Spôsob prípravy rekombinantného choriogonadotropínu – hCG zo vzorky

Číslo patentu: 287146

Dátum: 28.12.2009

Autori: Scaglia Laura, Rossi Mara, Paradisi Gianfranco

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob prípravy rekombinantného hCG so špecifickou bioaktivitou v rozsahu 23 000 až 28 000 IU/mg, ktorý zahŕňa kroky: (a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého
(b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatografickom stĺpci
(c) elúciu na druhom ionomeničovom chromatografickom stĺpci
(d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou
a (e) po podrobenie sa eluátu chromatografii rozlišujúcej podľa veľkosti.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu čistenia choriogonadotropínu, najmä čistenia rekombinantného ľudského choriogonadotropínu (hCG) zo vzorky surového rekombinantného hCG. Uvedený spôsob zahŕňa použitie iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou.Choriogonadotropin je heterodimér pozostávajúci z nekovalentne viazaných ot a B podskupín.Choriogonadotropín sa podáva ženám na vyvolanie ovulácie po stimulácii folikulámeho vývoja folikuly stimulujúcim hormónom alebo ľudskými menopauzálnymi gonadotropínmi pri liečbe anovulárnej neplodnosti v dôsledku nízkych koncentrácii gonadotropínov. Jednotlivé dávky 5 000 až 10 000 jednotiek sa podávajú intramuskuláme injekciamí na napodobenie stredového maxima cyklu luteinizačného horrnónu, ktorý normálne stimuluje ovuláciu. Choriogonadotropín sa podáva tiež v spojení s menotroñnom a niekedy tiež s citratom klomifénu (orig. clomiphene) ako doplnok k in vitro fertilizačným postupom a v ďalších asistovaných koncepčných technikách, zahŕňajúcich superovuláciu a zber oocytov. U mužov sa používa V liečbe prepubertálneho kryptorchizmu. Režimy podávania sú v širokom rozmedzí, ale dávky sú zvyčajne v rozmedzí od 500 do 4 000 jednotiek intramuskulámou injekciou tri razy za týždeň.Uvedená látka sa podáva tiež pri mužskej neplodnosti spojenej s hypogonadotrópnym hypogonadizmom. Aj v tomto prípade môže byt režim podávania veľmi rozdielny a dávky majú byt v rozmedzí od 500 do 4 000 jednotiek dva až tri razy za týždeň. Na umožnenie normálnej spermatogenézy sa často pridáva látka s folikulárne stimulujúciou aktivitou, ako je menotrofín. Na oligospermiu možno využiť dávky až do 3 000 jednotiek choriogonadotropínu týždenne s menotroñnom alebo iným folikuláme stimulujúcim prostriedkom V liečbe oneskorenej puberty spojenej s hypogonadizmom u mužov sa podáva dávka 500 až 1 500 jednotiek dva razy za týždeň uvedená dávka má byt nastavená v závislosti od koncentrácie testosterónu v plazme.Na izoláciu a čistenie hCG zo vzoriek surového moču sa používajú rôzne spôsoby (Birken a ďalší, Endocrinology, QB), 1390 až 1397 (l 993) Sakakibara a ďalší, Chem. Phann. Bull., 35(5), 1414 až 1416(l 990)Dinini a ďalší, Acta Endocrinol. EU), 133 až 145 (1973, Na čistenie hCG z moču boli nedávno vyvinuté a použité rôzne spôsoby añnitnej chromatografie, nazvané membránová filtračné añnitná chromatograña (Xu a ďalší, Protein Expression and Puriñcation 16, 221 až 223 (1999. Uvedený spôsob obchádza používanie Sepharose aktivovanej s BrCN ako tuhej fázy pre stĺpcovú afinitnú chromatografiu a predstavuje úpravu zvyčajných spôsobov čistenia hCG afmitnou chromatografiou zo vzoriek moču. Imunoaktivita týmto spôsobom čisteného hCG bola 8 554 IU.mgl.Huth et al., Endocrinology 1994, zv. 135(3), str. 911-918 opisuje puriñkáciu B podjednotky hCG produkovaného v bakteriálnom expresnom systéme, zostavenie rekombinatnej hCG B podjednotky a hCG oz podjednotky z moču, a puriñkáciu diméru prostredníctvom aniónovej výmennej chromatograñe.W 0 98/56808, zverejnená v decembri 1998, opisuje spôsob purifikácie anti CD-l 8 prekurzorovej protilátky, ktorý zahŕňa iónovú výmennú chromatograñu ako aj hydrofóbnu interakčnú chromatograñu (HIC).W 0 98/56808, zverejnená v septembri 1990, opisuje modifikované formy reprodukčných hormónov a farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú.Prednosťou rekombinantného hCG je, že neobsahuje iné gonadotrópne hormóny a nečistoty ľudského pôvodu, najmä tie, ktoré sú obsiahnuté v ľudskom moči. Surove preparáty rekombinantného hCG obsahujú ale všetky ďalšie proteíny a nečistoty z buniek, použitých v procese rekombinantnej prípravy a preto je veľmi naliehavá požiadavka na spôsob, ktorým by sa dosiahla úplná Čistota rekombinatného choriogonadotropínu.Teraz sa zistilo, že surový preparát hCG, odvodený z koncentrovanej vzorky kultivačného prostredia z rekombinantného procesu alebo zo surového koncentrátu moču tehotných žien, možno čistiť tak, že výsledný hCG prakticky neobsahuje proteíny alebo iné znečisťujúce látky, obsiahnuté v surovom preparáte hCG.Uvedený spôsob čistenia je založený na použití iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou. Možné použitie ďalšej kolóny na Veľkostné vylúčenie umožňuje odstránenie všetkých zvyškov znečistenín. Optimálne výsledky sa dosiahnu pri použití najmenej dvoch stupňov iónovo-výmennej chromatograñe.Spôsob podľa tohto vymálezu možno použit na čistenie rekombinantného hCG zo surového preparátu kultivačného prostredia, získaného z rekombinantného procesu. Takto získaný r-hCG má vysoký stupeň čistoty a vysokú špecifickú bioaktivitu (v romedzí 23 000 až 28 000 IU.mg 1), je prakticky bez prosteinov fetálneho bovinného séra (FBS), ak bolo prítomné v kultivačnom prostredí, a nukleových kyselín alebo iných nečistôt,obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese.Spôsob podľa tohto vynálezu možno použiť tiež na čistenie hCG získaného z moču, pričom sa vychádza zo surového koncentrátu moču tehotných žien ďalej ho možno použiť na čistenie CG z iných druhov cicavcov vrátane, napriklad kráv, koní, bravov, oviec a opíc.Podstatou vynálezu je spôsob prípravy rekombinantného hCG, majúceho špecifickú bioaktivitu v rozsahu 23 000 až 28 000 IU/mg, ktorý zahŕňa kroky (a) elúciu vzorky na chromatograñckom stĺpci oxidu kremičitého (b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatograñckom stĺpci (c) elúciu na druhom ionomeničovom chromatografickom stĺpci (d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou a (e) podrobcnie sa eluátu chromatograñi rozlišujúcej podľa veľkosti.Aby sa dosiahli optimálne výsledky spôsobu čistenia, je výhodné uskutočniť dva kroky iónovo-výmennej chromatografie, každý V iných podmienkach. Výhodné uskutočnenie uvedeného spôsobu podľa tohto vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky(a) elúciu vzorky na chromatograñckom stĺpci oxidu kremičitého(b) elúciu na ionomeničovom chromatograñckom stĺpci DEAE Sepharose(c) elúciu na ionomeničovom chromatograñckom stĺpci CM-Sepharose(d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou C 13 oxidu kremičitého a(e) elúciu na chromatograñckom stĺpci Sephacrylu na vylúčenie podľa veľkosti.V 0 výhodnom uskutočnení vynálezu sa elúcia ionomeničového stĺpca DEAE Sepharose výhodne uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 7,5.Elúcia ionomeničového stĺpca CM-Sepharose sa výhodne uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.HPLC s reverznou fázou (krok (d sa výhodne uskutoční s 2-propanol/Tris-fosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou.Uvedený CG podľa tohto vynálezu je výhodne ľudský CG a najvýhodnejšie je to rekombinantný hCG,odvodený z kultivačného prostredia CHO buniek, použitých v rekombinantnom procese.Vynález sa týka spôsobu čistenia hCG, najmä spôsobu čistenia rekombinantného hCG zo surového preparátu z kultivačného prostredia rekombinantného procesu. Uvedený r-hCG sa získa vo vysokom stupni čistoty a s vysokou špecíñckou bioaktivitou (v rozmedzí 23 000 až 28 000 IU.mg 1) a je prakticky bez proteínov fetálneho bovinného séra, ktoré sú prítomné V kultivačnom prostredí a bez nukleových kyselín alebo iných nečistôt, obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese. Vynález je zameraný najmä na využitie v oblasti