Spôsob vyhodnocovania vhodnosti pankreasu na izoláciu ostrovčekov

Číslo patentu: E 7595

Dátum: 14.11.2005

Autori: Smith Barry, Rubin Albert, Gazda Lawrence

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento vynález sa týka spôsobov zlepšenia kvality akvantity výťažkov ostrovčekov pankreasu. Ostrovćeky sa nachádzajú vpankreasoch živočíchov avynález sa týka spôsobov zisťovania, či pankreas poskytne dobrý výťažok ostrovčekov.0002 Zistilo sa, že terapia náhrady ostrovčekov pankreasu je uskutočniteľna cesta liečby pacientov s rozličnými zdravotnými ťažkosťami. Možno sem zaradit pacientov s rakovinou, ktorí podstúpili hornú abdominálnu exenteráciu (Tzakis, a kol., Lancet. 336 402-405 (1990 s pankratitídou (Clayton, a kol., Transplantation 76 92-98 (2003) Farney, a kol., Surgem. 110 427437 (1991) Fontes, a kol., Transglant Proc. 24 2809 (1992) Obenholzer, a kol., Transglantation. 69 1115-1123 (2000) Robertson, a kol., Diabetes. 50 47-50 (2001 a pacientov závislých na inzulíne, kdeje možnosťou terapie transplantácia ostrovčekov (Goss, a kol., Transplantation. 74 1761-1766 (2002) Ricordi, a kol., Transglantatíon. 75 1524-1527 (2003) Ryan, a kol., Diabetes. 50 710-719 (2001) Shapiro, a kol., N. Engl. J. Med. 343 230-238 (2000.0003 Ako bolo vyššie uvedené, s ohľadom na prospešnost použitia ostrovčekov pankreasu v terapii jestvuje samozrejme záujem o vývoj spôsobov na ich izoláciu. Aj ked je veľa štúdii o izolácii ostrovčekov, kde sa používa automatizovaný spôsob (Brandhorst, a kol., Exg. Clin. Endocrinol Diabetes. 103 Suppl. 2 3-14 (1995) Cui, a kol., Cell Transplant. 6 48-54 (2001) Marchetti, a kol.,Transglantation. 52 209-213 (1991) Miyamoto, a kol., Cell Transplant. 7 397-402 (1998) Nielsen,a kol., Comp. Med 52 127-135 (2002) Swanson, a kol., Hum. Immunnol. 62 73 9-749 (2001) Toomey, a kol., Brit. J. Surg 80 240-243 (1993) Toso, a kol., Cell Transglant. 9 297-305 (2000) Wennberg,a kol., Transpalnt. Proc. 33 2537 (2001. je izolácia ostrovčekov stále náročná. Napríklad, Bosta, a kol., J. lnvestig Med, 43 555-566 (1995) Krickhahn, a kol., Cell Transglant. 11 827-838 (2002) Krickhahn, a kol., Ann Transglant, 6 48-54 (2001), ONeiI, a kol., Cell Transglant. 10 235-246 (2001), a White, a kol., Horm. Metab. Res. 31 579-524 (1999), opisujú súvisiace problémy s rešpektom.0004 Predložený vynález v nasledujúcom opise vedie kspósobu, ktorý maximalizuje pravdepodobnosť úspešného výtažku ostrovčekov pankreasu. Zistilo sa, že pomocou hodnotiaceho systému, ktorý sa tu objasňuje, je možné maximalizovať možnost zabezpečenia dobrého výtažku ostrovčekov z lubovoľnej izolácie ostrovčekov z pankreasu.0005 Ako sa to podarilo uskutočniť, vyplynie z nasledujúceho opisu.0006 Obrázok 1 A ukazuje mikrograf pankreasu, ktorý pri použití spôsobu podľa tohto vynálezu má hodnotu 3, ktorá ho kvalifikuje ako vhodný pankreas, zatiaľ čo obrázok 1 B ukazuje mikrograf s hodnotou -1, ktorá pankreas kvaliñkuje ako nevhodný.PODROBNÝ OPIS VÝHODNÝCH USKUTOČNENÍ WNÁLEZU PRÍKLAD 10007 Zvieratá, ktoré boli použité v nasledujúcich príkladoch, boli prasatá staršie ako dva roky s viacerými zhodnými vlastnosťami. Zvieratá boli omráčené pomocou elektriny a nechali sa vykrvácať. Boli vyňaté Vnútornosti pre pitvu pankreasu. Doba medzi omráčenim elektrinou a umiestnením pankreasu do studeného Hanksovho rovnovážneho solného roztoku (HBSS) bola celkovo 10 - 15 minút. Doba studenej ischémie trvala 15 - 20 minút.0008 Na rozpracovanie tohto postupu sa zobral celý pankreas, potom sa odrezal prstencový krúžok okolo portálnej vény transverzálne na spojí medzi pravým a ľavým lalokom tak, aby sa získal rez tkaniva na biopsiu v hrúbke 2 - 5 mm.0009 Rezy tkaniva podrobené biopsii boli rozdelené na polovicu a umiestené buď v HBSS alebo v0010 Pankreas sa potom uložil do HBSS, do ktorého sa pridali 2 teplom inaktivovaneho prasacieho séra (PS) a potom bol dopravený do laboratória na izoláciu ostrovčekov.0011 Biopsie pankreasu sa potom vyhodnotili, aby sa stanovila ich vhodnost na izoláciu ostrovčekov. Hodnotilo sa päť premenných. Každému prípadu bola priradená hodnota bud 1 alebo-1 pre každú premennú, ako je uvedené nižšie.0012 Najprv sa určovala doba teplej ischémie. Táto je definovaná ako doba medzi začiatkom odkrvenia a umiestenlm pankreasu v studenom ochrannom roztoku. Ak sa uvedené vykonalo počas 15 minút alebo menej, bola priradená hodnota 1. Ak sa uvedené udialo počas viac ako 15 minút,ohodnotilo sa ~ 1. Pretože doba teplej ischémie do 20 minút bude niekedy poskytovať dobrý výťažok ostrovčekov, šance úspešnosti klesajú pre teplú ischémiu trvajúcu viac ako 15 minút.0013 Ako druhé kritérium bola sledovaná farba pankreasu. Farebné odchýlky medzi pankreasmi môžu byt dôsledkom niekoľkých faktorov. Napríklad ak pankreas vykazuje venózne upchatie, ako dôsledok napr. omráčenia zvierat elektrickým prúdom alebo odozvy na stres, potom pankreas nevykazuje vlastnosti umožňujúce použit ho ako donor ostrovčekov. Obidve tieto skutočnosti môžu viest k rozliatiu krvi vnútri pankreasu, uvoľneniu hemoglobínu ajeho difúzii do medzibunkového priestoru. Striedavo to môže viest k zmene farby orgánu, zvyčajne hnedej alebo purpurovočervenej. 0014 Farbu pankreasu je možné pozorovat subjektívne askúsený odborník vie identifikovať tmavo zafarbený pankreas (ktorý je nevhodný a má hodnotu -1) a svetlo zafarbený pankreas, (ktorý je vhodný a má hodnotu 1) avšak objektívnejšie testy používajú kolorímeter, ktorý zaznamenáva farbu založenú na pomere odrazeného a dopadajúceho svetla, pomere odrazu. Ak je táto veličina menšia než okolo 60, prideli sa hodnota -1, zatial čo akje väčšia než okolo 60, prideli sa hodnota 1.0015 Tretím kritériom používaným pri posudzovaní orgánov bol obsah tuku. Na jeho stanovenie bola použitá vzorka na biopsiu asi 2 x 2 × 5 cm, ktorá sa ponorila do DTZ na dobu okolo 5 min. Sledovanie značkovanía sa uskutočnilo pozorovaním tkaniva pod disekčným mikroskopom pri 10-násobnom zväčšení. Ostrovčeky sa