Polypeptidové varianty faktora VII alebo VIIa

Číslo patentu: E 8864

Dátum: 29.04.2003

Autori: Haaning Jesper Mortensen, Andersen Kim Vilbour

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Tento vynález sa týka nových polypeptidových variantov polypeptidov faktora VII(FVll) alebo faktora (FVlla), pričom uvedené varianty zahmujú aminokyselinovú substitúciu v polohe 10 a 32 a pričom uvedené varianty ďalej zahrnujú cukorný zvyšok kovalentne naviazaný na zavedené in vivo N-glykozylačné miesto.Tento vynález sa tiež týka použitia týchto polypeptidových variantov v liečebnej terapii, predovšetkým na liečbu rôznych porúch týkajúcich sa zrážanlivosti.Krvná zrážanlivosť je proces pozostávajúci z komplexnej interakcie rôznych krvných zložiek (alebo faktorov), ktorý prípadne vedie k ñbrínovej zátke. Vo všeobecnosti sú kwnými zložkami, ktoré sa zúčastňujú procesu, ktorý bol označovaný ako koagulačná kaskáda, proenzýmy alebo zymogény, t.j. enzymaticky inaktívne proteíny, ktoré sú konvertované na aktívnu formu pôsobením aktivátora. Jedným z týchto koagulačných faktorov je FVII.FVII je plazmatickým proteínom závislým od vitamínu K, ktorý je syntetizovaný vpečení a sekrétovaný do krvi vo forme jednoreťazcového glykoproteínu smolekulovou hmotnosťou 53 kDa (Broze Majerus, J. Biol. Chem 1980 2 S 51242-l 247). FVll zymogén je konvertovaný na aktívnu formu (FVlIa) proteolytickým štiepením vjedinom mieste,R 152-Il 53, čo vedie kdvom reťazcom spojeným jedným disulñdovým mostíkom. FVlla v komplexe s tkanivovým faktorom (FVlla komplex) je schopný konvertovať ako faktor X tak aj faktor X, na ich aktivované formy, po ktorom nasledujú reakcie, ktore vedú krýchlej produkcii trombínu a tvorbe fibrínu (ůsterud Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977 7425260-5264).FVII prechádza posttranslačnými modifikáciami zahrnujúcimi karboxyláciu závislú od vitamínu K, ktorá vedie kdesiatiln zvyškom kyseliny y-karboxyglutámovej vN-koncovcj oblasti molekuly. Zvyšky číslo 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 a 35 uvedene v SEK 1 D Č 2 sú teda zvyškami kyseliny y-karboxyglutámovej v Gla doméne, dôležitej pre aktivitu FVll. Ďalšieposttranslačné modifikácie zahrnujú naviazanie cukorných zvyškov na dve prirodzene savyskytujúce N-glykozylačné miesta V polohe 145 a 322, v tomto poradí, a na dve prirodzene sa vyskytujúce O-glykozylačně miesta v polohe 52 a 60, v tomto poradí.Gén kódujúci ľudský FVlI (hFVII) bol vyznačený na chromozóme 13 na q 34-qter 9 (de Grouchy et al., Hum Genet 1984 662230-233). Zahrnuje deväť exónov azaberá 12,8 kb(OHara et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987 8425158-5162). Usporiadanie génu a proteínová štruktúra FVII sa podobajú usporiadaniu a štruktúre ďalších prokoagulačných proteínov závislých od vitamínu l( s exónmi la a lb kódujúcimi signálnu sekvenciu exónom 2 kódujúcim propeptid a Gla domény exónom 3 kódujúcim krátku hydrofóbnu oblasť exónmi 4 a 5 kódujúcimi domény podobnej epidermálnemu rastovému faktoru a exónom 6 až 8 kódujúcim katalytickú doménu serínovej proteázy (Yoshitake et al., Biochemistry 1985 24 3736-3750).Existujú záznamy experimentálnych trojdimenzionálnych štruktúr hFVlIa (Pike et al.,PNAS. U.S.A., 1999 9628925-30 and Kemball-Cook et al., J.Struct.Biol, 1999 1272213-223) hFVlIa vkomplexe srozpustným tkanivovým faktorom spoužitím röntgenových kryštalografických metód (Banner et al., Nature, 1996 380241 and Zhang et al., .