Rekombinované plazmidy Escherichia coli obsahujúce tieto plazmidy

Je ešte 1 strana.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Rekombinované plazmidy kódujú syntézu G-penicilín amidázy, ich deriváty vzniknú deléciou nekódujúcich oblastí a sú odvodené od základných plazmidov pACY184 a pBR322, ktoré sú označené pAA1, pAA6, pBA4 a pBA6. Kmeň mikroorganizmu Escherichia coli CCM 4228 obsahuje niektorý z uvedených rekombinovaných plazmidov a môže byť využitý ako zdroj enzýmu na prípravu 6-aminopenicilánovej kyseliny (6-APK) z G-penicilínu alebo 7-aminodeacetoxycefalosporánovej kyseliny (7-ADCK) z deacetoxycefalosporínu G.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka rekombinovanýeh plaanidov pAAl,pAA 6, pBA 4, pBA 6 a ich derivátov nesúcich gén pre G-penicilín amidázu a kmeňov mikroorganizmu Escherichia coli CCM 4228 (pAAl), CCM 4228 (pAAó), CCMJe zname, že niektoré kmene mikroorganinnov, obzvlášť z rodov Escherichia, Proteus a Bacillus, napr. kmene Escherichia coli CCM 2843 a CCM 3759 získané podľa čs. autorských osvedčení č. 188 631 a č. 244343,produkujú enzýrn G-penicilín amidàzu hydrolyzujúci amidovú vazbu G-penicilínu (benzylpenicilín) na ó-aminopenicilártovú kyselinu (ďalej len ó-APK), prípadne amidovú väzbu deacetoxycefhlosporínu G (N-fenylacetyl-7-aminodeacetoxycefalosporánovej kyseliny) na 7-aminodeacetoxycefalosporánovú kyselinu (ďalej len 7-ADCK).spomenuté kmene Escherichia coli CCM 2843 a CCM 3759, ktoré sú predmetom priemyselnej ochrany,boli principiálne odvodené postupom selekcie a nahromaďovania spontànnych alebo indukovaných mutantných kmeňov podľa čs. autorského osvedčenia č, 162 274. Základné vlastnosti týchto mutantných kmeňov vo vzťahu k biosyntéze a substràtovej špeciñke G-penicilin amídázy boli publikované (Vojtíšek a Vaněk, In Overproduction of Microbial Metabolites. Strain Irnprovement and process Control Strategies, pp. 183-212, Butterworth Publischers, Boston, Massachussets, 1986). Ide o regulačná mutanty, a to tak na úrovni geneticky podmienených zmien syntézy G-pe-nicilín amidázy, ako na úrovni zmien aktivity tohto enzýmu (mutanty hyperinducibilné, konštitutívne, rezistentnć ku katabolickej represii a so zmenenou alebo rozšírenou substrátovou špeciñkou.V odbomej literatúre bol opisaný prenos chromozómovo kódovanej ínfonnácie pre syntézu G-penicilin arnidázy (ďalej len PAG) na plaunidovú alebo fágovú molekulu v pripade niekoľkých PAG štrukturálnych génov získaných z mikroorganizmov rodu Escherichia(Mayer et al., ln KN. Timrnis a A. Puhler (eds), Plasmid of medical, environment and commercial importance, pp 469-470, Elsevier I North Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1979, 0 h et al., Gene 56, 87-92,1987) rodu Proteus (Daumy et al., lBacteriol. 