Aminokyselinová sekvencia, sekvencia DNA, ich fragmenty, vektory, spôsob produkcie transgénnych zemiakov s modifikovaným stupňom vetvenia amylopektínového škrobu a ich použitie na výrobu škrobu

Číslo patentu: 284999

Dátum: 15.03.2006

Autori: Larsson Clas-tomas, Ek Bo, Khosnoodi Jamshid, Larsson Hákan, Rask Lars

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Sú opísané aminokyselinová sekvencia vetviaceho enzýmu škrobu zemiakov II (SBE II), ktorá je schopná ovplyvniť pomer amylózy a amylopektínu v zemiakovom škrobe ako tiež znížiť alebo zmeniť profil vetvenia amylopektínu, jej fragment, ktorý si zachováva funkčné vlastnosti enzýmu s kompletnou sekvenciou, izolovaná sekvencia DNA kódujúca tento enzým a jej fragmenty a varianty, vektor obsahujúci celú alebo funkčne aktívnu časť uvedenej sekvencie DNA. Ďalej je uvedený spôsob produkcie transgénnych zemiakov so zvýšeným alebo zníženým stupňom vetvenia amylopektínového škrobu, ktorý zahŕňa prenos a vnesenie uvedeného vektora do genómu buniek zemiakov, regeneráciu intaktných celých rastlín z transformovaných buniek a použitie týchto transgénnych zemiakov na výrobu škrobu.

Text

Pozerať všetko

Predkladaný vynález sa vzťahuje na nový enzým zemiakov spôsobujúci vetvenie škrobu. Konkrétne sa predkladaný vynález vzťahuje na aminokyselinovú sekvenciu druhého enzýmu spôsobujúceho vetvenie zemiakového škrobu (SBE ll z starch branching enzyme), ďalej s touto sekvenciou súvisiaci fragment a korešpondujúce DNA. Ďalej sa vynález vzťahuje na vektory zložené z takých sekvencií DNA, ktoré sú použiteľné na produkciu transgénnych zemiakov a na použitie týchto zemiakov na produkciu škrobu.Škrob je zložitá zmes rôznych molekulových foriem,odlišujúcich sa stupňom polymerizácie a vetvenia glukózových reťazcov. Škrob sa skladá z amylózy a amylopektínu,pričom amylóza je zložená z v podstate lineárneho ot-l,4-glukánu a ot-mylopektín je zložený z u-l ,4-glukánov spojených vzájomne cez ot-l,6-mostíky, takže vzniká rozvetvený polyglukán. Znamená to, že škrob nie je jednotný hrubý materiál.Škrob je syntetizovaný v najmenej troch enzymatických reakeiách, V ktorých sú zahmuté ADPglukózofosforyláza(EC 2.7727), syntetáza škrobu (EC 2.4.l.2 l) a enzým vetviaci škrob (vetviaci faktor) (EC 2.4118). Predpokladá sa,že enzým vetviaci škrob (SBE, tiež nazývaný Q-enzým či vetviaci faktor) má dve rôzne enzymatické aktivity. Katalyzuje jednak hydrolýzu oL-lA-glykozidických väzieb a jednak Lő-glykozidických väzieb vznikajúcich počas syntézy vetvených komponentov škrobu, napríklad amylopektínu.Rastlinný škrob je hodnotný zdroj obnoviteľnej suroviny, používanej napríklad v chemickom priemysle Visser, R. G. F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition. TibTech ll, 63 - 68 1993). Kvalita škrobu musí spĺňať nároky priemyselných procesov, v ktorých je uniformita štruktúry dôležitým kritériom. Pre priemyselné aplikácie sú potrebné rastliny obsahujúce škrob zložený bud len zamylózy, alebo rastliny majúce škrob obsahujúci len amylopektin.Postupy zvyšujúce pomer amylózy k amylopektínu v škrobe boli už