďalší Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins, str. 127 - 138 v Smit Sibinga a ďalší Plasma fractionation and Blood transfusion, Martinus Nijhoff Publishers, Boston 1985.V US patentovom spise č. 4 675 385 sa opisuje spôsob izolácie faktora VIII (protokoagulačné bielkoviny) z plazmy s obsahom faktora VllI alebo z preparátu plazmy,spôsob izolácie vysokomolekulárnych zložiek a nizkomolekulárnych zložiek postupnou vysoko účinnou chromatografiou tak, že sa v prvom stupni pripraví vo vodnom pufri roztok frakcie plazmy a nízkomolekulárne zložky sa oddelia na chromatogratickom stĺpci vysokotlakovou kvapalinou chromatografiou pri použití častíc materiálu s rozmerom 13 až 35 m, ako eluačnć činidlo sa použije vodný pufer. Aby sa zaistilo dobré oddelenie,odporúča sa použitie stĺpca s pomerom dĺžky k šírke 10 až 40, čo znižuje kapacitu, ale nezaručuje dobrú izoláciu faktom VIII od nízkomolekulárnych zložiek plazmy. Táto prvá izolácia teda nezaistí dobre oddelenie bielkovín s účinnosťou faktom VIIIC od iných bielkovinových zložiek plazmy, toto je možne dosiahnuť iba vykonaním ďalšej vysokotlakovej kvapalinovej chromatograíie.Je teda zrejmé, že až doteraz je všeobecne prijímaná skutočnosť, že filtrácia na gćli nie je vhodným postupom na delenie bielkovín pri frakcionácii plazmy, hlavne v pripade použitia väčších objemov, napríklad nad 5 litrov.V súčasnosti sa neočakávane zistilo, že v prípade, že sa volí materiál na filtráciu na géli z prostriedkov, určených na rýchle prietoky, je možné izolovať faktor VIIIvo forme čistej frakcie a vo veľmi vysokom výťažku priamo z plazmy veľmi šetmým mechanickým delením bez toho, aby bola potrebná zvyčajná počiatočná kryoprecipitácia.Vynález sa týka spôsobu izolácie faktora V 111 vo forme komplexu faktora VIIIC a vWF od iných bielkovín krvnej plazmy pri použití filtrácie na gěli.Spôsob podľa vynálezu spočíva v tom, že sa izolovaná plazma a/alebo čerstvo rozrnrazená plazma podrobí filtrácii na géli za podmienok, zvyčajných na delenie do skupin pri použití veľkého zaťaženia stĺpca a vysokej rýchlosti prietoku,t.j., že objem pridanej plazmy je rovný aspoň 5 objemu vrstvy materiálu na filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu, pričom gelove filtračné prostredie sa volí z častíc, inertných k faktoru VIII s frakcionačným rozmedzím 1 x 103 až 1 x 108, výhodne 1 x 104 až 8 x 107. Frakcionačnć rozmedzie môže byť napríklad 5 x i 04 až 4 x 107.Objem pridanej plazmy je podľa vynálezu aspoň 5 objemu vrstvy v stĺpci, vo výhodnom vyhotovení je objem plazmy 15 až 40 tohto objemu.Spôsob podľa vynálezu sa výhodne vykonáva pri použití rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy za hodinu, obzvlášť výhodne 0,5 až 2 objemy vrstvy za hodinu.Na účely vynálezu má mať prostriedok na filtráciu na géli rigiditu, ktorá umožní rýchlu eluàciu. Okrem toho musí byť použitý gél chemicky a imunologicky inertný vzhľadom na faktor VIII v priebehu filtrácie. Pokusy ukázali, že spôsob podľa vynálezu je možne vykonávať pri použití bežne dodávaných gélov ako sú Sepharose CL-4 B, Sepharose CL-6 B, Sepharose 4 FF, Sepharose 6 FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65 (F) a Matrex Cellufine CGL 2000, Všetky tieto