163, 925936, 1985) rodu Arthrobacter (Ohashi et al., Appl. Enviromn. Microbiol., pp 2603,-2615, 1988) rodu Bacillus(Meevootisom a Saunders, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 372-386, 1987) a rodu K.1 uyvera(Garcia a Buess. J. Biotechnol.3, 187-199, 1986). Vo všetkých uvedených prácach boli ako hostiteľské mikroorganizmy pre rekombinované plazmidy použité kmene Escherichia coli,ktoré neniesli genetickú infonnáciu pre PAG. Vo všetkých prípadoch viedlo klonovanie PAG génov k zvýšeniu syntézy PAG v porovnani s produkciou východiskových mihoorganizmov a v niektorých prípadoch bola zmenená regulácia syntézy tohto enzýmu (konštitutivna syntézu, mena v citlivosti na katabolicků represiu aPodstatou vynalezu sú rekombinované plazmidy pAAl, pAAó, pBA 4 a pBA 6 a ich deriváty vznikajúce deléciou nekódujúcich oblastí, kódujúce syntézu G-penicilln amidázy, charakterizovanej vloženým fragmentom DNA loneňa Escherichia coli s veľkosťou 10,8 kb v prípade pAAl, 3,9 kb v prípade pAAó, 3,9 kb v pripade pBA 4 a 2,9 kb v pripade pBAó a reštrikčnou mapou znázomenou na obr. 1, obr.2, obr.3 a obr.4. Ďalej sú podstatou vynálau kmene Escherichia coli obsahujúce plazmidy pAAl, pAAó, pBA 4 a pBA 6 a ich deriváty miiknuté deléciou nekódujúcich oblasti,uložené v zbierke mikroorganianov Vlikrobiologického ústavu ČSAV v Prahe pod označením CCM 4223Rekombinované plazmidy pAA 1, pAA 6, pBA 4 a pBAó boli pripravené s cieľom získať kmene s vysokou produkciou tohto priemyselne významného enzýmu spôsobom molekulámeho klonovania PAG génu do vhodných vektorov, hlavne do plazmidov pACYC 184 a pBR 322. Po prenose do vhodných recipientných kmeňov rodu Escherichia, hlavne do kmeňa Escherichia coli RE nesúceho naviac chromozomálne determinevaný PAG gén, boli v mačnom počte kópií transkribovane, takže došlo k sumácii produkcie PAG génov chromozomálne a extrachromozomálne determinovaných.Recipientný kmeň Escherichia coli RE 3, odvodený od kmeňa Escherichia coli CCM 3759, ktorý reprezentuje jeden z regulačných hyperinducibihiých mulantov citovaných v opise predmetu vynálem, bol zbavený(vyliečený) väčšieho z 2 extrachromozomàlnych DNI( elementov s veľkosťou viac než 30 kb. Existovala domnienka, že väčší z oboch elementov nesie genetickú informáciu pre pseudolysogénny bakteriofág, čo sa potvrdilo po ožiarení pôvodného kmeňa E. coli CCM 3759 (pracovne označeného RK 4) UV svetlom, ktoré viedlo k nereprodukovateľným krivkám počtu prežívajúcich buniek, čo bude doložené v príkladoch uskutočnenia. Táto skutočnosť zrejme viedla k občasným a nereprodukovateľným lýzam bunkovej populácie v prevàdzkovom meradle čs. farmaceutického priemyslu,ktorý doteraz tento pôvodný kmeň RK 4 na výrobu používa. Na zbavenie buniek jedneho z extrachromozomálnych elementov (30 kb) bola použitá kombinácia 2 eliminačirých faktorov subletálne pôsobenie koncentrácie etidiumbromidu (ďalej len EtBr) na bunky počas rastu a zvýšenia teploty (44 °C). Postup je taktiež uvedený v príkladoch uskutočnenia predmetného vynálezu. Tento kmeň Escherichia coli RE 3 bol jednak pouütý na izoláciu chromozómovej DNI( (priprava génovej banky). taktiež aj na transfonnáciu rekombinovanými plannidmi, ktoré boli získanie postupom podľa vynále zu a ktorých spôsob prípravy je taktiež uvedených v príkladoch uskutočnenia.Okrem toho boli použité iné recipientné kmene Escherichia coli (MC 1000, HB 101, Sambrook et al.,Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs. Press., 2 Edition 1989) na transfonnáciu spomínanýrni rekombinovanými plazmidrrti, ktoré neuiesli chromozomálne detennínovaný PAG gén.Ako východiskovć vektory na pripravu rekombinovaných plazmidov boli použité dva základné plazrnidy, SK 278107 B 6a to pACYC 184 (Chang a Cohen J. Bactetriol. 