navrhnuté. Napríklad vo W 095/04826 sú opísané sekvencie DNA, kódujúce enzýmy znižujúce vetvenie, teda so schopnosťou znížit alebo Zvýšit stupeň vetvenia amylopektínu v transgénnych rastlinách, napríklad v zemiakoch.Vo WO 92/ 14827 sú opisane plazmidy majúce sekvencie, ktoré po inzercii do genómu rastlín spôsobujú zmeny v koncentrácii uhľohydrátov a uhľohydrátovom zložení regenerovaných rastlín. Tieto zmeny môžu byt získané pomocou sekveneie vetviaceho enzýmu, ktorá je umiestená na týchto plazmidoch. Predpokladá sa, že tento vetviaci enzým zvyšuje pomer amylózy k amylopektínu V rastlinnom škrobe, najmä v komerčne využívaných rastlinách.WO 92/ 14827 opisuje len doteraz známy škrobový vetviaci enzým pri zemiakoeh a ani odbomíci nevedia, či sú v procese syntézy vetveného škrobu zemiakov zahmuté ešte ďalšie enzýmy.V Mol Gen Genet (1991) 225, 286 - 296, Visser et al.,je opísaná inhibícia expresie génu, pomocou antisence konštruktu, pre granulovo viazanú syntetázu škrobu. lnhibícia enzýmu pri škrobe zemiakových hľúz bola až 100 , čo znamená, že sa v týchto prípadoch tvoril bezamylózový škrob. Predchádzajúci spôsob nebol však takto úspešný v pripade inhibície amylopektínu a altematívna metóda inhi bicie amylopektínu je preto stále žíaduca. Muuller-Roober,B., Kosmann. J., (1994) Approaches to influence starch quantity and starch quality in transgenic plantss. Plant Cell Environm. 17, 601 - 613 Martin. C., Smith, A. (1995) Starch Biosynnthesis, Plant Cell 7, 971 - 985.Predmetom predkladanćho vynálezu je zmena stupňa vetvenia amylopektínu a pomeru amylopektín/amylóza v zemiakovom škrobe.V súvislosti s tým je predmetom vynálezu aminokyselinová sekvencia vetviaceho enzýmu škrobu zemiakov Il(SBE Il) majúca sekvenciu zobrazenú na SEQ ID No. 1,ktorá je schopná ovplyvniť pomer amylózy a amylopektínu v zemiakovom škrobe ako tiež znížiť alebo zmenit profil vetvenia amylopektínu, ako aj jej fragment, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu zobrazenú na SEQ ID No. 2 a ktorý si zachováva funkčné vlastnosti enzýmu s kompletnou sekvenciou.Ďalším aspektom predmetu vynálezu je izolovaná sekvencia DNA kódujúca vetviaci enzým škrobu zemiakov ll(SBE ll) obsahujúca nukleotidovú sekvenciu zobrazenú na SEQ ID No. 1 a jej varianty vzniknuté degeneráciou genetického kódu.lným aspektom predmetu vynálezu je fragment izolovanej sekvencie DNA zobrazenej na SEQ ID No. l a kódujúcej vetviaci enzým škrobu zemiakov ll (SBE ll),schopný ovplyvniť pomer amylózy a amylopektínu v zemiakovom škrobe, ako tiež znížiť alebo zmenit profil vetvenia amylopektínu. Týmto fragmentom je prednostne fragment obsahujúci 50-3074 bp nukleotidovej sekvencie zobrazenej na SEQ ID No. 1 a jeho varianty vzniknuté degenerácíou genetického kódu alebo fragment obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zobrazenú na SEQ 1 D No. 2, pričom sú zachované jeho funkčné vlastnosti.lným aspektom predmetu vynálezu je vektor obsahujúci celú alebo funkčne aktívnu čast uvedenej izolovanej sekvencie DNA a regulačné oblasti aktívne v zemiakoch. V tomto vektore môže byť sekvencia DNA v otočenej (antisense) orientácii proti promótoru bezprostredne jej predchádzajúcemu.Ešte ďalším aspektom predmetu vynálezu je spôsob produkcie transgénnych zemiakov s bud zvýšeným, alebo zníženým stupňom vetvenia amylopektínového škrobu, ktorý zahñía nasledujúce kroky a) prenos a vnesenie uvedeného vektora so sense konñguráciou do genómu buniek zemiakov a b) regeneráciu intaktných celých rastlín z transformovaných buniek.Ešte ďalším aspektom predmetu vynálezu je spôsob produkcie transgénnych zemiakov so zníženým stupňom vetvenia amylopektínového škrobu, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky a) prenos a vnesenie uvedeného vektora s antisense konfiguráciou do genómu buniek zemiakov a b) regeneráciu intaktných celých rastlín z transformovaných buniek. V tomto prípade môže vektor obsahovat tiež antisense konštrukt enzýmu spôsobujúceho vetvenie škrobu I(SBE I) a/alebo antisense konštrukt granulovo viazanej syntetázy škrobu zemiakov a/alebo antisense konštrukt rozpustnej syntetázy škrobu ll a 111 zemiakov a/alebo antisense konštrukt enzýmu vyvolávajúceho disproporcionáciu škrobu (D-enzýmu) zemiakov a/alebo antisense konštrukt 0 dvetvovacieho enzýmu škrobu zemiakov.Konečne je predmetom vynálezu tiež použitie transgénných zemiakov pripravených uvedeným spôsobom na výrobu škrobu.Nová sekvencia DNA kódujúca SBE II, obsahujúca 3074 nukleotidov a tiež korešpondujúca aminokyselinová sekvencia obsahujúca 878 aminokyselín je ukázaná v SEQ D No. l. Jeden fragment s dĺžkou 1393 nukleotidov uvedenej sekvencie DNA, korešpondujúci s nukleotidmi 1007 až 2399 DNA sekvencie V SEQ ID No. 1. a tiež korešpondujúca aminokyselinová sekvencia obsahujúca 464 aminokyselín sú ukázané v SEQ lD No. 2.V nasledujúcej časti je vynález opisaný detailnejšie. V tejto časti je opisaná tiež experimentálna časť a sprievodné obrázky.Prehľad obrázkov na výkresochObr. l ukazuje SDS polyakrylamidovú elektroforézu proteínov extrahovaných zo škrobu normálnych zemiakov(línia A) a transgénnych zemiakov (línia B). Chýbajúce proteínové škvmy sú označené šípkami. Línie M sú markérmi molekulovýeh hmotnosti (kDa).Obr. 2 ukazuje 4 peptidové sekvencie odvodené od naštiepených proteínov škrobu zemiakových hľúz.Izolácia škrobu zo zemiakových hľúzRastliny zemiakov (Salanum tuberosum) boli pestované na poli. Olúpané hľuzy kultivaru Early Puritan alebo transgénnej línie zemiakov, ktorým prakticky chýba syntetaza škrobu 1 viazaná na granulky (Svalöf Weíbull AB, intemational application number PCT/SE 91/00892) boli homogenízované pri 4 °C. Do frakcie zbavenej hrubých častíc (juice fraction), obsahujúcej veľkú čast škrobu, boli ihned pridané Tris -HCl pufer, pH 7,5 tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 50 mM, Na 4 P 2 O 7 (ditioničitan sodný) tak,aby jeho výsledná koncentrácia bola 30 mM a EDTA tak,aby výsledná koncentrácia bola 10 mM. Škrobové granulky sedimentovali počas 30 minút, potom boli 4 x premyté desaťnásobným množstvom premývacieho pufra (50 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Škrob, ktorý medzi každým premytim sedimentoval 30 