biologických materiálov, bližšie na využitie pri čistení surových zmesí obsahujúcich hCG a znečisťujúce proteíny uvedené biologické materiály sa v ďalšom texte označujú ako východiskové materiály, V ďalšom podrobnejšie uvedené príklady využívajú východiskové materiály obsahujúce r-hCG, získané zo supematantov z prostredia bunkových kultúr z bioreaktora. Altematívne sa ako východiskový materiál použije surový koncentrovaný moč tehotných žien.Východiskový materiál tvori čerstvo oddelený supernatant prostredia bunkovej kultúry po dvoch dňoch prechodov bioreaktorom. Supernatant sa výhodne číri ñltráciou. Ak treba, surový roztok sa skoncentruje a chromatografuj e na C 4 oxide kremičitom na odstránenie nečistôt pochádzajúcich z bunkovej kultúry.Polovyčistený výťažok, po ultrañltrácii, sa potom podrobí iónovo-výmennej chromatograñi, ktorá sa výhodne raz opakuje a výhodne pri rôznych podmienkach nasleduje HPLC s reverznou fázou. Prvý krok s DEAE Sepharose iónovo-výmennou chromatograñou možno uskutočniť ako v podstate hCG prietokový krok (orig Flow-through step), v ktorom sa eliminuje veľká časť ne-hCG proteínov a DNA. Druhý ionomeničový krok, výhodne na stĺpci CM-Sepharose, je hCG väzbovým krokom a odstraňujú sa pri ňom zvyšky DNA a hostiteľských buniek alebo proteínových nečistôt z prostredia. Vo výhodnom uskutočnení sa tento krok uskutoční pri približne 5 °C elúciou tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.Chromatografia s reverznou fázou na stĺpci C 13 oxidu kremičitého účinne odstraňuje zvyšné stopové množstvá nukeových kyselín a znečistenín pochádzajúcich z bunkových kultúr. Elúcia stĺpca sa výhodne uskutoční 2-propanolom/Tris-fosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou. Zachytený roztok sa potom výhodne podrobí 10 kD deliacej ultrafiltrácii, skoncentruje sa a môže sa spracovať s hydrogenuhličitanom amónnym pri pH 8. Koncentrovaný produkt sa potom spracuje chromatograñckým delením podľa veľkosti na stĺpci Sephacrylu S 200 HR. V tomto kroku sa delenie založené na veľkosti molekuly dosiahne elúciou hydrogenuhličitanom sodným pri pH 8 a odstránia sa ešte možné stopové množstvá znečistenín z bunkovej kultúry, potenciálne agregáty a voľné hCG podskupiny. Eluát sa môže potom podrobiť dialýze ultrañltráciou na membránach s 10 kD hranou, výhodne v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného pri pH 7. Po ñltrácii sa vyčistená dávka hCG výhodne uchováva v sterilných flaštičkách pri nízkej teplote.Príklady uskutočnenia vynálezu Príklad 1Prehľadný vývojový diagram čistiaceho procesuVýchodiskový materiál získaný z procesu kultivácie buniek sa čistí a skoncentruje v piatich postupných chromatografických krokoch.Ďalej uvedený vývojový diagram (tabuľka 1) zhŕňa výhodné uskutočnenie procesu čistenia r-hCG, zahŕňa živice použité pri stlpcovej chromatograñi a zahŕňa princípy operácií v jednotlivých krokoch.Tabuľka 1 Prehľad procesu čistenia r-hCG - vývojový diagramPodrobný opis vývojového diagramu a opis postupu sa uvádza v ďalšom texte. Podmienky v kroku viazania (Krok l) sú také, aké sa bežne používajú v prípadoch, keď východiskový surový materiál má rekombinantný pôvod.Krok I (krok viazania) V tomto kroku (Krok I) sa dosiahne predbežná koncentrácia a vymeni sa tlrnivý roztok, aby bolo zaručené zloženie. Tento krok začína pri teplote miestnosti (Chromatografia na CA oxide lcremičitom) a potom pokraču~je pri približne 5 °C. Výhodný rozsah teplôt je 5 i 3 °C. Tento krok sa jednotlivo opakuje pre každý zber počas produkčného cyklu bioreaktora.