|.Mol.Biol, 1999 285 2089) a menších fragmentov hFVll (Muranyi et al., Biochemistry, 1998 37210605 and Kao et al., Biochemistry, 1999 3817097).Opísané boli určité proteínové skonštruované varianty FVll. Pozri napr. Dickinson Ruf, J Bio Chem, 1997272 l 9875-19879, Kemball-Cook et al., J Biol Chem, 1998 273285168521, Bharadwaj et al., J Biol Chem, 1996 271230685-30691, Ruf et al., Biochemistry, 1999 381957-l 966 WO 99/20767 WO 00/11416 W 0 02/22776 W 0 02/38162 W 0 01/83725 W 0 01/58935 US 5 580 560.Shah et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr l 495(8)4229-34, a Nelsestuen et al., J Biol Chem, 2001 Oct 26276(43)39825-3 l opisujú funkčne štúdie porovnávajúce faktor Vlla divokého typu a mutantnú formu faktora Vlla, ktorá má mutácie v polohách 10 a 32Existujú záznamy o expresii FVll v B 111( alebo iných cicavčích bunkách (W 0 92/15686, WO 91/11514 a WO 88/10295) a koexpresii FVll a kex 2 endoproteázy v eukaryotíckých bunkách (W 0 00/28065).Komerčné preparáty ľudských rekombinantných FVlla sa predávajú ako NovoSc-vcntk).NovoSeven® je indikovaný pri liečbe krvácavých príhod u pacientov s hemofíliou A alebo B.NovoSeven® je jediným rhFVlla na účinnú a spoľahlivú liečbu krvácavých príhod, ktorý je na trhu dostupný.lnaktívna forma FVll, V ktorej je/sú modiñkovaný(é) arginín 152 a/alebo izoleucín 153,bola opísaná vo W 09 l/l 154. Tieto aminokyseliny sú umiestnené vaktívnom mieste. W 0 96/12800 opisuje inaktiváciu FVIIa inhibítorom serínových proteáz inaktivácia karbamyláciou FV 11 a na skupine (ut-aminokyseliny 1153 bola opísaná V Petersen et al., Eur J Biochem, 1999 261 l 24-129. lnaktivovaná forma je schopná kompetovat s FVl 1 alebo FVl 1 a divokého typu oväzbu na tkanivový faktor a inhibovať zrážaciu aktivitu. lnaktivovaná forma FVlla sa doporučuje na použitie pri liečbe pacientov, ktorí sú v hyperkoagulačných stavoch, ako napríklad pacientov so sepsou, V ohrození infarktom myokardu alebo trombotickou mŕtvicou.Polčas rozpadu cirkulujúceho rhFVIIa 2,3 hodiny bol zaznamenaný V Summary Basis for Approval for NovoSeven®, FDA referenčné číslo 96-0597. Relatívne vysoké dávky a časté podávanie je nutné, aby sa dosiahol požadovaný terapeutícký alebo profylaktický účinok adošlo kjeho pretrvaniu. Ztoho dôvodu je obtiažne docieliť adekvátnu reguláciu dávok a potreba častých intravenóznych podaní prináša obmedzenie pre pacientov spôsob života.V spojení s liečbou nekontrolovaných krvácaní, ako napríklad traumy, sa predpokladá,že faktor VIIa je schopný aktivovať faktor X na faktor Xa, bez toho aby sa naviazal na tkanivový faktor, a predpokladá sa, že k tejto aktivačnej reakcii dochádza primárne na aktivovaných krvných doštičkách (Hedner et al. Blood Coagulation Fibrinolysis, 2000 1 l 107-1 l l). hFVIIa alebo rhFVIIa však má nízku aktivitu voči faktoru X V neprítomnosti tkaniVového faktora a následkom toho liečba nekontrolovaného krvácanía, napríklad u pacientov s traumou, vyžaduje relatívne vysoké a opakované dávky hFVIIa alebo rhFVIIa. Teda pre účely efektívnejšej liečby nekontrolovaných krvácaní (aby sa minimalizovala strata krvi) sú nevyhnutne vylepšené FVlIa molekuly, ktoré majú vysokú aktivitu voči faktoru X V neprítomnosti tkanívovćho faktora. Tieto vylepšené FVIla