Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál, spôsob jeho prípravy, farmaceutický výrobok, diétny doplnok a použitie vysušeného rastlinného materiálu

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný fermentovaný, vysušený rastlinný materiál, ktorý má imunostimulačný účinok a inhibuje vznik metastáz. Ďalej sú uvedené farmaceutické prípravky, ktoré tento rastlinný materiál obsahujú, výrobný proces a využitie vysušeného materiálu pri výrobe diétneho doplnku a farmaceutických prípravkov, ktoré majú imunostimulačné účinky a inhibujú vznik metastáz.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka fermentovanćho a vysušenćho rastlinného materiálu, ktorý ma imunostimulačný účinok a potláča vznik metastáz, farmaceutických prostriedkov, ktoré ho obsahujú, spôsob prípravy materiálu, použitie vysušeného rastlinného materiálu ako diétneho doplnku a výroby imunostimulačných, a najmä farmaceutických prostriedkov potláčajúcich vznik metastáz.Jedným z hlavných cieľov liečenia nádorov je potláčanie metastáz, lebo primárny nádor, ktorý je spôsobený malígnym rastom buniek, sa šíri metastázami do susedných buniek a orgánov a spôsobuje vznik týchto sekundárnych nádorov, ktoré sa môžu chirurgicky odstrániť a tiež sa môžu stať odolnými proti chemoterapii.Výskumníci sa stále viac sústreďujú na vývoj imunomodulačných materiálov a intenzívne sa skúmali prírodné materiály - hlavne rastlinného pôvodu.Je dobre známou skutočnosťou, že zlúčeniny s ehinónovou štruktúrou majú dôležitú biologická úlohu. Niekoľko chinónových derivátov sa nachádza v rastlinách, ako sú napr. ubichinóny, plastochinóny a menachinóny, ktoré majú úlohu vo fotosyntéze, ale tiež V bunkovom dýchacom systéme stavovcov, teda tiež ľudí, v zrážaní krvi atď. Niekoľko benzochinónových derivátov sa tiež používa na liečebné účely. Adriamycin, daunorubicín a mitomycín C sú chinónové deriváty s cytostatickým účinkom, zatiaľ čo iné benzochinóny a hydrochinóny majú antimikrobiálny účinok a sú aktívnymi zložkami antibiotík, ako sú Tetran-B, Metacyclin a Doxycyclin, vhodnými na liečenie bakteriálnych infekcii.Literatúra udáva, že 2,6-dimetoxy-p-benzochinón (2,6-DMBQ) a Z-metoxy-p-benzochinón (2-MBQ) majú fungicldny a bakteriostatický účinok a sú tiež cytotoxickć pre malígne nádorové bunky. Int. J. Quant. Chem. Quant. Biol. Szmp. 7., 217 - 222 (1980), 9., 27 - 30 (1982) a 12.,257 - 261 (1985) Phytochemistry 27., 225 (1971) a. i., Agric. Food Chem. 39., 266 (199 l). Ukázalo sa, že zmes 2,6-dimetoxy-p-benzochinónu a kyseliny askorbovej inhibuje rast buniek Ehrlichovho ascitickěho nádoru pri myšiach(Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81., 2088 - 2091 (1985 2,6-Dimetoxy-p-benzochinón a 2-metoxy-p-benzochinón sa našli a izolovali sa pri niekoľkých rastlinách Magy. Kém. Folyórat 102/7., 320-325 (1996). Tieto dve zlúčeniny možno nájsť V najväčšom množstve vo forme glykozidu v pšenici (Tricitum vulgaris), presnejšie povedané v pšeničných klíčkoch. Zlúčeniny boli v päťdesiatych rokoch izolovanć z pšeničných klíčkov, fermentované kvasinkami a chemicky určené na účely skúmania zhoršovania kvality chleba, do ktorého sa pšeničné klíčky pridávali. Helv. Him. Acta 33., 433 (l 950 J. Chem. Soc. London 1952,4821 - 4823.Podľa literámych údajov je v pšeničných klíčkoch 0,05 hmotnostných 2-MBQ, 2,6-DMBQ a ďalej 0,01 hmotnostných (vo forme glykozidu). Prítomnosť chinónov vo forme glykozidov sa vysvetľuje skutočnosťou, že chinóny,najmä p-benzochinóny substituované metoxy- skupinou sú reaktívne, zatiaľ čo ich hydrochinón-glykozidy sú stabilnejšie a inertné.Počas našich pokusov týkajúcich sa štúdia fermentácie pšeničných klíčkov sme dospelí k záveru, že suchý výťažok získaný z fermentovanej tekutiny vzniknutej fermentâciou pšeníčných klíčkov pekárskymí kvasnicami (Saccharomyces cerevisiae) má prekvapujúci imunostimulačný účinok a takisto potláča vznik metastázy a môže sa úspešne aplikovat ako aktívna súčasť imunostimulačných farmaceutic kých prostriedkov a farmaceutický/ch