Oslabený pestivírus, nukleová kyselina, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Číslo patentu: 287625

Dátum: 23.03.2011

Autor: Meyers Gregor

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Oslabené pestivírusy, ktorých enzymatická aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, je inaktivovaná, nukleové kyseliny, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka pestivírusov oslabených inaktiváciou ribonukleázovej aktivity (RNázovej aktivity), ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS. Vynález sa týka aj vakcín a farmaceutických prostriedkov obsahujúcich oslabené pestivírusy podľa vynálezu. Vynález sa ďalej týka ich použitia.Pestivírusy sú príčinnými agensmi ekonomicky dôležitých ochorení zvierat v mnohých krajinách po celom svete. Doteraz známe vírusové izoláty boli rozdelené do troch odlišných druhov skupin, ktoré spolu tvoria rod v čeľadi F lavíridae.I. Bovinný Virálny hnačkový vírus (BVDV) spôsobuje vírusovú hnačku hovädzieho dobytka (BVD) a ochorenie sliznice (MD) teliat (Baker, 1987 Moennig a Plagemann, 1992 Thiel a ďalší, 1996).ll. Vírus klasickej horúčky ošípaných (CSFV), predtým nazývaný vírus cholery ošípaných, je zodpovedný za klasickú horúčku ošípaných (CSF) alebo choleru ošípaných (HC) (Moennig a Plagemann, 1992, Thiel a ďalší, 1996).III. Vírus hraničnej choroby (BDV) sa typicky vyskytuje u oviec a spôsobuje hraničnú chorobu (BD). Podobné symptómy ako pri MD teliat boli opísané aj po intrauterinnej infekcii jahniat s BDV (Moenníg a Plagemann, 1992, Thiel a ďalší, 1996).Alternatívna klasifikácia pestivírusov sa nachádza v Becher a ďalší (1995) alebo inde.Pestivírusy sú malé obalené vírusy s jednoreťazcovým RNA genómom s kladnou polaritou, ktorým chýba tak sekvencia 5 čiapočky, ako aj sekvencia 3 poly(A). Vírusový genóm kóduje polyproteín s dĺžkou približne 4000 aminokyselín, z ktorého vznikajú finálne štiepne produkty prostredníctvom kotranslačného a posttranslačného spracovania, na ktorých sa podieľajú bunkové a vírusové proteázy. Vírusové proteíny sú zoradené v polyproteíne v nasledujúcom poradi NHz-Npm-C-ERNS-El-E 2-p 7-NS 2-NS 3-NS 4 A-NS 4 B-NS 5 A-NSSB-COOH (Rice, 1996). Protein C a glykoproteíny ERNS, E 1 a E 2 predstavujú šnukturálne zložky pestivírusového viriónu (Thiel a ďalší, 1991). Zistilo sa, že E 2 a V menšom rozsahu ERNS sú cieľmi protilátkovej neutralizácie (Donis a ďalší, 1988 Paton a ďalší, 1992 van Rujn a ďalší, 1993 Weiland a ďalší, 1990,1992). ERNS nemá membránové ukotvenie a je vylučovaný v značných rrmožstvách z infikovaných buniek. O tomto proteine sa publikovalo, že vykazuje RNázovú aktivitu (Hulst a ďalší 1994 Schneider a ďalší, 1993 Windisch a ďalší 1996). Funkcia tejto enzyrnatickej aktivity v životnom cykle vírusu nie je v súčasnosti známa. V prípade CSFV vakcínového kmeňa sa publikovalo, že výsledkom experimentálnej deštrukcie RNázy miestne špecifickou mutagenézou je cytopatogénny vírus, ktorého rastové charakteristiky V bunkovej kultúre sú rovnake ako rastové charakteristiky divého typu vírusu (Hulst a ďalší, 1998). Enzymatická aktivita závisí od prítomnosti dvoch aminokyselinových sekvencií, ktoré sú konzervované medzi pestivírusovou ERNS a rôznymi známymi RNázamí rastlinného a hubového pôvodu. Obe tieto konzervatívne sekvencie obsahuú histidínový zvyšok (Schneider a ďalší, 1993). Výsledkom zámeny každého z týchto zvyškov za lyzin v E S proteine CSFV vakcínového kmeňa bola deštrukcia RNázovej aktivity (Hulst a ďalší, 1998). Zavedenie týchto mutácií do genómu CSFV vakcínového kmeňa neovplyvnilo životaschopnosť vírusu alebo jeho rastové vlastnosti, ale viedol k vírusu, ktorý vykazoval mierne cytopatogénny fenotyp (Hulst a ďalší, 1998).Generovali