minút pri 4 °C bol nakoniec trikrát premytý troma objemami acetónu, usušený cez noc voľne na vzduchu a Skladovaný pri -20 °C.Extrakcia proteínov zemiakového škrobuSkladovaný škrob (20 g) bol kontinuálne zmiešaný s 200 ml extrakčného pufra (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2(hm./obj.) sodiumdodecylsulfát (SDS), 5 mM EDTA) postupným pridávanim pípetou pri 85 °C tak dlho, dokial škrob nezželatinizoval. Vzorky boli potom na jednu hodinu zmrazená pri -70 °C. Po rozmrazeni pri 50 °C boli vzorky centrifugované 20 minút pri 12000 x g a l 0 °C. Supematant bol zhromažďovaný a opäť centrifugovaný IS minút pri 3000 x g. Výsledný supematant bol preñltrovaný cez filtre 0,45 m a k nemu boli potom pridané 2,25 objemy ľadového acetónu. Po 30 minútach inkubácia pri 4 °C bola zrazenina proteínov oddelená centrifugáciou (3000 x g počas 30 minút pri 4 °C) a rozpustená v 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Časť každej preparácie bola analyzovana pomocou SDS polyakrylamidovej elektroforézy podľa Laemliho (1970)(obr. l). Proteíny v zvyšnej časti preparácie boli skoncentrované vyzrážaním trichlóroctovou kyselinou (10 ) a potom rozdelené na 8 SDS polyakrylamidovom géli podľa Laemliho U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T 4. Nature 227, 680 - 685 (obr. l). Proteíny v géli boli ofarbenéCommassie Brilliant Blue R-250 (0,2 v roztoku 20 metanolu, 0,5 octovej kyseliny a 79,5 HzO).Ofarbené prúžky proteínov označené šípkami (obr. l) korešpondujú s molekulovou hmotnosťou okolo 100 kDa,boli vyrezané a dvakrát premyté v 0,2 M roztoku ljlH 4 HCO 3 v 50 acetonitrile pri stálom miešaní pri 35 °C. Cas každého premývania bol 20 minút. Po každom premyti bol roztok odstránený a kúsky gélu boli vysušené odparenim v digestóriu. Dobre vysušené kúsky gélu boli potom každý zvlášť položené na paratilm a k nim boli pridané 2 l roztoku 0,2 M NH 4 CO 3, 0,02 Tween-20. Potom boli na kúsky gélu nanesené 2 l (25 g) modifikovaného trypsinu(Promega, Madison, W 1, USA). Po ich vsiaknutí boli nanášané 5 l objemy 0,2 M NH 4 CO 3 tak dlho, dokial gély nenadobudli svoje pôvodne veľkosti. Kúsky gćlov boli ďalej rozdelené na tri časti a prenesené do ependorfiek. Do každej bolo pridaných 200 l 0,2 M NH 4 CO, Proteíny obsiahnuté v kúskoch gélu sa potom rozkladali cez noc pri 37 °C (Rosenfeld et al. 1992), In-gel digestion of proteins for intemal sequence analysis after one - or two - dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem 203, 173 - 179. Po úplnom rozklade bola pridaná kyselina trifluóroctová tak, aby výsledná koncentrácia bola 1 . Supematant bol odobraný a uschovaný. Kúsky gélu boli ďalej extrahovanć dvakrát 200 l zmesi obsahujúcej 60 acetonitril. 0,1 kyselinu tritluóroctovú a 0,02 Tween-20. Tieto supematanty boli spojené s ostatnými supematantrni a ich objem bol redukovaný na 50 l odparením. Extrahované peptidy boli rozdelené na chromatograñckom systéme SMART(Pharmacia, Uppsala, Sweden) s kolónou RPC C 2/Cl 8 SC 2.1/ 10. Peptidy boli eluované 0 - 60 gradientom acetonitrilu v 0,1 kyseline trifluóroctovej. Separácia trvala 60 min. pri prietoku 100 l/min. Peptidy boli sekvenované na sekvenátore Applied Biosystems 470 A s plynnou fázou a s on line PTH aminoanalyzátorom (l 20 A) alebo na modeli 476 A podľa návodu výrobcu (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA).Štyri zo sekvenovaných peptidov dali jednoducho interpretovateľné sekvencie (obr. 2). Prehľadanie databáz ukázalo, že tieto štyri peptidy majú podobnosť so škrobovými vetviacimi enzýmami. Zaujímavé bolo zistenie, že tieto peptidy boli viac príbuzné šlcrobovému vetviacemu enzýmu Il z iných rastlinných druhov ako škrobovému vetviacemu enzýmu 1 zo zemiakov.Konštrukcia oligonukleotidov kódujúcich peptidy 1 a 2Degenerované oligonukleotidy kódujúce peptid l a 2 boli eyntetizované ako priméry (v obidvoch smeroch) Oligonukleotid 1 5- gtaaaacgacggccagtHje A, C alebo T,1 jeinozin, Kje G alebo T. N je A, C, G alebo T, R je A alebo G, Y je C alebo T. Bázy označené malými písmenami boli pridané ako pripájacie (tag) sekvencie.Puriñkácia mRNA zo zemiakových hľúz, syntéza cDNA a PCR amplifikácia cDNA fragmentov korešpondujúcich so škrobovým vetviacim enzýmom zemiakov II pomocou PCRCelková RNA zo zrelých zemiakových hľúz (S. tuberosum cv. Amanda) bola izolovaná podľa Logemanna et al.(1987), lmproved method for the isolation of RNA fromplant tissues. Anal. Biochem. 163, 16 - 20. Prvý reťazec cDNA bol syntetizovaný pri použití 2 g celkovej RNA a 60 pmol oligo-dTm ako prímár pre kódujúci reťazec. Primár bol pripojený na polyA mRNA pri 60 °C počas 5 minút. Predĺženie cDNA bolo uskutočnené pomocou systému Riboclone cDNA Synthesis Systém M-MLV (H-) (Promega) podľa technického manualu výrobcu.cDNA kódujúca nový škrobový vetviaci enzým Il(podľa vynálezu) bola amplifikovaná na prístroji Perkin-Elmer GeneAmp 9600 PCR thcrmocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) pri použití dvoch degenerovaných primárov odvodených od peptidov l a 2 (pozri skôr) pri týchto podmienkach l mM dNTP, 1 M primáry a príslušné množstvo cDNA opísané. Celkový objem reakčnej zmesí bol 20 l a obsahoval l x pufer AmplíTaq a 0,8 U AmplíTaq (Perkin-Elmer Cetus). Podmienky v cykleri boli tieto 96 °C počas jednej minúty, 80 C V momente,kedy bol enzým pridaný do reakčnej zmesi (tým bola spustená reakcia). Pri tejto teplote bola reakcia udržiavaná počas cca 15 minút. Nasledoval nezamýšľaný pokles teploty na 25 °C, pät cyklov pri 94 °C počas 20 sekúnd, 1 min. pri 45 °C, jednominútový nárast na 72 °C, dve minúty pri 72 °C. 30 cyklov 5 sekúnd pri 94 °C. 20 sekúnd pri 45 °C a 2 min. 2 sek. pri 72 °C. Teplota 72 °C bola nakoniec udržiavaná počas nasledujúcich 10 minút pred ochladenim na 4 °C.Vzorka z tejto reakcie (0,1 l) bola reamplifikovaná pri týchto podmienkach 96 °C počas 1 min., 80 °C vo chvíli,kedy bol enzým pridaný do reakčnej zmesi (tým bola spustená reakcia), pri tejto teplote bola reakcia udržiavaná počas cca 5 minút. Nasledovalo pät cyklov 20 sekúnd pri 94 °C, 1 minúta pri 45 °C, 2 minúty pri 72 °C a 25 cyklov,5 sekúnd pri 94 °C. 30 sekúnd pri 45 °C, 2 min. 2 sek. pri 72 °C. Teplota 72 °C bola nakoniec udržiavaná