prostriedky je možné použiť na účely vynálezu. Tieto typy gélov majú zvyčajne za vlhka veľkosť častíc V rozmedzí 32 až 200 m.Podľa jedného vyhotovenia spôsobu podľa vynálezu sa zmrazená plazma nechá rozmraziť a zaistí sa rozpustenie všetkého množstva faktora VIII, načo sa plazma výhodne nanesie na stĺpec bezprostredne po rozpustení všetkého množstva faktora VIII. Výhodne sa nenechá teplota vystúpiť príliš vysoko, aby nedošlo k príliš velkej degradácii faktora VIII. Plazmu je možne predbežne spracovávať napríklad pridaním heparínu, citrátu, sacharózy, aminokyselín, solí alebo iných stabilizátorov a prípadne sfiltrovať, odstrediť, zahustiť ultraíiltráciou, vopred zrážať pri použití bežných zrážaclch činidiel alebo vopred spracovávať iným spôsobom pred nanesením na stĺpec, pokial toto spracovanie nemá podstamý vplyv na obsah faktora VIII V plazme.Neočakávane sa zistilo, že spôsob podľa vynálezu poskytuje veľmi vysoké výťažky faktora VIII. Je možné získať viac ako 70 pôvodného obsahu faktora VIII v planne, okrem toho metóda poskytuje veľmi čisté produkty so špecifickou účinnosťou l až 4 1 U faktora VIII C/mg bielkoviny. Túto skutočnosť je možné čiastočne vysvetliť tým, že spôsobom podľa vynálezu je faktor VIII izolovaný tiež od proteolytických enzýmov, ktoré za zvyčajných okolností spôsobujú pokles obsahu faktora VIIIC už v skorých štádiách izolácie.Spôsob podľa vynálezu umožňuje spracovanie veľkých objemov plazmy tak, že je možné naniesť veľké množstvo naraz pri vysokej rýchlosti prietoku pri vysokom výťažku a tiež vysokej čistote. Ide teda o veľmi účinný postup, ktorý je možné priemyselne využiť.Frakcie z filtrácie na géli, ktore obsahujú faktor VIII alebo spojene frakcie z väčšieho množstva tiltráciou je potom možné koncentrovať a ďalej čistiť pri použití známych postupov ako sú ultrañltrácía, zrážanie, iónomeničové postupy, afinitná Chromatografia a podobne.Zvyšné plazmatické bielkoviny ako albumín, imunoglobuliny, komplex protrombinu, antitrombin III a ďalšie je možno rovnako izolovať z ďalších frakcií filtrácie na géli pri použití známych postupov ako sú zrážanie alkoholom, zrážanie polyetylénglykolom, Chromatograñou a podobne.Stanovenie účinnosti faktora VIIIC je možno vykonávať ako jednostupñove alebo dvojstupňové. Je známe,že každý z týchto postupov môže poskytovať trochu odlišné výsledky v tej istej vzorke. Okrem toho je známe, že pri opakovanom stanovení rovnakým spôsobom môže rovnako dôjsť k určitému rozptylu nameraných hodnôt pre účinnosť faktora VIIIC.Pod pojmom plazma sa v priebehu prihlášky rozumie krv, z ktorej boli odstránené všetky druhy krviniek a krvnć doštičky napríklad odstredením.Pod pojmom faktor VlllzAg sa chápe antigěn,vzťahujúci sa k faktoru VIII a vWF-Ag je zodpovedajúci antigćn pre Willebrandov faktor.Pod pojmom objem vrstvy sa chápe objem vrstvy použitého gélu v naplnenom stlpci spolu s objemom kvapalného prostredia, ktoré táto vrstva obsahuje. Prázdny objem je definovaný ako objem pufra medzi časticami gélu, eluačný objem je objem pufra, použitého na eluáciu špecifického materiálu. Pod pojmom zaťaženie stĺpca sa chápe objem materiálu, nanesenćho na stĺpec, prepočítaný na objem vrstvy a uvedený v percentách. Pod pojmom frakcionačnć