sa a v súčasnosti sa používajú CSFV a BVDV vakcíny, ktoré obsahujú oslabené alebo usrnrtené vírusy alebo vírusové proteíny exprimované v heterológnych expresných systémoch. Štrukturálny základ oslabenia týchto vírusov používaných ako živé vakcíny nie je známy. To vedie ku riziku nepredpokladateľných revertantov po vakcinácii spätnou mutáciou alebo rekombináciou. Na druhej strane je schopnosť inaktivovaných vakcín alebo hetorológne exprimovaných vírusových proteínov (podjednotkové vakcíny) vyvolať imunitu dost nízka.Vo všeobecnosti by živé vakcíny s definovanými mutáciami ako základom oslabenia, mohli eliminovať nevýhody súčasnej generácie vakcín. V súčasnosti nie sú dostupné potenciálne ciele pre oslabovacie mutácie v pestivírusoch.Ďalšia výhoda uvedených oslabovacích mutácií spočíva v ich molekulovej unikátnosti, ktorá umožňuje ich použitie ako rozlišovacích značiek pre oslabene pestivírusy a na ich odlíšenie od pestivírusov z prostredia.Keďže je dôležitá účinnost a bezpečnosť, ako aj detegovateľná profylaxia a liečba pestivírusových infekcií, existuje silná potreba živých a špecificky oslabených vakcín s vysokým potenciálom indukovať imunitu,ako aj s deñnovaným základom oslabenia, ktorý umožní aj ich odlíšenie od patogénnych pestivírusov.Preto je technickým problémom, ktorý rieši predložený vynález, poskytnúť špecificky oslabené a detegovateľne značené pestivírusy na použitie ako živé oslabené vakcíny s veľkou schopnosťou indukovať imunitu,ktoré, ako výsledok tej to metódy môžu byť aj odlíšiteľné od patogénnych pestivírusov z prostredia.Prckvapujúco sa zistilo, že pestivírusy je možné špecificky oslabiť ínaktiváciou RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS.Predmetom vynálezu je teda oslabený pestivírus s inaktivovanou RNázovou aktivitou, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciamí najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu.Oslabené pestivírusy teraz poskytujú živé vakcíny s vysokou imunogénnosťou.Tu používaný výraz vakcína znamená farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje najmenej jednu imunologicky účinnú zložku, ktorá índukuje imunologickú odpoved v živočíchovi a môže obsahovať, ale nie je to nevyhnutné, jednu alebo viacero ďalších zložiek, ktoré zosilňujú imunologickú aktivitu uvedenej účinnej zložky. Vakcína môže ďalej obsahovať ďalšie zložky, ktoré sú typické pre farmaceutické prostriedky. lmunologicky účinná zložka vakcíny môže obsahovať úplné živé organizmy buď v ich pôvodnej forme, alebo ako oslabené organizmy, ako takzvaná modifikované živá vakcína (MLV), alebo organizmy inaktivované príslušnými metódami, ako takzvaná usmrtená vakcína (KV). V inej forme môže imunologicky účinná zložka vakcíny obsahovat príslušné elementy uvedených organizmov (podjednotkové vakcíny), pričom tieto elementy sa generujú bud rozrušením celého organizmu, alebo rastovej kultúry takýchto organizmov a následnými purifikačnými krokmi, ktorých výťažkom je požadovaná štruktúra (štruktúry), alebo syntetickými procesmi indukovanými príslušnou manipuláciou vhodného systému, napríklad, ale bez obmedzenia, bakteriálnych, hmyzích, cicavčích alebo systémov iných druhov, a následne izolačnými a puriñkačnými postupmi,alebo indukciou uvedených syntetických procesov v živočíchovi, ktorý potrebuje vakcínu, priamym začlenením genetického materiálu použitím vhodných farmaceutických prostriedkov (polynukleotidová Vakcinácia). Vakcína môže obsahovať jednu alebo naraz viac ako jednu opísanú zložku.Farmaceutický prostriedok v podstate pozostáva z jednej alebo viacerých zložiek, ktoré sú schopné modifikovať fyziologické, napr. imunologické, funkcie organizmu, ktorému sa podávajú, alebo organizmu, v ktorom