134,1141-1156, 1978) a pBR 322 (Bolívar et al., Gene 2, 95-113, 1977). východiskový plazmid pACYC 184 má 4,0 kb, nesie gény determinujúce reüstenciu na antibiotika,Iej len NIPAB), kde stykom s povrchom kolónií dochádza k enzýmovej hydrolýre amidovej väzby NIPAB za tvorby intenzívne žltej Z-nitro-S-aminobenzoovej kyseliny ako produktu enzýmovej reakcie. Podrobnýchloramfenikol (Cm) a tetracyklín (Tc). Východiskový 5 postup je uvedený v príkladoch uskutočnenia. plazmid pBR 332 má 4,3 kb, nesie gény determinujúce Množstvo G-penicilín amidázy v bunkách bolo urrezistenciu na antibiotika arnpici 1 ínu(Amp) a tetracyk- čované meraním počiatočnej rýchlosti hydrolýzy pelínu (Tc). Princíp selekcie transformovaných buniek E. nicilínu G v 0,05 M fosfátovom pufri s pH 8,0 pri ooli plazmidom pACYC 184 spočíva v raste na pevných teplote 37 °C v oblasti kinetiky nultého rádu. Produkt živných médiách obsahujúcich tetracyklirt ako selekčný 10 reakcie, 6-APK, bol stanovený spektofotometricky za faktor, pretože PAG gén bol inzertovaný do tohto plaz- použitia p-dimetylarninobenzaldehydu (Balasinghan et midu na miesto zodpovedné u rezistenciu na chlomm- al. Biochim. Biophys. Acta 276, 250-260, 1972). Jedna fenikol. Rekombinovanć plazrnidy obsiahnuté v trans- jednotka (U) je také množstvo enzýmu, ktoré zodpoveformovaných bankách E. coli nesú teda rezistenciu len dá tvorbe jedného mikromólu ó-APK za l minútu. na tetmcyklín. V druhom prípade, pri použití plazmidu 15 špecifická aktivita je definovaná ako U.g suchej pBR 322, spočíva selekcia kmeňov na pevných živných hmoty. pódach obsahujúcich tetracyklln, pretože PAG gén je in- Predmetne kmeň Escherichia ooli CCM 4228 je zertovaný na miesto zodpovedné m rezistenciu na am- použiteľný pre enzýmovú hydrolýzu penícilínu G na 6 picilin. Rekombinované plazmidy obsiahnuté v trans- APK samotný alebo obsahujúci rekombinovaný plazfonnútorových klonoch teda stratili rezitenciu na ampi- 20 mid pAA 6, pBA 4 alebo pBA 6 a ich deriváty. Výhodne cilln, a preto nerastú na pevných živných pôdach obsa- je možné tento kmeň využít ako východiskový zdroj na hujúcich ampicilín. výrobu imobilizovaných celých buniek, ich častí po Na pripravu kompetentných buniek recipientných dezintegrácii, alebo je možné ho využiť na izoláciu sukmeñov, prípravu rekombinovaných plazrnidov a ich rového enzýmu a jeho následnú imobilizáciu. derivátov odvodených od vektorov pACYC 184 či 25 V nasledujúcom prehľade sú zhmutć základné pBR 322 a delenie molekúl DNK pomocou horimntálnej vlastností kmeňov Escherichia coli trnnsfonnovaných elektroforćzy v agarovom doskovitom géli boli použité rôznymi získanými plazmidmi v porovnaní s rodičovmetódy podľa Sambrook et al., (Molecular Cloning. A ským kmeňom. Uvedené kmene boli kultivovane v 500 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Labs. Press. ml vamých bankách so 100 ml pôdy na rotačnom tre 2 Edition 1989). Transformácia hostiteľských kmeňov 30 pacom stroji