Způsob hydrolýzy racemických hydantoinů na opticky aktivní deriváty aminokyselin

Číslo patentu: 230551

Dátum: 15.05.1986

Autori: Viglia Aurelio, Perricone Elena, Degen Ludwig, Fascetti Eugenio

Je ešte 1 strana.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Způsob hydrolýzy racemických hydantoinů (hydantoinu nebo jeho derivátů) na opticky aktivní deriváty aminokyselin. Způsob spočívá v enzymatické hydrolýze pomocí enzymu, odvozeného od mikroorganismů Bacillus brevis sp. NRRL B-11080 a Bacillus stearothermophilus sp. NRRL B-11079. Hydrolýzu lze provádět při poměrně vysoké teplotě, která může dosáhnout i 60 0C.

Text

Pozerať všetko

vynález se týká způsobu hydrolyzy raoemicwch hydantoinů .na opticky aktivní deriváty aminokyselin. Předevěín se týká hydrolýzy hydantoinu e jeho derivátů v dorivtty slinokyselin, která mají D-konfiguroci. Tato hydrolýze se provídí sa použití určitých mikroorganismů, jejichž schopnost wodukovnt hydropyrimidinhydrolłzu (E.C.3.5.2.2.) je visáno na přítomnost hydentoinů jako induktorů v kultivačníu uódiu. Některé elinokyseliny, ktere mají D-kontigweci, zejména fenylglyoin a hydromfonylglycin, jsou nyní liroce poulívúny jako důležité neziprodukty ve fernceutickću průmyslu.Pro dosažení dělení optických entipodü bylo provedeno mnoho pokusu, nicućuě daný z nich nevadi k nějaká průmyslové využitolne uetodě.Chemické metody dosud používaná k dělení opticldch ontipodů jeou zaloleny na poułívdní opticky aktivních látek, například kyseliny kefrsulfonovć. kyseliny vinnć e dalších.Ty vlak mají tu nevýhodu, že výtěiky přeuěny jsou nízká o provozní náklady vysoká. Alternativní metody jsou založeny ne selektivní hydrolýse D-pcylolinokysoliny ensynen scylásou. Avšak acylúuy jsou polěrně vzácne o jsou vždy snečiatäny ľu-acylhou, teklo leto-ede, která je sama o sobě složitá, vede k získání produktu nízká optická čistoty.mzymatickú hydrolýn, která je předmětu tohoto vynúlesu, vedo k získání jednotnú sterooizouerní formy dorivàtu clinokyseliny z roceui-ckě sloučoniny.Zpüsoby enzyuotickd resoluce LL-ulinokyselin nebo jejich dorivitů bylyrjił nevrlony. stejnýni přihlaěovateli v československém patentu č. 222 177.Tyto dřívějěí metody spočívaly v tou, že se racenickd tone sloučeniu obecního vloroe Ipodrobila enzynove hydroldso hydropyrilidinhydrolňsou extrehovnnou z tolecích juter ucho hydropy-riuidinhydroldzmz produkovanou nikroorgeniny rodu Puudononos.Taková hydrolýzo probíhd podle následující cholická roskcoNyní bylo shledáno, že enzymetickou rezoluci racemických forem výše uvedeného obecného vzorce I podle výše uvedená reakce (2) lze provádět rovněž hydrclázami produkovanými u-ěitými termofilními mikroorgenismy čeledi Bacilleceae. Hydrolázy produkovanć tekovými mikroorganismy jsou odolné proti teplu a lze jich tedy používat při hydrolytidçých procesoch,které lze provddiât při poměrně vyeoldch teplotách (30 až 60 °C) a dovolují pracovat s roztokem o vyšší koncentraci hydantoinu, tim limitují nevýhody spojené s nízkou rozpustností některých hydantnainů při nizwch o normálních teplotách.Způsob hydrolýzy racemicląřch hydantoind ne opticky aktivní deriváty aminokyselin podle tohoto vynilezu tedy apočívá v tom, že se reakce provádí v prítomnosti enzymu, který je odvozen od mikroorganismů Bacillus brevis ap. NRRL B-HOBO nebo/a Bacillus stearothermophilus sp. NRRI. 1341079.l Způsob podle vynálezu se e výhodou provádí při teplotě 30 až 60 °C a při hodnotě pH 6 až 8.Způsob podle vynález se zvlaší výhodné může provadět. tak, že se reakce provádí v přitomnosti enzymu produkovaněho in citu intaktními bunkrami uvedených mikroorganismů, které jsou přitomny v reakčnim prostředí obsahujícím zdroje dusíku. uhlíku a minerální soli.Podle tohoto vyndlezu bunky určitého kmene