žijú alebo na ktorého povrchu sa nachádzajú, napríklad, ale bez obmedzenia, ako antibiotika alebo antiparazitiká, ako aj z iných súčasti, ktoré sa do neho pridávajú, aby sa dosiahli určité ine ciele, ako napríklad, ale bez obmedzenia, spracovateľské znaky, sterilíta, stabilita, schopnosť jednoduchého podania prostriedku enterálnyrni alebo parenterálnymi cestami, ako napríklad orálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intradermálne alebo inými vhodnými cestami, tolerancia po podaní, vlastnosti kontrolovaného vylučovania.Vakcína podľa vynálezu obsahuje ako írnunologicky účinnú zložku pestivírus.Tu používaný výraz pestivírus znamená všetky pestivírusy, ktoré sa vyznačujú tým, že patria do rovnakého rodu ako BVDV, CSFV a BDV v rámci čeľade Flaviridae, a exprimujú glykoproteín EMS. Samozrejme, že uvedený výraz sa týka aj všetkých pestivírusov, ako boli charakterizované Becherom a ďalšími (1995) alebo iných vírusov, ktoré ex rimujú glykoproteiu ERNS. Tu používaný výraz RNázová aktivita znamená schopnosť glykoproteínu ERN hydrolyzovať RNA.Trelàgspoznamenať, že v publikáciách sa často výraz glykoproteín E 0 používa ako synonymum glykoproteínu E .Výraz inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je uvedený glykoproteín znamená, že modifikovaný glykoproteín EWS nie je schopný alebo má zníženú schopnosť hydrolyzovať RNA v porovnaní s nemodifikovaným divým typom uvedeného glykoproteínu ERNS.Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, sa môže dosiahnuť deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, ako bolo demonštrované tu a v publikácii Hulst a ďalší (1998). Preto sa výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka živých vakcín, v ktorých je uvedená RNázová aktivita ínaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, Ukázalo sa, že glykoproteín ERNS vytvára homodimér viazaný disulñdovou väzbou s veľkosťou približne 97 kD, pričom každý monomér pozostáva z 227 aminokyselín zodpovedajúcich aminokyselinám 268 až 494 CSFV polyproteínu, ako bol opísaný v Rümenapf a ďalší (1993). Prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimovane Alfort kmeňom CSFV je znázornených na obrázku l len z referenčných dôvodov. Genómová sekvencia Alfort kmeňa CSFV je dostupná v GeBank/EMBL databáze pod prístupovýrn číslom 104358 alternatívne je možné zistiť aminokyselinovú sekvenciu BVDV kmeňa CP 7 v GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U 63479). V glykoproteíne ERNS, ako aj v niektorých rastlinných a hubových proteínoch s RNázovou aktivitou sú značne konzervované dve oblasti aminokyselín (Schneider a ďalší, 1993). Tieto dve oblasti sú veľmi dôležité pre RNázovú enzymatickú aktivitu. Prvá oblast pozostáva z oblasti aminokyselín v polohe 295 až 307 a druhá oblast pozostáva z aminokyselín v polohe 338 až 357 uvedeného vírusového proteínu, ako je ilustrovaný na obrázku 1 znázorňujúcom Alfort kmeň CSFV (číslovanie podľa publikovanej odvodenej aminokyselinovej sekvencíe CSFV kmeňa Alfort (Meyers a ďalší, 1989). Aminokyseliny, ktoré sú výnimočne dôležité pre RNázovú aktivitu, ako bolo uvedené, v žiadnom prípade nie sú obmedzené presnou polohou, ako jedefinovaná pre Alfort kmeň CSFV, ktorý je len použitý ako príklad na uvedenie výhodných aminokyselín,ktoré sú V polohe zodpovedajúcej polohe V iných kmeňoch, ako napríklad V BVDV, BDV a všeobecne V pestivírusoch, keďže táto sekvencia je Vysoko konzervatívna. Pri pestivírusoch, ktorými nie je CSFV Alfort kmeň, sa číslovanie polôh výhodných aminokyselín často líši, ale priememý odborník V oblasti molekulárnej biológie pestivírusov bude vedieť jednoducho identifikovať tieto výhodné aminokyseliny prostredníctvom polohy vysoko konzervatívnych