počas nasledujúcich 10 minút pred ochladenim na 4 °C. Po dokončeni PCR amplifikácie bola reakcia nanesená na 1,5 agarózový gél Seakem (FMC Bioproducts, Rockland, ME,USA). Po elektroforéze a ofarbeni gélu etídiumbromidom bol najsilnejší prúžok s veľkosťou 1500 bp vyrezaný a fragmenty boli eluované trepanim vo vode (200 l) počas jednej hodiny. Tento fragment bol po reamplifikácii pri použití primárov korešpondujúcich s tag sekvenciami (v oligonukleotidoch 1 a 2) a puritikácii pomocou elektroforázy na agarózovom géli tak, ako bola opísaná a potom extrakcíi z gélu pri použití extrakčného kitu Qiaex (DIAGEN GmbH, Hilden, Germany) podľa inštrukcie výrobcu, použitý ako templát na sekvenovanie. Sekvenovanie bolo uskutočnené pri použití kítov DyeDeoxy Terminator Cycle Sequences kit (Perkin-Elmer Cetus Instruments) a pri použití tag sekvencii a interných primárov. Sekvenovanie bolo analyzované na prístroji Applied Biosystem 373 A DNA sekvenátor podľa návodu výrobcu. Sekvencia bola potom zostavená a obsahovala 1393 bp.Na dokončenie stanovenia sekvencie škrobového vetviaceho enzýmu II boli 5 a 3 konce úplnej DNA amplifikované z rovnakej celkovej RNA ako v predchádzajúcom pripade pri použití techniky rapid amplification of cDNA ends (RACE), pri ktorej boli použité špecifické primćry odvodené od sekvencie dlhej 1393 bp. V pripade amplifikácie 3-konca bol použitý primér T 290 proti polyA koncu a v prípade 5-konca bol použitý kit 5/3 RACE kit od firmy Boehringer Mannheim (Cat. No. 1734792). Fragmenty z týchto amplifikácíí boli opäť rovnakým spôsobom sekvenované pri použití intemých a koncových primárov. Sekvencie z týchto dvoch koncov boli pridané k 1393 párombáz tak, že dali zloženú celú dĺžku sekvencie cDNA. Od tejto sekvencie boli odvodené priméry tak, aby bolo možné amplifikovat celú kódujúcu časť v jednom kuse. Čiastočná osekvenovanie amplifikovanej kódujúcej cDNA potvrdilo prítomnosť cDNA korešpondujúcej so zloženou sekvenciou. Celková dlžka cDNA je 3074 bp a translátovaná sekvencia sa skladala z 878 aminokyselín. Protein v konečnej forme obsahuje 830 aminokyselín.Porovnanie takto zistenej sekvencie s údajmi v databankách EMBL a GeneBank ukázalo 68 identitu so škrobovým vetviacim enzýmom I zo zemiakov a asi 80 /u identitu so škrobovým vetviacim enzýmom II z iných rastlinných druhov. Vynálezcovia preto nazvali enzým kódovaný novou sekvenciou vetviaceho enzýmu škrobový vetviaci enzým zemiakov II (potato starch branching enzyme Il).Izolovaná úplná cDNA Škrobového vetviaceho enzýmu zemiakov Il a ďalšie funkčne aktívne fragmenty v rozmedzí 50 - 3074 párov báz boli klonované v obrátenej orientácii za promótormi aktívnymi V zemiakových hľuzách. Tenninom funkčne aktívne sú označované fragmenty, ktoré ovplyvňujú pomer amylózy k amylopektínu v zemiakovom škrobe. Aminokyselinová sekvencia a sekvencia DNA SBE Il a ďalej jeden fragment DNA a jemu zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia (ktoré sú predmetom vynálezu) sú ukázané V SEQ ID No. l a 2.Ako promótory boli vybrané napríklad papatín promótor, promótor génu kódujúceho