javía ako červené a tukové tkanivo ako zelené. Zvolilo sa zorné pole a stanovila sa percentuálne časť z celkovej plochy, ktorá sa javila ako zelená. Ak bol celkový obsah tuku nad hodnotu okolo 25 , orgánu bola priradená hodnota -1, zatial čo obsah tuku menší než hodnota okolo 25 bol ohodnotený ako 1.0016 Je samozrejme pochopiteľne, že sú dostupné aj iné metodológie na stanovenie obsahu tuku v orgáne a je ich tiež možné použit.0017 Štvrtým kritériom, ktoré sa použito, bolo ohraničeníe ostrovčeka. Pre tento parameter sa použila tá istá metodológia značkovanía a pozorovania. Na ohraničeníe sa určili tie ostrovčeky,ktorých priemer bol väčší než 50 m. Aby sa spresnilo, či 2 alebo viac skupín buniek ostrovčekov označkovaných DTZ, ktoré radiálne vyčnievajú zo stredu ostrovčeka alebo na druhej strane, čo je obvyklé, plynulá, ostro vymedzená externá hranica/rovina ostrovčeka, toto rezultovalo pri stanovení slabého ohraničenia. Ak bolo viac ako 50 ostrovčekov dobre ohraničených, tomuto kritériu sa priradila hodnota 1, a ak ich bolo menej ako 50 , hodnota -1.0018 Ostatným kritériom bola veľkost ostrovčeka pankreasu, ktorá bola určená, pokial ide o priemer, relatívne k strednej hodnote priemeru ostrovčekov ujednotlivých živočíšnych druhov. ktoré sa berú do úvahy. Pre hodnotiace účely je určujúcim to, ak stredná hodnota priemeru ostrovčekov v orgáne, ktorý sa berie do úvahy, je väčšia ako priemer. Pre mnohé druhy je stredná hodnota priemeru ostrovčekov pankreasu približne 100 mikrometrov. To platí pre ostrovčeky myší, prasiat i človeka, ako aj pre mnohé iné druhy. Ak mala väčšina skúmaných ostrovčekov, ako bolo opisané vyššie, priemer väčší ako 100 m, bola priradená hodnota 1, pričom v opačnom prípade bola priradená hodnota -1. Na druhej strane, ak sa stredná hodnota priemeru ostrovčeka odlišuje od strednej hodnoty ostrovčeka u prasaľa, použije sa ako referenčná hodnota stredna hodnota priemeru daného druhu. Napríklad je známe, že tilapia, jeden druh rýb, má ostrovčeky pankreasu veľmi veľké, ich priemer je v priemere asi 5 mm. Ak sa berie do úvahy pankreas tilapie, bude medznou hodnotou 5 mm a pozitívna hodnota sa prideli, ak stredná hodnota priemeru ostrovčekov pankreasu bola väčšia ako 5 mm.0019 Hodnoty pre týchto pät kritérií boli zaznamenané do tabuľky pre každý pankreas, ktorý bol skúmaný. Ak bola celková hodnota 1 alebo vyššia, bol organ považovaný ako vhodný donorostrovčekov pankreasu. 0020 Vzorové výsledky pre desat orgánov, ktoré mali celkovú hodnotu 1 alebo vyššiu súHodnota biopsie jednotlivých donorových pankreasovVelkost Hodnota Skupína WIT Farba Tuk ostrovčeka Ohraničenie biopsie W 1561 1 1 1 1 -1 3 021 O 9 1 1 1 1 1 5 Y 8641 1 1 1 1 -1 3 037360 1 1 1 1 -1 3 0786 1 1 1 1 -1 3 Y 8587 1 1 1 -1 -1 1 W 1102 1 1 1 -1 -1 1 W 1524 1 1 1 -1 1 3 039820 1 1 -1 -1 1 1 R 2027 1 1 1 -1 1 30021 Na fotografiách obrázkov 1 A a IB sú prezentované mikrosnímky pankreasu s hodnotou 3,(Obr. 1 A) a pankreas s hodnotou -1 (Obr. 1 B) za účelom