aminokyselín daného glykoproteínu. V jednom konkrétnom, neobmedzujúcom príklade poloha CSFV Alfort 346 zodpovedá polohe 349 V BVDV kmeni cp 7.Dôsledkom toho sa predložený vynález týka Vo svojom Výhodnejšom uskutočnení pestivírusu, v ktorom sú inaktivujúce delécie a/alebo mutácie lokalizované v aminokyselinových polohách 295 až 307 a/alebo polohách 338 až 357, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň vo forme príkladu, alebo V zodpoVedajúcich polohách glykoproteínu V iných kmeňoch.Vo veľmi výhodnom uskutočnení predložený vynález opisuje, že inaktivácia RNázovej aktivity deléciou alebo mutáeiou aminokyseliny V polohe 346 glykoproteínu vedie k najužitočnejším živým vakcínam. Preto sa predložený vynález týka oslabených pestivírusov, V ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou alebo mutáciou aminokyseliny V polohe 346, ako je uvedené na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch.Predložený vynález demonštruje, že pestivírusy sú životaschopné a kódujú proteín bez RNázovej aktivity, keď je histidínový zvyšok V polohe 346 Virusového proteínu (číslovanie podľa publikovanej sekvencie CSFV Alfort/Tübingen (Meyers a ďalší, 1989, ktorý predstavuje jedno z konzervatívnych možných aktívnych zvyškov ERNS RNázy, deletovaný. V tomto vynáleze sa tiež demonštrovalo, že Výsledkom deletovania zodpovedajúceho histidínu V EMS BVD pestivíruse (poloha 349, číslovanie podľa sekvencie BVDV CP 7 GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U 63479 je životaschopný vírus, V ktorom ERNS glykoproteín stratil RNázovú aktivitu. Na rozdiel od bodových mutácií zarnieňajúcích jednu aminokyselinu za inú, delečný mutant je vo všeobecnosti oveľa viac stabilný, čo sa týka tvorby revertantov. Infekcia ošípaných s mutantom patogénneho CSFV Alfort/Tübingen exprimujúcim ERNS s deléciou neviedla k horúčke alebo iným typickými klinickýrni príznakom CSFV infekcie, zatiaľ čo Výsledkom infekcie divým typom vírusu bola horúčka, hnačka, anorexia, apatia, zníženie počtu B-buniek a poruchy centrálneho nervového systému. Ošípané boli usmrtené 14 dní po inokulácii, v štádiu umierania, pričom silno krvácali z pokožky a z vnútorných orgánov. Ošípané infikované mutantom nevykazovali ani Virémiu, ani zníženie počtu B-buniek, čo bolo testované na 3, 5,7, 10, 14 deň po infekcii, zatiaľ čo CSFV sa jednoducho izoloval zo vzoriek krvi odobratých ošípaným, ktoré boli inokulované divým typom vírusu. Delečný mutant sa zjavne replikoval V živočíchoch, čo Vyplýva z indukcie neutralízačných protilátok (pozri príklad 3, tabuľka 30). Imunitná odpoved na mutantný Vírus bola dostatočná na to, aby umožnila prežitie letálnej dávky s 2 x 105 TCID 50 vysokopatogénnej infekcie s CSFV kmeňom Eystrup (König, 1994), ktorý je heterológny vzhľadom na kmeň Alfort. Navyše testované zvieratá nemali po vyzývacej infekcii žiadne klinické príznaky CSFV infekcie, ako horúčku, hnačka, krvácanie, znižovanie počtu B-buniek alebo anorexiu. Tieto údaje demonštrujú, že infikovanie ošípaných s delečným mutantom indukuje imunitnú odpoveď, ktorá je dostatočné na ochranu proti silnej dávke.Preto sa najvýhodnejšie uskutočnenie vynálezu týka pestivírusov, v ktorých je RNázová aktivita inaktiVovaná deléciou histidínového zvyšku V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo zodpovedajúceho zvyšku v glykoproteíne v iných kmeňoch.Ďalšie najvýhodnejšie uskutočnenie vynálezu sa týka BVDV vakcín podľa vynálezu, v ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo zodpovedajúceho zvyšku V glykoproteíne V iných BVDV kmeňoch.