Čerstvo oddelene kultivačné prostredie z bíorealctora sa zvyčajne najprv číri fíltráciou.Po vyčírení sa medziprodukt čistí Chromatograñou na stlpci C 4 oxidu kremičitého kolóna sa vopred uvedie do rovnováhy s 25 mM roztokom fosforečnanu sodného pri pH 7. Výhodná oblasť pH je od 6,6 do 7,7. Stĺpec sa premyje 25 mM roztokom fosforečnanu sodného, až sa monitorovaný UV signál vráti na úroveň pozadia. Produkt sa eluuje 34,2-ným (hmotnostne) Z-propanolom v 25 mM roztoku fosforečnanu sodného.Potom sa do roztoku pridá amoniak, až sa dosiahne konečná koncentrácia 1 M. Táto zmes sa 6 hodín inkubuje. Roztok sa potom dvojnásobne zriedi vodou, pH sa upraví na 7,5 pomocou kyseliny fosforečnej(85 -nej), Výhodná oblasť pHje 7,5 i 0,2.Membrány s hranou 10 kD, uchovávane medzi jednotlivými násadami v prostredí 0,05 M roztoku hydroxídu sodného, sa zvlhčia čistenou vodou, až pH klesne na hodnotu približne 8. Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou na 10 kD membráne), aby sa odstránili látky s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 kD, a aby sa elimínovali zvyšky Z-propanolu, a aby sa amónny roztok zmenil na 40 mM roztok fosforečnanu sodného s pH 7,5. Výhodná oblasť pH je 7,5 i 0,2. Výsledný retentát sa získa z membrány pôsobením 40 mM roztoku fosforečnanu sodnćho tak, aby sa získala cieľová koncentrácia proteínu 3 až 15 mgml. Tento roztok sa potom ñltruje a výsledný koncentrát sa uchováva zmrazený pri približne -15 °C.Krok II (Filtrácia a iónovo-výmenná Chromatografia na DEAE Sepharose FF)Tento chromatografický krok je r-hCG prietokový krok, v ktorom sa odstráni veľká časť nie r-hCG proteínov a nukleových kyselín. Filtrácia sa uskutoční pri teplote miestnosti, ale chromatografický krok sa uskutoční v chladnej miestnosti, pričom produkt prechádza kolónou.(i) Roztápanie a združovanie surových koncentrátov r-hCGZmrazené koncentráty sa roztopia a združujú. Z viacerých čistených surových koncentrátov r-hCG, pripravených z rovnakej pracovnej banky buniek sa združí násada, ktorá sa ďalej spracuje. Združovanie rôzneho počtu surových koncentrátov závisí od maximálnej proteínovej väzbovej aktivity (4 mg celkových proteínov na 1 mg živice) nasledujúceho Chromatograñckého kroku čistiaceho procesu.Uvedený roztok r-hCG sa výhodne prepustí ñltračným zariadením a filtre sa premyjú 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Prefiltrovaný roztok a premývacíe roztoky sa spoja.(iii) Iónovo-výmenná Chromatografia na DEAE Sepharose FFKolóna plnená ionexom so slabým nábojom, dietylaminoetán (DEAE) Sepharose, s rýchlym prietokom(Fast Flow, FF) sa uvedie do rovnováhy so 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Potom sa na kolónu privedie roztok r-hCG.Do kolóny sa nasadí 40 mM roztok fosforečnanu sodného pH 7,5. Chromatografický proces sa monitoruje spektrofotometricky pri 280 nm. Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sa vyleje. Zachytáva sa neviazaná frakcia obsahujúca r-hCG.Krok III (Chromatografia na CM Sepharose FF)V tomto chromatografiekom kroku sa odstráni veľká časť hostiteľských buniek. Tento Chromatografický krok sa uskutoční pri približne 5 °C. Výhodné teplotné rozmedzie je 5 i 3 °C.K eluátu z DEAE Sepharose FF sa pridá voda v čistote na injekcie. pH sa upraví na 6 kyselinou fosforečnou (85-nou). Výhodné rozmedzie pH je 6 i 0,1.(ii) Iónovo-výmenná Chromatografia na CM Sepharose FFKolóna plnená ionexom so slabým nábojom, karboxymetyl (CM) Sepharose, s rýchlym prietokom (FF) sa uvedie do rovnováhy s 20 mM tlrnivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Výhodné rozmedzie pH je 6 i 0,1. Potom sa na kolónu privedie roztok r-hCG.Kolóna sa premyje 20 mM tlrnivým roztokom fosforečnanu sodnćho pH 6. Chromatografický proces sa monitoruje spekrrofotometricky pri 280 nm.Produkt sa eluuje 130 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sa vyleje. Zachytáva sa Celý podiel eluátu obsahujúci r-hCG. Získaný produkt možno v tejto etape voliteľne filtrovat na odstránenie kontaminácie vírusmi.

MPK / Značky

MPK: C07K 14/435, C07K 1/00

Značky: rekombinantného, choriogonadotropínu, spôsob, přípravy, vzorky

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-287146-sposob-pripravy-rekombinantneho-choriogonadotropinu-hcg-zo-vzorky.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob prípravy rekombinantného choriogonadotropínu &#8211; hCG zo vzorky</a>

Podobne patenty