prostriedkov potláčajúcích vznik metastázy.Tento nálezje prekvapujúci, pretože aj keď je v literatúre zmienka Proc. Natl. Acad. Sci USA 80., 129 (l 983),že zmes 2,6-DMBQ s kyselinou askorbovou inhibuje rast buniek Ehrlichovho ascitickćho nádoru - sú výnimočne vhodné na kvantitativnu analýzu rastu nádoru a na štúdium ich biochemických funkcií - výťažok opísaný v tomto vynáleze, ktorý obsahuje okrem neidentiñkovateľných zložiek 2,6-DMBQ a 2-MBQ - sa ukázal byť prakticky neúčinný na tieto primárne nádorove bunky, dokonca aj v kombinácií s kyselinou askorbovou - všeobecne na všetky primárne nádory, sa ukázal byť veľmi účinný len pri liečení metastáz. Okolnosti liečby primárnych nádorov a metastáz, ktoré sa z nich vyvíjajú, sú zásadne odlišné, takže nebolo pre výskumných pracovnikov samozrejme, že rastlinný výťažok obsahujúci zložky, o ktorých je známe, že sú účinne pri liečení primámych nádorov a ešte nie sú úplne identifikovanć čo sa týka ich chemického zloženia, by mohol mať imunostimulačný účinok a potláčajúci účinok na metastázu Cancer, Principles and Practice of Oncology, sv. l. 4. vydanie, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, 1993.Predkladaný vynález sa teda týka fermentovanćho a vysušeného rastlinného materiálu s imunostímulačným účinkom a schopnosťou potláčať metastázu, ktorý je možno získať fermentáciou pšeníčných klíčkov pekárenskými kvasnicami vo vodnom prostredí, filtráciou fermentovaneho roztoku, aby sa zbavil buniek ajeho vysušením.Predkladaný vynález má tiež vzťah k takým farmaceutickým prostriedkov s imunostimulačným účinkom a schopnosťou potláčať metastázu, ktorých aktívna zložka obsahuje fermentovaný, vysušený rastlinný materiál, opísaný v predkladanom vynáleze.Predkladaný vynález sa tiež týka použitia spomínaného fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu na výrobu farmaceutických prostriedkov s imunostimulačným účinkom a schopnosťou potláčať metastázu.Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobu liečenia cícavcov stimulovaním imunitného systému a potláčania metastáz pomocou farmaceutických prostriedkov opísaných v predkladanom vynáleze.Vymález sa ďalej týka diétneho dophiku, ktorý obsahuje v predkladanom vynáleze opísaný, fermentovaný a vysušený rastlinný materiál a maltodextrín.Podľa vynálezu bol fermentovaný a vysušený rastlinný materiál určený a skúšaný na základe jeho obsahu 2,6-DMBQ, Radi by sme poznamenali, že úplne určenie chemického zloženia výťažku nebolo pomocou dostupných metód možné, teda všetky údaje sa vzťahujú na obsah 2,6-DMBQ ako k základu.Ukázalo sa vhodné použiť na výrobu fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu, opísaného v predkladanom vynáleze, pšeničné klíčky - ktore sú vedľajším produktom pri mletí múky a dostupné vo veľkom množstve - rozomlete na múku, buď V ich pôvodnom stave, alebo zbavené tuku. Použitie pšeničných klíčkov zbavených tuku nemá žiadne zvláštne výhody. Fermentácia sa uskutočnila pomocou pekárskych kvasnic (Saccharomyvces cerevisiae). Tento typ kvasiniek je komerčne dostupný. Cas fermentácie bol 10 až 24 hodín, výhodne 15 až 20 hodin alebo 18 hodin. Teplota fermentácie je 25 až 35 °C, výhodne 30 °C. Hmotnostný pomer pšeničných klíčkov a kvasiniek je 4 l až 2 l, výhodne 3 l, hmotnostný pomer sušiny a vody je l 6 až 1 12, výhodne l 19.Fermentácia - v laboratómom meradle - sa môže napríklad vykonať tak, že sa do skleného fermentoru pridá k čerstvo rozomletým pšeničným klíčkom suspenzia kvasiniekvo vode a miešaním alebo trepaním sa zmiesi. Fermentovaná tekutina pení.Po skončení fennentácie sa zmes centrifuguje počas IS minút pri 2000 až 4500 otáčkach za minútu. Supematant sa povarí, ochladí a vysuší vhodným spôsobom, napriklad yofilizáciou alebo sušením rozprašovanej tekutiny.Produkt, červenohnedý prášok, je materiál pripravený podľa tohto vynálezu. Je vhodné udržovať materiál pre ďalšie použitie v chlade a v utesnených nádobách, pretože má hygroskopický charakter. Obsah 2,6-DMBQ V konečnom materiále je 