rozmedzie sa chápe rozmedzie molekulových hmotnosti (globulámych) bielkovín alebo väčších molekúl, pre ktoré je gél odporučený výrobcom.Prehľad obrázkov na výkresochSpôsob podľa vynálezu bude ďalej vysvetlený s prihliadnutím k priloženým výkresorn, ktoré rovnako ako príklady slúžia na objasnenie spôsobu podľa vynálezu.Na obr. l je znázomený graf, ktorý ilustruje eluáciu faktora VIII pri filtrácii na gćli spôsobom podľa vynálezu pri stanovení rôznym spôsobom.Na obr. 2 je znázornené poradie eluácie rôznych bielkovín plazmy pri ñltrácii na géli spôsobom podľa vynálezu.Príklad 1 Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora VIIIStĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose CL-4 B do výšky 60 cm.Zmrazená plazma z dánskej krvnej banky bola rozmrazená pri teplote 25 C vo vodnom kúpeli. Potom sa pridalo l IU heparínu/ml, 50 ml (16 objemu vrstvy) plazmy bolo nanesenć na stlpec, rýchlosť prietoku bola 100 m 1 za hodinu, a potom bol stĺpec vymývaný podtlakom množstvom 200 ml pufra za hodinu, čo zodpovedá rýchlosti 0,63 objemu vrstvy za hodinu. Dosiahnutie rovnovážneho stavu a eluácia boli vykonávané pri použití pufra (0,02 M citrát, 0,15 M NaCl, pH 7,4). K pufru bolo ďalej pridaných 2,55 ml 1 M CaCl 2 na liter,to znamená, koncentráciu voľných vápenatých iónov približne 7 x l 05 M. Koncentrácia voľných vápenatých iónov bola overená použitím elektródy, selektivne citlivej na Vápnik (Ingold GmbH, Frankfurt nad Mohanom,SRN). Boli odoberane frakcie a na každú frakciu bolo stanovené ODZSO, množstvo faktora VIIIC (pri použití jednostupňovej koagulácie i dvojsmpňověho Chromogénneho stanovenia), faktor VlllzAg albumín, IgG, fibrinogćn, IgM, a-2-makroglobulín, faktor IX, faktor X,bielkovina C a antitrombín III. Bielkovina, meraná pri 0 D 280, bola vymývaná pri prázdnom objeme (frakcia 10 až 18), potom nasledoval veľký a široký vrchol(frakcia 19 až 50, obr. l). Dvojstupňovou chromogénnou skúškou sa zistilo 82 faktoru VIIIC, jednostupňovou koagulačnou skúškou 91 faktoru VIIIC, a to v jedinom vrchole spoločne s malým vrcholom pre bielkoviny. Zvyšok faktora VII bol vymytý ako malý následný vrchol bezprostredne po hlavnej frakcii (frakcie l 9 až 25). Faktory VlllzAg a vWFAg boli vymyté spoločne s faktorom VIIIC, ale mali širšie následne vrcholy. Všetky ostatne bielkoviny plazmy, ktore boli stanovené, boli vymyte vo frakcii, nasledujúcej po frakcii s obsahom faktora VIII spolu s veľkým a širokým vrcholom na bielkoviny, ako je znázomene na obr. 2. Plazmatické bielkoviny, ktoré boli oddelené od faktora VIIIC, mali nasledujúce molekulové hmotnostiStanovenie účinnosti faktora VIIIC pri použití dvojstupňovej chromogénnej skúšky bolo vykonané pri použití chromogćnneho substrátu (KAB 1 Coatest Factor VIII), pôvodná metóda s použitím skúmaviek bola modiñkovaná tak, aby bolo možné použiť mikrotitračné platne pri nižšom množstve reakčných zložiek. Skúška sa vykonáva pri 37 °C. Použije sa vzorka s objemom 50 l alebo štandard s tým istým objemom, po premiešaní so 75 l roztoku fosfolipidu, faktora lXa, faktora X a CaClz sa zmes inkubuje pri 37 °C na 15 minút, potom sa pridá 50 l substrátu. Po ďalších 20 minútach inkubácie pri 37 °C sa reakcia zastaví pridaním 50 l lM kyseliny citrónovej, Vmiknute zafarbenie sa odpočíta pri 405 nm, kontrola pri 492 nm.Stanovenie účinnosti faktora VIIIC jednostupňovým spôsobom sa vykonáva pri použití metódy APTT(Activated Partia Thromboplastin Time). 