druhu Bacillaceae, kterých se používá k enzymaticldm postupdm, se pěstují za aerobních podmínek v kultivačním médiu, ktere obsahuje zdroje dusíka a uhlílm a minerální soli při teplotách mezi 30 až 60 °C, s výhodou mezi 40 a 60 °C, po dobu od 0 do 48 hodin, s výhodou mezi 10 a 24 hodinami a hodnotě pH od 6 do B, a výhodou od 7,4 do 7.8. Jako zdroje uhlíku lze používat peptonu, masového extraktu,kukuřićné mičecí vody (corn steep liquor) a jako zdroje dusiku dusičnand, emonných solí a hydrolyzátů lano, kaseinu a aőjových bohů. Jako induktory enzymová aktivity se používejí D,L-hydentoiny, u výhodou BJLL-hydentoin. Induktor lze přidávat ke kultivečnimu médiu přímo před sterilizucí nebo během rastu mikroorganismů.Ze srovnání Iorfologicldch a fyziologicldch znaků kmend, kterých se používá podle tohoto vynúlezu, s popisy uvedenými v díle Bergefs Manuel, 7, vydání, vyplývá, že patří do čeledi Becillaceune, rod Bacillus, druh B. brevis a B. stearothermophilus.Důležitá modifikace tohoto vynálezu, která ještě patri do jeho rozsahu, je dána skutečnosti, že enzym produkovený výše vyjmenovenými kmeny je schopen hydrolyzovat ä-mL-paramethoxyfenylhydentoin rychlosti, která se rovná rychlosti experimentálně ověřené u 5,D,L-fenylhydentoinm což je zcela nové e nemá obdobu ve srovnání s hydrolâzami extrahovarsými z jiných zdrojů.Test na seloktivni hydrolýzu hydentoinových derivátů D,L-aminokyse 1 in pomocí mikroorganismů byl provedem taktoBokteriální kmeny, izolovená z půdy, kompostu, zeleniny a odpadků rdzného původu, byly očkovdny při teplotč 50 °C ze ikměho guru do 250 ml Erlenmeyerových baněk, obsahujících po 50 m 1 tohoto kultivsčního mediaSterilizace po dobu 30 minut při teplote H 0 °C.Po inkubaci po dobu 18 až 20 hodin a Uouživáho míchání při teplot 50 °C byly inkubovény 500 mi 1 ilitrová Erlenmeyerovy beňky, obsahující po 100 ml atedného kultivačního mádia ee 2 ml výše uvedené subkultury.Po dalších 16 až 18 hodinách byla provedena s ostatním buňkemi nášledujícím způsobem enzynatická reakceDo zkumavek s obsahom 10 ml 0,07 nolárního fosfátováho pufru o hodnotě pH 8,5 a 20 Ilikromold ä-Dm-renylhydentoinu v nililitru bylo přidáno po 1 ml bekteriálních auspenzíPo 15 minutách inkubace při teplotě 40 °C byla provedena reakce e p-dimethylaminobenzaldehydem za účelom kvantitativního hodnocení vznikadícího kerbanoylovćho derivátu(J. Biol. ohen., 238, 3325 /1963/) Tabulka 1 uvádí kmeny, kterých bylo použito při postupu podle tohoto vynálezu. Tyto kmeny byly uloženy 11. února 1977 ve sbírce kultur mikroorganismů v Northern Regional Research Center of Peoria, Ill., USA a oznečeny náeledujícíni sbírkovýni depozitními označeními. Jean to Bacillus steerothermophilus (sbírková depozitní označení um B-H 079)e Bacillus brevia (sbírková depozitní označení NRRL B-H 030).Bylo pozorováno, že zetínco probíhá enzymotická hydrolýza D-hydantoinu při alkalickćl pH (pl-I od 7 do 10), probíhá souběžná neonsynatická racemizace zbývajícího D-hydantoinu. Z tohoto důvodu a jako výsledek kontinuálního odnímání D-hydentoinu enzymovou hydrolýzou na konci reakce je, že velkery kerbauoylový derivát je v D-forně. mchloat rnoomiyaca rhydantoinu je funkcí teploty a hodnoty pH a je ti vyšší, čin vyšší je teplota o hodnota pH. Pracuje-li ee však při hodnotě pl-l blízke 8, rychlost není tak vysoká, aby omozovala rychlost reakce hydentoinázy. mzynatickou reakci lze provádět při teplote mezi 10 e 60 °AC z praktických důvodů se používá teplot od 35 do 55 °C.Chemická indentita n-karbamoylrenylglycinu a łł-karbeuoyle(para-nethoxynanylglycinu byla potvrzene po překryatelování reakčního produktu pomocí IČ-apekter, Hlm-apaktcr e hmotová spektroskopie a elementární analýzy.Hodnoty optické otáčivosti jsou(1125 0 ° -14 o° (c l v 1 unnąou), co