pri 30 °C. Kultivácia bola skončené vždy bola uskutočnení podľa Hanahan (J. Mol. Biol. 166, na začiatku stacionámej fázy rastu a prebiehala bud v 557-580, 1983) a izolácia chromozlómovej DNI( výcho- pôde LB (Luria Broth, 1 Trypton, 0,5 kvasnicový diskového kmeňa metodou podľa Au a Tso (Proc. Natl. extrakt, 0,5 NaCl, pH 7,2-7,4) v prítomnosti či neAcad. Sci. 86, 5507-5511, 1989). prítomnosti 0,1 fenyloctovej kyseliny (FOK) ako inNa vyhľadávanie klonov obsahujúcich po transfor- 35 duktora PAG, alebo v minerálnej pôde (zloženie 0,3 mácii rekombinované plazmidy nesúce PAG gén bola FOK vo fonne arnónnej soli, 1,46 N.2 HP 04 . použitá moditikovana metóda (Zhang et al., Analyt. 121-120, 0,3 KHzP 04, 0,05 NaCl, 0,1 NH 4 C 1,Biochern. 156, 413-416, 1986) mloženej na detekcii en- 0,025 MgSO 4 . 711 m, 0,0015 CaClg, 0,02 zýmovo aktívnych kolónii pomocou bezfarebného sub- kvusnicový extrakt, pH 7,2. strátu 2-nitro-5-fenylacetamidobenzoovej kyseliny (ďa- 40 Kmeň špecmcxá aktivita n srhertchla voli. tLçv guçąçg hmoty žtvnâ pôda komplexná (1.31 mi nerál induktor (FOX) - -L Rxq rccn 31501 115 - 400 R 33 125 55 450 u 10. rpnn o - sa ro pan 41 - HE to 193114 so so sa in (FBPC) 15 ao HC 1000 (plus) qa 53 PS 3 (FIRE) tu 5 4.50 ua (pin-n - - so» area (p 5 A 61 - 55.,Plaznldy veľkosť chronozómcvého fraqnentu celkováPrehľad ob rázkov na výkresochNa pripojených obrázkoch je na obr.l znazomený rekombinovaný plazmid pAAl nesúci gén pre G-penicilin amidázxr. Veľkosť plazmidu je 14,8 kb. Klonovaný fragment DNK (10,8 kb) je vyznačený dvojitou čiarou. 0 br.2 predstavuje rekombinovaný plazmid pAAó nesúci gén pre G-penicilín amidám. Veľkosť plazmidu je 10,6 kb. Klonovaný Eragment DNK (3,9 kb) je vymačený dvojitou čiarou. Na obr.3 je znazomený rekombinovaný plazmid pBA 4 nesúci gén pre G-penicilín amidázu. Veľkosť plazrnidu je 7,9 kb. Klonovaný ťragment DNK (3,9 kb) je vyznačený dvojitou čiarou. 0 br.4 predstavuje rekombinovaný plaanid pBAó nesúci gén pre G-penicilin amidázu. Veľkosť plaznidu je 6,6 kb. Klonovaný fragment DNK (2,9 kb) je vyznačený dvojitou čiarou.Ďalej je vynález doložený príkladmi uskutočnenia bez toho, aby sa nimi obmedzoval.Rodičovský kmeň Escherichia coli (CCM 3759) obsahujúci dva mimochromozómovć elementy (jeden nízkomolekulàrny s veľkosťou 5 kb a druhý vysokomolekulámy s veľkosťou viac než 30 kb) bol kultivovaný v 100 m bankách s 20 m 1 LB pôdy (Luria Broth, l Trypton,0,5 kvasnicový extrakt, 0,25 NaCl, pH 7,2-7,4) doplnenćho EtBr s fmalnou koncentráciou 2.10 M na rotačnom trepaoom stroji pri teplote 44 °C. Po náraste biomasy do neskorej exponenciálnej fázy rastu sa 0,5 m kultúry použilo ako inokulum na ďalšiu kultiváciu. Celkovo boli uskutočnené týmto wôsobom za rovnakých podmienok tn následné kultivácie (pasàže), pričom v prvej z nich kultúra rástla počas 48 hodin nižšou špeciñckou rastovou rýchlosťou (), v ďalších dvoch posáüeh ukončených po 24 hodinách bola rastova rýchlosť vyššia. Počas pasáží nedošlo k zvýšeniu minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) EtBr. Z každej pasàže po vysiatí na pevnú pôdu LB ( s 1,5 agaru) sa vybral z narastených kolónii súbor 24 monokolóniových