100 l vzorky alebo štandardu sa napipetuje do kyvety, potom sa pridá 100 l deñcientnej plazmy (chudobnej na faktor VIII,General Diagnostic) a roztok sa uloží do termostatu pri 37 C na 5 minút. Potom sa pridá 100 l 0,03 M chloridu vápenatćho a stanoví sa čas do vzniku koagulácie.Na kvantitatívne stanovenie bolí pripravené kalibračne krivky na základe zrieďovacíeho radu vnútomćho štandardu proti štandardu WHO (3. medzinárodný štandard F VIII, ľudská plazma, 3,9 IU/Ml). Dvojstupňováskúška má približne 10 x nižšiu medzu detekcie ako skúška jednostupňová. V prípade pridania heparínu je vhodné použiť dvojstupňovú skúšku vzhľadom na to, že je možné ľahko riedením vylúčiť akýkoľvek prípadný vplyv heparínu.Faktor VlllzAg bol stanovený pri použití skúšky ELISA s použitím protilátok chorého s inhibítorom faktom VIII ako povlaku na mikrotítračných platniach (Nunc,Kamstrup, 4000 Roskilde, Dánsko) a pri použití fragmentov F(AB)2, značených peroxidázou z toho istého chorého na stanovenie viazaného faktora VIII (Thromb. Haemost., 53 (3), 1985, 346 - 350. Štandardné krivky boli pripravené s použitím zmesí normálnej plazmy, kalibrovanej proti štandardu WHO (1. IRP, 1982).Faktor vwFzAg bol rovnako stanovený pri použití skúšky ELISA, ale pri použití králičej protilátky proti ľudskému VWF (DAKO, Dánsko) ako povlaku a peroxidázou značcnej králičej protilátky proti ľudskému VWF(DAKO, Dánsko) kvôli stanoveniu víazaného VWF. Štandardné krivky sa získali pri použití tej istej normálnej plazmy ako v prípade skúšky ELISA na faktor VlllrAg.Faktor 1 X bol stanovený pomocou jednostupňovejkoagulačnej skúšky podobným spôsobom ako faktor VIIIC s tým rozdielom, že bola použitá plazma, deficientná na faktor 1 X. IgG bol stanovený pomocou radiálnej imunodifúzie (lmmunochemistry, 2, 1965, 235 - 254) a albumín, fibrinogén, a-Z-makroglobulln, faktor X, bielkovina C a antitrombin III boli stanovené pomocou špeciálnej imunoelektroforézy (Anal. Biochem. 15, 1966,45 - 52). DDR 0 bola stanovená pri použití spektrofotometra (Spectronic 601, Milron Roy Company) a bielkoviny pomocou Kjeldahlovej skúšky boli stanovené podľa Ph. Eur., 2. vydanie, l, zv. 3.5.2 bez zrážania TCA. Špecifické účinnosti čistených frakcíí sa vypočítali ako pomer koncentrácie faktora VIIIC bud k ODZSO alebo ku koncentrácii bielkoviny Kjeldahlovou metódou. Pri použití OD 280 na vypočítanie špecifickej účinnosti nie sú výsledky rôznych pokusov priamo porovnateľné vzhľ dom na to, že frakcie, obsahujúce faktor VIII, sú často zakalenć, ako je uvedené tiež v publikácii Ratnoff a ďalší,J. Clin. Invest. 