porovnania. Na obrázku 1 A sú veľké ostrovčeky pankreasu ( 100 m) evidentne, vzhľadom na ich dobré ohraničenie. Na druhej strane,pankreas zobrazený na obrázku 1 B ukazuje malé, slabo ohraničené ostrovčeky.0022 Podľa štandardov tu opisovaných protokolov, by sa pankreas zobrazený na obrázku 1 B ďalej nespracovával pracovalo sa s ním ďalej kvôli možnosti porovnania, ako sa opisuje v nasledujúcich príkladoch.0023 Pokračujúc v hodnotení objasnenom v príklade 1, pankreasy s hodnotou 1 a vyššou ako aj porovnávací pankreas s hodnotou -1 boli ďalej spracovávané. Z glandulí bol odstránený tuk aspojovacíe tkanivo apotom bol hlavný pankreatický kanálik kanylovaný pomocou nerezovej 16 g ihly s tupým koncom. Roztok HBSS obsahujúci kolagenázu P s koncentráciou 1,5 - 2,0 g/l bol zaliaty v miere 50 ml/mm, pri 30 °C, aby sa získali 2 ml roztoku na jeden gram hmotnostipankreasu. 0024 Pankreas bol následne pokrytý 500 ml HBSS a 2 PS, spolu 200 ml roztoku kolagenázy priteplote 30 °C. Externou cirkuláciou vody teplej 39 °C sa orgán pomaly ohrial na teplotu 37 °C a udržiavala sa stála teplota asi 36-37 °C. Ked sa orgány javili ako disociované a poskytovali malú odolnosť voči manuálnemu tlaku (po asi 10 - 20 minútach celkového času a 5-10 minútach po dosiahnutí teploty 37 °C), sa digescia zastavila.0025 Získaný digestát bol potom centrifugovaný, supernatanty boli aspirované a získaná peleta bola suspendovaná v 10 PS a orgán ochraňujúcom roztoku. Ostrovčeky boli potom čistené na dískontinuálnom Ficolle, pri gradientoch hustoty 1,105, 1,095, 1,085 a 1,05 g/cm , HBSS plus 2 PS v 50 ml skúmavkách. Skúmavky boli centrifugované pri 650 g pri teplote 4 °C a zbierali sa vrstvy obsahujúce ostrovčeky, ktoré boli následne trikrát prepraté v HBSS plus 10 PS, potom sa manuálne čistili od ne-ostrovčekového tkaniva pomocou disekčného mikroskopu. Ostrovčeky boli resuspendované a dve vzorky po 0,5 ml sa použili na výpočet výťažku ostrovčekov.0026 Napríklad pre pankreasy znázornené na obrázkoch 1 A a IB, výťažok pre pankreas s hodnotou 3 bol asi 105 000 ElN (ekvivalent počtu ostrovčekov, ako bolo definované Ricordim a kol., vyššie) pri čistote 98,8 . Na rozdiel od výtažku z orgánu na obrázku IB, kde bol výťažok1101 ElN na jeden gram digestovaného tkaniva. Čistota bola vo všetkých prípadoch cez 90. Pre 9 orgánov bola uskutočnitelnosť získania ostrovčekov väčšia ako 89 . Metodológie pre ich stanovenia sú opísané nižšie.0028 Pri sledovaní izolácie ostrovčekov bolo stanovených viacero parametrov, včítane čistoty a uskutočnitelnosti, akoje zmienené vyššie.0029 Čistota bola stanovená označkovaním vzorky okolo 500 EIN s DTZ, po dobu 10 minút a potom bola vykonaná štandardná odrazová analýza pomocou disekčného mikroskopu a digitálnejkamery. 