viazanú škrobsyntázu I alebo promótory izolované z génov kódujúcich vetviaci enzým zemiakov l a Il.Konštrukty boli klonované známymi technikami, bud pomocou Ti-plazmidu, vektora vhodného na transformáciu zemiakov sprostredkovanú Agrobacterium trumefaciens,alebo pomocou vektora vhodného na použitie balístickými technikami či elektroporácii. Sense aj antisense konštrukty obsahovali všetky potrebne regulačné elementy.Transgćnne rastliny zemiakov potom transkribujú špecificky V hľuzách konštrukt - inverzný škrobový zemiakový enzým II - čo vedie k antisence inhibícii enzýmu. Ďalej k zníženiu a zmene spôsobu vetvenia amylopektínu a tiež k zmene pomeru amylózy k amylopektínu, čo sa potom prejaví pri ich zemiakovom škrobe.Antisense konštrukt pre škrobový vetviaci enzým ll bol tiež použitý v kombinácii s antisense konštruktmi pre škrobový vetviaci enzým l, pre škrobsyntázu II viazanú na granulky, pre rozpustnú zemiakovú škrobsyntázu ll a III, pre škrobový D-enzým a pre enzým spôsobujúci zníženie vetvenia (debranching enzýme) zemiakového škrobu. Tieto konštrukty boli vytvorené s cieľom transformovať zemiaky a zmenit stupeň vetvenia amylopektínu a pomer amylózy k amylopektínu, To poskytne novú a hodnotnú surovinu pre procesy v priemysle škrobu.Kompletná sekvencia cDNA kódujúcej tento enzým je v odlišných konštruktoch klonovaná v sense orientácii pod jedným či viacerými uvedenými promótonni. Tieto konštrukty sú prenesenú do vhodných opísaných transformačných vektorov a tieto sú potom použité na transformáciu zemiakov. Regenerované transformované zemiaky produkujú nadbytok škrobového vetviaceho enzýmu Il v hľuzách, čo vedie k zvýšenému slupňu a zmene vetvenia amylopektínu či inhibícii transkripcie endogénneho škrobového vetviaceho enzýmu ll pôsobením kosupresie. Výsledkom je potom zníženie vetvenia amylopektínu.Meno beII (branchíng enzyme II - vetvíaci enzým) zo So lalnum luberosum (zemiak) Dlžka sekvencíe 3074 bpnasmu Inacamuc IAGTRFSAC numa Imunita naąnssu mnm Am u nise V ry Ly sa un my he ss un Gly up Aw Ääqłu-n-15 -10 -5 ATĽGKITQAÄÄGTCTÉ TMIAÄT 1 CC Leo n Gin Lyn sa s y zu se. x s odo n. sc zo GLu xras .na ATC QA cx tr ASC S t) Mu. Glu KLI All 5 Losu-rmmmmcąrcacmmąacsrcąmrmmną an n. Ly n. Glu mn AIpMyVnl Gin zo s s .up hu mmmmmaandccąrmwrrmrcącnaącząm mysozvąl G 1 Gluhuhagľ u se Sa nu G 1 bu m ID IS WGly Gły Lyn Alu Hu Gxlu It ny n Inn Äxn TI Su Glu Glu 95 S 00 105mmmmmwmmmmmącmmcą u. u up Glu surhspàzy n u an Azq ay n r ra us 12 a .25mąmcąrcwsmnxsrrxrcąxmuąccccmmmuc raymmy ou ya u n c-.u u. u v nu bu n u. so as naucaxncacnantcąnznssrrmmąccrnrzuocrntnvą All Klak-plyn fy 61.11 Gly Gly 149 Ch MI PM SQ Ak Gly ty w u mmmmwrmnaoarmcrmcarucmwacwrm Blu Lyzxncxy 1 mm u s sumou n rł-íyzuq mu 175 ap us saumscrcrremcmunxucctaacmtmwcąamrľtąxxcnł rzpunrn Gly n GLn S n ALADu na zly Mp Pit-autucąomrrrmcuamrurmamrsaxxwromwxmrccruz Glu n n hu Fłv Aan Aan vn h my sa xv u n r a 225 23 a as)m 1 y.