izolátov,v pripade ktorých bola detekovaná prítomnosť mimochromozómovej DNK metódou podľa Bimboim a Doly(Methode in Enzymology 100, 243-254, Grosman a Moldave (eds), Acad. Press N.Y., 1983). Po 3. pasáži bola v prípade 8 izolútov zistena nepritomnosť vysokomolekulámeho elementu, pričom in z nich si túto vlastnosť zachovali aj po niekoľkých nasledujúcich pasážach v tekutej LB pôde. Jeden z týchto kmeňov bol označený ako RE 3.Premyté bunkové suspenzie kmeňov RK 4 a RE 3 kultúr zo Stacionárnej fázy rastu v LB pôde boli ožiarenč UV svetlom v dávkach od 20 do 200 Jim. Podiel preživajúciclr buniek klesal zo 100 (pri dávke 20 Mint) na hodnotu rádovo 0,0 l (pre dávku 200 J/mj). Kmeň RE 3 bol mierne citlivejšl na UV v porovnaní s rodičovským kmeňom RK 4, rozdielna bola však reprodukovateľnosť krivky preživajúcich buniek v závislosti od dávky UV žiarenia. Tá bola v prípade kmeňa RE 3 dosialmutá v plnej miere, zatiaľ čo v pripade kmeňa RK 4 neboli výsledky reprodukovateľne. V pripade buniek rodičovského kmeňa i ziskaného kmeňa RE 3, premytých 0,l M fosfátovým pufmm v pH 8,0 (centrifugácia pri 10000 otáčkachhnin, 5 minút), bola stanovená aktivita PAG s výsledkami, ako sú uvedené v tabuľke v opise vynálezu.Bola vykonaná imlácia chromozčmovej DNK z buniek kmeňa E. coli RE 3. Zmrazené bunky, získané kultiváciou v 100 ml LB pôdy, boli suspendované v 7,5 ml LP pufru (0,05 M TRIS-HCI 1 glukóza 10 mM EDTA, pH 8,0) obsahujúcom lyzozým v koncentrácii 2 mglml. Po 35 minútach pôsobenia pri 4 °C bolo pridané 2,5 ml pufru CLP (40 mM EDTA 0,2 M TRISHCI pH 8,0) obsahujúceho 2 dodecylsulfátu sodnćho (SDS) a proteinazu l( (2,5 mglml) a zmes bola ponechanà 80 minút pri teplote 37 °C. Vytvorený čistý lyzát bol 3 x extrahovaný rovnakým objemom fenolu a 2 x rovnakým objemom chlorofomiu. Vodná fáza obsahujúca DNK bola dialyzovana cez noc pri teplote 4 °C proti roztoku SSC (0,15 M NaCl, 15 mM citrat sodný). Po dialýze bola k roztoku DNK pridaná RNàza A (100 g) a roztok bol inkubovaný l lfl hodiny pri teplote 37 °C. Nasledovalo pridanie ll 3 objemu roztoku CLP s 25 mg proteinázy K/rnl a inkubácia počas 4 hodin pri teplote 37 °C. DNK bola potom extrahovana 2 x fenolom, 1 x chlorofonnom a 3 x éterizovaná. Po precipitácii v etanole bola DNK natočené na tyčinku a cez noc dialyzovaná proti TE pufru (10 mM TRIS-HCI l mM EDTA pH 8,0). Takto pripravená chromozómová DNK bola úplne štiepená reštrikčnou endonukleázou Eco RI a vzniknutú ľragmenty elektroforeticky rozdelené podľa veľkosti v agarovom horizonámom géli. Časť gélu s fragmentami DNK (s veľkosťou 3 až 12 kb) bola z gélu vyrezaná a metódou elektroelůcie(Elektroelutor UEA, Operatoťs manual, Int. Biotechnologies, Inc., CT, USA) z nej boli tragmenty uvoľnené a purifikované extrakciou zmesi fenol-chlorofonn. Po precipitácii fragmentov etanolom bola DNK rozpustená v TE pufri. Na klonovanie sa použil vektor pACYCl 84 linearizovaný Eco RI a defosforylovaný alkalickou fosfatázou (ClP). Ligačna zmes s celkovým objemom 20 l obsahovala 100 mg vektorovej DNK, 50 ng cliromozómových fragmentov, 25 mo TRIS-HCILigácia prebiehala 4 hodiny pri 24 °C. Po ukončení reakcie bola DNK použitá na