Ďalší predmet predloženého vynálezu sa týka oslabených pestivírusov, V ktorých je RNázová aktivita,ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny glykoproteínu s podmienkou, že aminokyselinou V polohe 297 a/alebo 346 glykoproteínu, ako je ilustrovaný na obrázku 1 pre CSFV, nie je lyzín. Rekombinantný pestivírus, v ktorom sú aminokyselinann V polohách 297 a/alebo 346 glykoproteínu lyzíny, bol opísaný V Hulst a ďalší V roku 1998. Tieto konkrétne vírusy Vykazovali cytopatícké účinky v obličkových bunkách ošípaných. Doteraz neexistovala žiadna informácia o prekvapujúcej a inovatívnej vlastnosti oslabenia vďaka inaktivácii EMS enzymatickej aktivity.Výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka aj pestivírusov podľa vynálezu, V ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciarni a/alebo mutáciami lokalizovanými V aminokyselinách v polohách 295 až 307 a/alebo V polohách 338 až 357, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo V iných kmeňoch V zodpovedajúcich polohách glykoproteínu.Výhodnej šie uskutočnenie predloženého vynálezu týka aj pestivírusov podľa vynálezu, V ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou a/alebo mutáciou aminokyseliny V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo V iných kmeňoch V zodpovedajúcej polohe glykoproteínu.Najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu týka BVDV pestivírusov, V ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou histidínu V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo V iných BVDV kmeňoch V zodpovedajúcej polohe glykoproteínu.Oslabene pestivírusy a účinné zložky vakcín podľa predloženého vynálezu je možné jednoducho pripraviť rekombinantnými technikami modifikujúcimi nukleovú kyselinu, ktorých výsledkom je expresia mutantnej aminokyselinovej sekvencie v glykoproteíne ERNS. Preto sa ďalší predmet predloženého vynálezu týka nukleových kyselín kódujúcich glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita, ktorej nositeľom je tento glykoproteín, je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciarni najmenej jednej aminokyseliny glykoproteínu s podmienkou, že aminokyselinarni V polohách 297 a/alebo 346 glykoproteínu, ktorý je ilustrovaný na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň, nie sú lyzíny.Výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka nukleových kyselín podľa vynálezu, v ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami lokalizovanými v aminokyselinách v polohách 295 až 307 a/alebo v polohách 338 až 357, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v iných kmeňoch v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu.Výhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu týka nukleových kyselín podľa vynálezu, v ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou a/alebo mutáciou aminokyseliny V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v iných kmeňoch v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu.Najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka nukleových kyselín podľa vynálezu, v ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku V polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v iných kmeňoch v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu.Ďalšie najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka BVDV nuldeových kyselín podľa vynálezu, v ktorých je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku v polohe 346, ako je ilustrované na obrázku l pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v iných BVDV kmeňoch V zodpovedajúcej polohe glykoproteínu.Nukleotidy, napr. DNA alebo RNA sú užitočné aj na prípravu DNA-, RNA- a/ alebo vektorových vakcín. V týchto vakcínach sa nukleotidy aplikujú živočíchovi priamo alebo nepriamo, prostredníctvom vektora, ktorý je iný ako pôvodný virus. Nukleotidové vakcíny a vektorovć vakcíny sú dobre známe zo súčasného stavu techniky a ďalej ich nebudeme rozoberať.