0030 Uskutočniteľnost bola stanovená označkovaním vzorky fluoresceín díacetátom (FDA) aetídiumbromidom (EB). Na Upresnenie, pridalo sa 500 EIN k 1 ml RPM 1, 10 PS a 1 antibiotíckého/antimykotického (A/A). Potom sa pridalo 20 l značkovača FDA, ktoré sa pripravilo z 10 mg FDA a 1 ml acetónu a 200 l EB, ktoré sa pripravilo z 30 l EB a 1 ml PBS. ostrovčeky boli značkované v tme, po dobu sedem minút a náhodné vzorky 10-50 ostrovčekov boli sledované fluorescenčným mikroskopom a fotografované s cieľom stanoviť uskutočniteľnosť pomocouštandardných odrazových analýz. 0031 Meral sa tiež obsah inzulínu v ostrovčekoch umiestením približne 500 EIN v kyslomalkoholovom extrakčnom roztoku (7,2 ml 1 N HCI, 400 ml 100 denaturovaného etanolu). Vzorky sa skladovali pn -20 °C a uskutočnilo sa vyčlenenie RIA inzulínu.0032 Tento a ďalšie príklady sa zaoberajú otázkou, či ostrovčeky identifikované ako použiteľné a izolované ako bolo opisané, je možné využít aj na prípravu makroperličíek.0033 Vyčistené ostrovčeky boli resuspendované v RPMl 1640 10 PS 1 A/A na objem 2000 ElN/ml. Ostrovčeky boli rovnomerne rozdelené do skúmaviek tak, že každá skúmavka obsahovala 1 ml suspenzie s 2000 EIN.0034 Nasledovalo gravitačné usadzovanie, boli odstránené supernatanty a pridalo sa 0,5 ml 1 ,5 agarózy pripravenej v minimálnom základnom médiu, pri 50 C plus 2,5 pufru HEPES ku každej vzorke pričom sa rovnomerne premiešavali. Potom sa suspenzie vytlačila pod sterilný minerálny olej, aby sa vytvorili štyri perličky s hladkým povrchom a rovnakým rozložením ostrovčekov.0035 Makroperličky sa vybrali a dvakrát premyli (RPMl 5 PS 1 A/A). Tieto makroperličky boli kultivované v tom istom roztoku, vo zvlhčenej atmosfére s 5 C 02, po dobu 5 - 7 dní, potom bolí trikrát premyté v RPMl 1 A/A, po čom nasledovala aplikácia druhej vrstvy agarózy. Na tento účel sa pomocou pipety prenieslo 0,5 ml 5 agarózy v MEM plus pufor HEPES pri 60 °C do sterilnej plastickej lyžičky a každá makroperlička sa popresúvala 3 - 5 krát, aby sa vytvorila rovnomerná druhá agarová vrstva. Nasledoval prenos do sterilného minerálneho oleja tak, aby sa vytvoril hladký povrch, potom sa makroperličky vybrali a dvakrát preprali v RPMl 2,5 PS 1 A/A a inkubováli sa pri 37 °C vo zvlhčenom 5 C 02 plus vzduch.0036 Makroperličky obsahujúce zapuzdrené ostrovčeky boli následne udržiavaná tak, aby boli životaschopné počas viac ako 6 mesiacov a po tomto čase rádioimunologické analýzy preukázali,že pokračovali v produkcii inzulínu na dobrej úrovni.0037 Tento príklad opisuje experimenty týkajúce sa otázky, či ostrovčeky izolované tak, ako tu bolo opísané, budú funkčné aj in vivo.0038 Použili sa neobézne samce myši, ktoré mali diabetes CB 17-PrKdc scid/J, staré 7-9 týždňov. Po týždni aklimatizácie dostali zvieratá 275 mg /kg streptozotocinu ktorý spôsobí diabetes.

MPK / Značky

MPK: G01N 33/50, C12Q 1/02

Značky: vhodnosti, vyhodnocovania, spôsob, pankreasu, izoláciu, ostrovčekov

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-e7595-sposob-vyhodnocovania-vhodnosti-pankreasu-na-izolaciu-ostrovcekov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob vyhodnocovania vhodnosti pankreasu na izoláciu ostrovčekov</a>

Podobne patenty