transformáciu kompetentných buniek Escherichia coli HB 101 pripravených podľa Hanahan (J. Mol. Biol. 166, 557-580, 1983). Suspenzia buniek bola po transformácii vysiata na pevnú pôdu SOB (2 Trypton 0,5 yeast extrakt 10 mM NaCl 2,5 M KCl 10 mM MgS 04) obsahujúca 10 pg/ml tetracyklinu. Po 24 hodinovej inkubácii pri 37 °C boli medzi narastenými kolóniarni detekované rekombinované transfonnanty genotypu CmTe metódou razitkovania na pevnej LB pôde s tetracyklinom alebo clilóramfeniklom. Viac ako 90 transfonnantov narastených za 24 hodín pri 37 °C obsahovalo rekombinantný plazmid.Získané klony obsahujúce rekombinované plazmidy boli ďalej testované na schopnosť syntézy PAG pritlačenim tiltračného papiera nasýtenćho čerstvým roztokom NIPAB (1,8 mg/ml 0,05 M fosfátového pufra s pH 7,5) na kolónie narastené na pevnej pôde v Petriho miskách a ínkubáciou filtračných papierov s otlačenými kolóniami pri teplote 37 °C v čistých uzavretých Petriho miskách počas 3 až 20 hodín.Celkovo bolo testovaných 25000 kolónii, z ktorých 8 iznlátov vykazovalo pozitivnu reakciu (žltnutie kolónii a okolia). Po prečisteni všetkých klonov bol jeden vybraný na ďalšiu prácu a rekombinovaný plannid v ňom obsiahmltý bol označený ako pAA l.z 500 ml kultúry kmeňa HB 101 (pAAl) v LB me SK 278107 B 6diu bol plazmid pAAl izolovaný metódou Bimboim a Doly (1983) - citované vyššie. Pôsobením Eco RI na plazmid pAAl s nasledujúcim elektroforćzou v agamvom géli bola dokázaná prítomnosť chromozómového tragmentu s veľkosťou 10,8 kb obsahujúceho PAG gén. špecifická aktivita PAG v rekombinovanom kmeni HB l 0 l (pAAl ) je uvedená v tabuľke v opise vynálezu.DNK pAAl izolovaná spôsobom uvedeným v puklade l bola štiepená reštrilcčnou endonukleázou Hind III. Zmes DNK fragmentov bola po inaktivácii enzýmu Hind II rozdelená elektroforeticky na agnrovom géli zo štyroch prítomných fragmentov (s veľkosťou 6,5 4,4 2,8 a l,l kb) boli 3 najväčšie z gélu izolované elektroelúciou a purifikované. Tieto fmgmenty boli ligované do vektora pACYC I 84, línearizovaného Hind 1 a defosforylovaného ClP. Rekombinovanými plazmidmi obsahujúcimi skrátený chromozómový fragment bol transformovaný kmeň HBIOI, spôsobom ako v príklade l. Klony nesúce PAG gén boli detekovane s použitím chromogénnej látky NIPAB, ako je uvedene v príklade l. Z buniek pozitívneho klonu bol izolovaný rekombinovaný plazmid a jeho reštrikčnou analýzou bolo zistené lokalizácia PAG génu v najväčšom, 6,5 kb veľkom třagmente,ktorý obsahuje 3,9 kb chromozbmový fragtnent. Tento rekombinovaiíý plazmid bol označený pAA 6. Špecilická aktivita PAG kmeňov získaných transfonnáciou týmto plaznidom E. coli HBl 0 l (pAA 6), E. coli MCIOOODNK plazmidu pAA 6 bola pripravená a puriñkovaná vo väčšom množstve a podrobená analýze reštríkčnými endonukleázami Eco RI, Hind III, Bam HI, PST I,Cla I. Pvu I a Sma I. Takto boli pripravené dva fragmenty, odvodené z pôvodného chromozomovćho fragmentu kmeňa RE 3, obidva obsahujúce gén PAG 3,9 kb, Hind 1 - Eco R fragment a 2,9 kb Hind 1 - Pvu I íragment. DNK vektora pBR 322 bola parciálne štiepená reštrikčnou endomtlcleázou Sau 3 A. Vzniknuté fragmenty plazmidu boli T 4 DNA