odpovídá hodnotám z chemická literatury.Podle tohoto vynáleau hydrolýza hydantoinů neprobíhá výlučně v přítonnoati Iikroorgeniemů v jejich růatová fáz. nebo v přítonnoati intalctních buněk nebo příslušných spor,ale tá v přítomnoati, extraktu z výše uvedených mikroorganismů.Aby se doslihlo nehromedění hydrolázy v bxňkáeh, lze například pěstovet níkroorgenisny v tekutám živném prostředí e bJa-łxydentoin potom přidávat do iivnáho prostředí.mzynovou hydrolýzu lze provádět rovné metodou tak zvených klidovýeh bunělŕ. V tomto případě se bektoriàlní buňky izolují ze łivnć kultury e ddklednä promyjí e euspendujív systemu, ktorý Je vhodný e kterfbyl vhodné pufrován, e recemicw hydentoin se k němu přidává.stejně je možné používat příprevkd, které obsahují hydroldsy, například extrektů nebo koncentrátů, příprevkü ze surovýoh nebo čiätěrxých hydrolúz, a která byly tiskárny z buněk výše vyjuenovexxých mikroorganismů. ąKonečné dalšího technického e ekonomického zdokonelení lze dosíci iuobdlisscí enzymu jeho koubinecemi e nekromolehzlárními oloućeninemi pomocí vytváření cheuicwch vueb s uatricí nebo pomocí vezeb iontověho typu nebo fyzikdlní imobilizecí.Následující příklady ozřejmí delší možnosti provedení, které se týkejí tohoto vynálezu, ele neomezují je.Ke 100 m 1 živné kultury vyše uvedeného druhu kmene B. brevis v 500 ml h-lenmnyerově beňoe bylo po Bhodinove inkubací (orbitální míchání) při teplot 40 °C přidíno 100 Ill foefátováho pufru (0,14 solární e pH 8,5), obsehuçjícího 40 míkromold S-(DJJ-fonylhydantoinu v m 1. Po dąalěích 4 hodinách inkubece ze stejných podmínek byl stenoven vznikli N-kerbemoylrenylglycin.ze 705 mg 5(D,L)-fenylhydentoinu vzniklo 700 mg łł-kerbemoylfenylglycinu, co odpovídá výtěžku přibližně 90 S teorie.Ze tajných podmínek jako v příklady 1 bylo po 4 hodinách při teplotě 40 °C získéno pomocí kmene B. steerothermophilus ze 705 mg Ď-(DJA-fenylhydentoínu 600 Ing łł-kaz-benoylfenylglycínu, což odpovídá výtězku asi 85 i teorie.Bylo připraveno kultiveční prostředí výše uvedeného složení, obsahující l g 540,1.)methylhydentoinu v litru. Hodnota pH bylo nastavene pomocí uhličitenu sodneho na 7,5 e livná půde byla rozćlělene po 50 ml dávkách do 250 ml Erlenmeyerovych beněk. Po eterilízeci po dobu 30 minut při. teplotě 110 °C byly beňky očkovány kmene Bacillus brsvis se ěihćho egeru obsehujícího stejné pevné živné prostředí-s agerem (DIFCO) při 2 koncentreci a inkubovány po dobu 22, hodin při teplote 40 °C za ocrbitálního míohání při 220 otáčkúch/uin.Z takové předkultury (optické hustota při 550 nn 0,4, ředění 1 IO) bylo očkovćno po 2 m 1 do Erlenmeyerovýoh buněk objemu 500 m 1 se 100 ml stejnćho prostředí a kultura byla ponecháne inkubeoí při teplote 40 °C za orhdtálního míchání při 220 otáčldch/nín po dobu 18 hodin (presporuleční fáze). Baňky oddělenć z živnáho prostředí odstředěním při 5 000 g(g značí odstředivou sílu) po dobu 20 minut byly pronyty třikrát isotonicidl roztokom při hodnotě pH 8,0 a suspendovány ve rosfátověm pruhu o hodnotě płi 8,5 (0,07 moldrní), představovely klidové buňky.Pro reekei enzymové hydrolýzy bylo inkubováno při teplote 40 °C e za orbitdlního níchá ní (220 otáček/min) ve 250 ml Erlenmeyerových bnňkách 64 nl reskční směsi, obsahující 200 mg bekterií (suchá hmotnost) e 20 mihonolů v ml â-(DJJ-fenylhydentoínu (I 3,52 g v I nl).

MPK / Značky

MPK: C12P 13/04

Značky: deriváty, hydrolýzy, aminokyselin, hydantoinů, opticky, způsob, aktivní, racemických

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/9-230551-zpusob-hydrolyzy-racemickych-hydantoinu-na-opticky-aktivni-derivaty-aminokyselin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob hydrolýzy racemických hydantoinů na opticky aktivní deriváty aminokyselin</a>

Podobne patenty