-A|Gly 1.0 y yxksřr r cLu zlu au Aąmn 1 ao ASH n ay ht Se s r tu Br. ny n As s y Val m 5 3 m asAxrmamcxrmmmccrtzcmmmmozncmr hr Hu an, »p an v m. r n n 11, Lyn nu Gly y u zo sa 33 awmmncamcasccsrmumm Amp x Al za sa so 3 -he nymso C 51622 G 1 MA Ani G 1 Ty u m ľ TK m s ny hu an u ry 41.5 42 a zs 43 a mmmcącmcmwmmmmaąrmmmmu ma Lynn TrpGlu vulauąrgmnuuu arm-an. m rryn-.n435 un us mcąrmąncmmmmmmmcąrmmmm n Len Ju GLu h Ly Pr. u Gly n Lw n As GLy v) h se150 ú n mam -ratmococcsarnąumczuwncm sancu 11 s u n ry m u si GU nu se vd. Gly hn n Gly m nysa nn n anmnnmaaactzccaxcrmmm-mmmłxrcta nu mu Glu Iy-PłwGLyIALIMIIPAIVIlLIpMnVH vga-runna JIS nu mcma-cmpatctrąrweccmnccumnmm n u nu Valłunhphu Ihr-u Gly un Pho FmMgM-a n n us sme as 510 mmmxmrcrrxacaamcuccmartn 1 x 1 cxmm na n Gly Glu p v 1 s Gly x p r h n Pr v G 2515 za 52 s arcmocrunazmmcnrmccmmxmmmmsą mi up Gly Ly v my r h W 19 m u r Al n a Mp52 m as 54 a mmuruzmucnamcwncąrcąsmłxmmmscsr 2 on 5 l T 2 n cm nu 1 m Lyx Lyn Icq u GLu h tz Lg v) GLy550 565 SN rcarpcomaałmcar aruatmmctcmąrnułctln 2102 sa y m (nu s vi M ou n nu m. Gly u Lys n n 51 s ao su sa anncmnmncnącmcxrnsznmrmuuamcmw 11.50 N. n np hu n np Ly m n m h bn v Ju. au Mp535 600 C 05 maal-mmmmmmosrmąntząrmcącwnm na Lvľzv Sun Sulnu IlaLvçAwGLy Klein Lzuñhlyałknu s zo mmcrrmmmoamnscamcwncmnłm 2245 le Lg Lan m n m. my m my Gly mu Gly y un u va Gly Jun an r ay 2 r um n n. An r m m uu. sa . mcąacąccrcxwmraxtąmmeummaamm u au Gin tu hu s u Gly s.- va. x 1 p. m., run Gun P s css san us nonrmmmcamcesxnmmncxuwmrccammm zasa Ty L 7 1 x Cy k »zo k m. up su ky up A 1 Glu zly nu S 75 no as manconoasnummmspcwmxrscącnrcrxm 240 ky Ty Az my ho al alu m Mp Az n n an ay u. nm un 55 mo numnrmnmncmmmuząsncuąmcmm as Mp Ly ry G 1 Phi H Th S (Ju HL GL Phe Il S 1 ty705 71 h 715 nrmetmcąrlmazyxneummmąmaąccmmm 254 up Glv Gly hp An K ne v h Blu by Gly n Lu vnl Ph72 a 725 71 a evcmnrmcmrcąmmąccwmącmrmcmm sa v n u 7 n- u 1 m Ly s ry so le» Qu- kr n my 73 s 74 a 74 s 15 a rcccmnswrmmrącmmrnccrrcmmwuracą 250(y hu Lyn zo (dy 14) lyx Ly Val N. hu Mp Bar h up m77 a ITS 790 mažxontmntoxmtwrmccxmanxvmczunm 1721 he Glu my L-,a 1 y u tu kg 29 A 1 se n m v y n75 790 795 wrAmxaAmmmczc-nrmącnmwwmmw 2114 in s Mg Th ALI V Vax. u A 1 Mu V up Lyn alu alu GLE 00 205 D 16 ąxwmmmxvacummwmmuhwmm 122 axu mu mu mu v 1 Ju v 1 v. cLu slu vu vn v) cm Glu Glu E 15 U 20 A 25 BJD m man crx-pan m-munm manga mnam cncmsn un n. mmcum. Hmmm mamu mama CMANIGTTI CCAATTCHT 29 mĽÉTÄĽÄG 1551935175 ÄTÄDÄKÄG IEAIĚQHG CHCEME ÄTXIĚĽĽAÄA

MPK / Značky

MPK: C12N 15/82, A01H 5/06, C12N 9/10

Značky: transgénnych, aminokyselinová, amylopektínového, modifikovaným, stupňom, použitie, zemiakov, produkcie, vektory, sekvencia, škrobu, fragmenty, vetvenia, spôsob, výrobu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-284999-aminokyselinova-sekvencia-sekvencia-dna-ich-fragmenty-vektory-sposob-produkcie-transgennych-zemiakov-s-modifikovanym-stupnom-vetvenia-amylopektinoveho-skrobu-a-ich-pouzitie-na-vyro.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Aminokyselinová sekvencia, sekvencia DNA, ich fragmenty, vektory, spôsob produkcie transgénnych zemiakov s modifikovaným stupňom vetvenia amylopektínového škrobu a ich použitie na výrobu škrobu</a>

Podobne patenty