48, 1969, 957 - 962.Rôzne prostriedky na filtráciu na géli sa ziskali od nasledujúcich firiem Sepharose CL-6 B, Sepharose CL-4 B, Sepharose CL-ZB, Sepharose 6 FF, Sepharose 4 FF,Sephacryl S-400 a Sephacryl S-500 boli získané od Pharmacia (Hillerod, Dánsko), Biogél, A-5 m, Fine bol získaný od BioRad (Bie a Bemtsen, Rodovre, Dánsko),Fractogel TSK HW-65 (F) bol získaný od Merck(Struers, Rodovre, Dánsko) a Matrex Cellufine GCL 2000 bol získaný od Amicon (Helsingborg, Švédsko).Príklad 2 Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktom VIII pri použití rôznych prostriedkov na filtráciu na géliStlpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený rôznymi prostriedkami na filtráciu na géli s rôznym rozmedzím frakcionácie a rôznou štruktúrou. Vo všetkých prípadoch bola konečná výška náplne 60 cm. Plazma bola rozmrazená rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a bola pridaná l 1 U heparinu na m 1. Pri použití každého prostriedku na filtráciu bolo na stĺpec nanesené 50 ml plazmy, t.j. 16 vrstva. Zaťaženie stĺpca a eluácia pufrom boli vykonávané podľa príkladu l. Prietoky boli vo všetkých prípadoch rovnake ako v príklade l s výnimkou použitia prostriedku Biogel A-5 m, kde bola rýchlosť prietoku znížená na 50ml za hodinu vůiľadom na zvýšený spätný tlak. Frakcie sa zhromažďovali a na každú frakciu bola stanovená hodnota OD 280 a faktor VIIIC pri použití prostriedku Coatest. Špecifické účinnosť hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII bola vypočítaná ako pomer množstva faktora VIIIC/ml k 0 D 280. Pokusy sa opakovali n-krát pri použití rôznych druhov plazmy V každom jednotlivom prípade a boli vypočítaná priememe hodnoty pre výťažky a pre špecifickú účinnosť. Hlavná frakcia s obsahom faktora VIII bola oddelená rovnakým spôsobom ako v príklade l a výťažok bol stanovený ako obsah faktora VIIIC v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII v percentách obsahu faktora VIIIC v spracovávanej plazme.Frakcionačné rozmedzie a rozmery častíc na rôzne prostredie a na filtráciu na géli spolu s priememými hodnotami pre výťažok a špecifickú účinnosť sú uvedené v tabuľke l.Pre jednotlivé materiály sú v tabuľke l použité nasledujúce skratky A Sepharose Cl-6 B B Sepharose CL-4 B,C. Sepharose Cl-ZB D Sepharose 6 FF E Sepharose 4 FF F Sephacryl S-500 G Biogel A-5 m Fine H Fractogel TSK HW-65 (F) l Matrex Cellufine GCL 2000 J Sephacryl S-400Prostriedok Frakcionaůié Priemer pre llltràciu mzmedzie Počet výťažok Špeclf. mu na géli mal. hmotnosti pokusov 36 účinnosť vlak umPríklad 3 Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora VIII pri použití rôzneho zaťaženia stĺpcaStĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4 FF do konečnej výšky vrstvy 60 cm. Plazma bola rozmrazená spôsobom podľa príkladu l. Po rozmrazení bolo pH plazmy upravené na 7,0 pridaním 0,5 M HCI, bola pridaná 1 IU heparínu na ml a plazma bola sfiltrovaná cez filter s priemerom otvorov 10 m z nylonu. Na stĺpec bolo nanesených 30, 40, 50, 60 a 70 ml plazmy. Použili sa podmienky z príkladu l s tým rozdielom, že pH pufra bolo upravené na 7,0. Odoberali sa frakcie a na každú frakciu bolo stanovené ODZRO a množstvo faktora VIIIC (Coatest). Speciñcká účinnosť faktora VIII V hlavnej frakcii bola stanovená ako pomer faktora VIIIC/ml k hodnote 0 D 280. Pokusy boli trikrát zopakované pri použití troch rôznych vzoriek plazmy,

MPK / Značky

MPK: A61K 35/16, A61K 38/37

Značky: izolácie, faktora, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/9-278640-sposob-izolacie-faktora-viii.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob izolácie faktora VIII</a>

Podobne patenty