Ďalej sa predložený vynález týka použitia nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu na prípravu nukleotidových a/alebo vektorových vakcín.Vakcíny, oslabené pestivírusy a/alebo nukleové kyseliny podľa vynálezu sú užitočné najmä na pripravu farrnaceutických prostriedkov.V dôsledku toho sa ďalší predmet predloženého vynálezu týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich vakcíny podľa vynálezu a/alebo pestivírusy podľa Vynálezu, a/alebo nukleotidové sekvencie podľa vynálezu. Jeden neobmedzujúci príklad takéhoto farmaceutického prostriedku, poskytnutý len na účely demonštrácie, by mohol byť pripravený nasledovne Supernatant inñkovanej bunkovej kultúry sa zrnieša so stabilizátorom (napr. sperrnidínom a/alebo BSA (hovädzi sérový albun 1 ín a zmes sa následne lyoñlizuje alebo dehydratuje inými metódami. Pred vakcináciou sa potom zmes rehydratuje vo vodnom roztoku (napr. vo fyziologickom roztoku, v PBS (fosfátom tlmený fyziologický roztok alebo v nevodných roztokoch (napr. v olejovej emulzii, v adjuvans založenom na hliníku).Ďalej sa predložený vynález opisuje spôsob oslabovania pestivírusov. Vynález poskytuje unikátny a neočakávaný spôsob oslabovania pestivírusov, ktorý spočíva vtom, že sa inaktivuje RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS.Špeciñcky oslabené pestivírusy sú výnimočne užitočné na prípravu vakcín. Preto sa ďalej vynález týka spôsobov výroby špecificky oslabených pestivírusových vakcín, ktoré spočívajú v tom, že sa inaktivuje RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS.Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS poskytuje prekvapujúci a nový spôsob na detegovateľné značenie pestivírusov. Ďalší predmet predloženého vynálezu poskytuje spôsob detegoVateľného značenia pestivírusov, ktorý spočíva v tom, že sa inaktivuje RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín EMS. Znak, že chýba RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS pestivírusov podľa vynálezu, teraz umožňuje detegovateľne značenie týchto pestivírusov. Označené a neoznačené pestivírusy alebo vylučovanie ERNS z pestivírusových infikovaných buniek do telesných tekutín je možné zrejmým spôsobom odlíšiť tým, že chýba alebo je prítomná RNázová aktivita glykoproteinov ERNS pri ich izolácii a testovaní tejto enzymatickej aktivity.Množstvo ďalších techník je možné použit pre pestivírusy s inaktivovanou RNázovou aktivitou, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, prostredníctvom delécie a/alebo rnutácie. Takéto pestivírusy je možné jednoducho detegovať, vďaka štrukturálnym dôsledkom, ktoré sú výsledkom delécií a/alebo mutácií. Napríklad rozdiely V sekvencii nukleovej kyseliny zmeneného glykoproteínu ERNS je možné detegovať technikami sekvenovania nukleovej kyseliny alebo PCR technikarni (polymerázová reťazová reakcia), ako je demonštrované v príklade 8. Zmenenú proteínovú sekvenciu je možné detegovať špecifickými monoklonálnymi protilátkami, ktoré nerozoznávajú nezmenené proteíny. Vice versa, je možné detegovať zmenené, a tým štrukturálne značené proteíny aj tým, že sa na ne neviažu špecifické monoklonálne protilátky, ktoré rozoznávajú nezme

MPK / Značky

MPK: A61K 48/00, C12Q 1/00, C12N 7/00, A61K 35/00, C12N 15/00

Značky: prostriedok, použitie, farmaceutický, obsahom, nukleová, kyselina, pestivírus, oslabený

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/81-287625-oslabeny-pestivirus-nukleova-kyselina-farmaceuticky-prostriedok-s-ich-obsahom-a-ich-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Oslabený pestivírus, nukleová kyselina, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie</a>

Podobne patenty