ligázou recirkularizovane a ligačiíou zmesou boli transformované kompetentnć bunky HB 101. Po prenesem transformantov namstených na pevnej pôde LB na selektívnej pevnej pôde s 20 g ampicilínu/ml alebo l 0 g tetmcyklínu/m získané izolàty fenotypu AmpTe. V súbore týchto kmeňov bol detekovaný rekombinovaný kmeň, v prípade ktorého bola elektroforeticky potvrdená prítomnosť derivátu plazmidu pBR 332 s nižšou molekulovou hmotnosťou (4,0 kb) označenćho pBRa 4.DNK plazmidu pBRa 4 bola štiepená zmesou reštrikčných endonukleáz Eco RI a Hind lll. Vytvorená zmes lineámych molekúl výrazne odlišnej veľkosti sa zmiešala s vyššie pripraveným DNK fragmentom Eco RI - Hind ll (veľkosť 3,9 kb) v pomere l 3. T 4 DNA ligázou boli lřagmenty spojené a ligačnou zmesou transfonnované kompetentnć bunky E. coli HB l 0 l. Medzi rekombínovanými kmeňmi bol nájdený pomocou chromogćnnej látky NIPAB spôsobom ako v príklade l izolát, v ktorom bola elektroforeticky preukázaná prítomnost rekombínovanćho plazmidu obsahujúceho Fragment s PAG génom s veľkosťou 3,9 kb. Tento plazmid bol omačený ako pBA 4. Vlastnosti kmeňov E, coli získaných po transformácii týmto plaanidom HB l 0 l (pBA 4) a ďalej RBS (pBA 4) sú uvedené v tabuľke v opise vynálezu.DNK plamiidu pBR 332 bola pripravená amplifikačnou metódou a štiepená reštrikčnými endonukleázami Pvul a I-lind 11. Takto opraeovaná molekula vektora bola zmiešaná s Pvul - Hind Ill fragmentom chromozómovej DNK v pomere l 3. Pripravené zmes DNK bola ligovaná T 4 DNK ligázou za vzniku kruhových molekúl, ktorými boli transformované kompetentne bunky E. coli HB l 0 l. Medzi rekombinantmi fenotypu Ampľc boli pomocou chromogćnnej látky NlPAB, spôsobom ako v príklade I, zistené klony s aktivitou PAG. Rekombinantný plazmid prítomný v týchto klonoch obsahoval medzi rozomávacími sekvenciami endonukleáz Pvu I a Hind III fragment chromozómovej DNK s veľkosťou 2,9 kb, ako je uvedené v príklade 3. získaný rekombinovaný plamzid bol označený pBAó. Špecifické aktivita PAG kmeňov nesúcich tento plazmid v pripade E. coli l-lB l 0 l (pBA 6) a E. coli RE 3 (pBAG) je uvedená v tabuľke v opise vynálezu.Plazmidy a kmene podľa vynálezu je možné využiť na prípravu medziproduktov na výmbu antibiotík, polosyntetických penicilínov a deaceloxycefalosporínov.l. Rekombinovanć plazmidy pAAl , pAA 6, pBA 4 a pBA 6 a ich deriváty vmiknute deleciou nekódujúcich oblastí, kódujúce syntézu G-penicilín amidázy, charakterizované vloženým fragmentom DNA kmeňa Escherichia coli s veľkosťou 10,8 kb v prípade pAAl, 3,9 kb v prípade pAA 6, 3,9 kt v prípade pBA 4 a 2,9 kb v prípade pBA 6 a reštrikčnou mapou.2. Kmene Escherichia coli CCM 4228 (pAAl),CCM 4228 (pAAó), CCM 4228 (pBA 4) a CCM 4228(pBAó), obsahujíice plaanidy podľa nároku l.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/70, C12P 37/00

Značky: escherichia, obsahujúce, tieto, plazmidy, rekombinované

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/9-278107-rekombinovane-plazmidy-escherichia-coli-obsahujuce-tieto-plazmidy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Rekombinované plazmidy Escherichia coli obsahujúce tieto plazmidy</a>

Podobne patenty