molekuly budú vykazovať kratší zrážací čas (alebo rýchlejšie pôsobenie) V porovnaní s rhFVIIa, ak budú podané V súvislosti s nekontrolovanými krvácaniami.Molekula s dlhším cirkulačným polčasom rozpadu bude znižovať počet nevyhnutných podaní. Ak sa vezme do úvahy súčasný rhFVIIa produkt s častými injekciami a možnost získat optimálnejšie terapeutické FVlla hladiny sprevádzané zvýšeným tcrapeutickým účinkom.existuje zreteľná nutnosť vylepšených molekúl podobných FVII alebo FVlla.Jedným spôsobom, ktorým je možné zvýšiť cirkulačný polčas rozpadu proteínu, je zaistiť, aby sa znížil renálny klírens tohto proteínu. Toto je možné dosiahnuť konjugáciou proteínu schemickým zvyškom, ktorý je schopný zabezpečiť znížený renálny klírens tohto proteínu.Okrem toho pripojenie chemického zvyšku na proteín alebo substitúcie aminokyselín vystavených proteolýze môže efektívne zabrániť kontaktu s proteolytickým enzýmom, ktorý by viedol k proteolytíckej degradácii tohto proteínu. Polyetylénglykol (PEG) je jedným z chemických zvyškov, ktorý bol použitý pri príprave terapeutických proteínových produktov. W 0 98/32466 navrhuje, že okrem iných proteínov môže byt FVlI PEGylovaný, ale neobsahuje žiadne ďalšie informácie vtomto smere. W 0 Ol/58935 opisuje novú stratégiu vývoja FVII alebo F Vlla molekúl, ktoré majú okrem iného zvýšený polčas rozpadu.Ako je naznačené vyššie, ďalším problémom V súčasnej rhFVlla liečbe je relatívna nestabilíta molekuly vzhľadom na proteolytickú degradáciu. Proteolytická degradácia je hlavnou prekážkou získania prípravku vroztoku, na rozdiel od lyoñlizovaného produktu. Výhoda získania stabilného rozpustného prípravku spočíva vjednoduchšej manipulácii pre pacienta, avprípade stavov pohotovosti, vrýchlejšom pôsobení, ktoré môže potenciálne zachrániť život. Pokusy zamedziť proteolytickej degradácii miestne cielenou mutagenézou v hlavných proteolytických miestach boli opísané vo WO 88/10295.Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnúť vylepšené FVlI alebo FVlIa molekuly(varianty FVlI alebo FVlIa) sdlhším cirkulačným polčasom rozpadu (a tým znížiť počet nevyhnutných podaní), ktoré sú súčasne schopné aktivovať faktor X na faktor Xa (bez toho aby sa viazali na tkanivoxý faktor) efektívnejšie ako hFVlla alebo rhFVlIa (a tým sú schopné efektívnejšie liečiť nekontrolované krvácania, ako je napríklad trauma).Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnúť vylepšené FVII alebo FVlIa molekuly(varianty FVII alebo FVlIa) so zvýšenou biodostupnosťou (ako napríklad so zväčšenou oblasťou pod krivkou v porovnaní s rhFVIla, ak sú podané intravenózne), ktoré sú súčasne schopne aktivovať faktor X na faktor Xa (bez toho aby sa viazali na tkanivový faktor) efektívnejšie ako hFVlla alebo rhFVIa (a tým sú schopné efektívnejšie liečiť nekontrolované krvácania. ako je napríklad trauma).Tieto ciele spĺňajú tu poskytnuté FVlI alebo FVlIa varianty.

MPK / Značky

MPK: A61P 17/02, A61K 38/43, C12N 15/09, C12N 5/10, C12N 1/15, C07K 14/745, C12N 9/64, A61K 38/38, C12N 1/21, C12N 1/19, A61K 38/00, C12N 15/57, A61P 7/04

Značky: faktora, varianty, polypeptidové

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/80-e8864-polypeptidove-varianty-faktora-vii-alebo-viia.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Polypeptidové varianty faktora VII alebo VIIa</a>

Podobne patenty