0,4 mg/g.V pripade fermentácie vo veľkom meradle (napr. 4 m 3) je vhodné použiť stále zavzdušňovanie, napríklad 0,5 l vzduchu na 1 l fermentovanej tekutiny za minútu a stále miešanie. Čas fermentácie je 18 hodín. Aby sa zabránilo tvorbe peny, môžu sa použiť bežné prísady - je výhodne použiť slnečnicový olej. Na konci fermentačného procesu sa zavzdušňovanie a miešanie preruší a fermentovaná tekutina sa od suspenzie pšeničné klíčky - kvasinky oddelí bežným spôsobom, napríklad v slimákovom odsteďovacom zariadení, potom v odlučovači a pretláčaním filtračným zariadením. Pokiaľ je to nevyhnutné, môže sa pridať pomocný filtračný materiál. Je vhodné použiť 5 až 10 kg ñltračného perlitu na m 3 fermentovanej tekutiny. F ermentovaná tekutina sa prudko filtruje a kvalita filtrovanía sa kontroluje mikroskopicky. Filtrovaná fermentovaná tekutina prakticky neobsahuje bunky, čo znamená, že pri 10 pozorovaniach sa nenájde viac než jedna kvasinková bunka. Výsledná fermentovaná tekutina, ktorá obsahuje 1,5 hmotnostného percenta sušiny, sa odpamjte na vákuovom kondenzátore, výhodne pri teplote 40 až 50 °C a po ukončení vákua sa povarí pri atmosférickom tlaku počas 15 minút. To má za následok zníženie škodlivých enzymatických aktivít. Ďalej sa zmes suši vysušovaním rozprášenej tekutiny, napríklad v rotačnom rozprašovacom prístroji. Pokiaľ sa použije opísaný fermentačný proces, potom obsah 2,6-DMBQ vo výslednom fermentovanom a vysušenom rastlinnom materiáli je 0, 12 až 0, 52 mg/g sušiny a obsah 2-MBQ je 0, 05 až 0,28 mg/g sušiny - v závislosti od obsahu benzochinónu v použitých pšeničných klíčkoch.Pretože výsledný produkt je hygroskopický, na účely zvýšenia efektivity vysušovania rozprašovanim a efektivity použitia výsledného produktu, môže sa počas vysušovania rozprašovaním použiť jedna z bežných prísad, napríklad maltodextrín, arabská guma, guarová guma (Cyamopsis sp.), xantan, múka z Ceratonia siliqua (locust bean) atd. Prednostne sa používa maltodextrín. Vhodným postupom je určiť obsah sušiny v zmesi odparenej vo vákuovom kondenzátore a povarenej, a potom pridať toľko maltodextrínu,že obsah sušiny v zmesi, ktorá sa vysuší, bude 30 hmotnostných percent. Je vhodné rozpustiť maltodextrín v horúcej vode a ochladený ho potom pridať ku kondenzovanej zmesi. Po vysušení konečný produkt - prášok - obsahuje 60 hmotnostných fermentovanćho, vysušeného rastlinného materiálu a 40 hmotnostných maltodextrínu.Stabilita ziskaného materiálu sa môže kontrolovať sledovaním zmien koncentrácie 2,6-DMBQ. Kvantitatívna analýza sa môže uskutočniť pomocou HPLC. Prášok vyrábaný pomocou opísaného postupu ostáva stabilný počas 3 rokov pre izbovej teplote.Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál, pripravený podľa íohto vynálezu sa môže použiť ako aktívna zložka v imunostimulačných farmaceutických prostriedkoch a vo farmaceutických produktoch potláčajúcich vznik metastázy. Farmaceutický prostriedok môže tiež obsahovať okrem uvedenej aktívnej zložky kyselinu askorbovú alebo iné cytostatické látky.Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál sa môže spracovať do bežných pevných alebo tekutých farmaceutických prostriedkov na perorálne alebo parenterálne podávanie. Pri tejto výrobe farmaceutických prostriedkov sa musí brať do úvahy hygroskopický charakter fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu. Vhodnou fonnou sú kapsuly, ktoré chránia aktívnu zložku pred vzdušnou vlhkosťou.Pri výrobe farmaceutických prostriedkov sa môžu použiť pomocné látky, bežne používané vo farmaceutickej praxi. Pretože tieto látky a ich možné použitie sú detailne opísané vo farmaceutickej literatúre, výber a priprava vhodnej formy je bežnou praxou. Jedna dávka účinnej zložky sa môže meniť V širokom rozmedzí v závislosti od stavu pacienta a za výber vhodnej účinnej dávky musí byť zodpovedný lekár. Bežne sa môžu získať vhodne výsledky, ak je dávka 0,001 až 100 g, výhodne 0,01 až 50 g, ešte výhodnejšie 0,1 až 40 g na kg telesnej hmotnosti, napríklad pri dávkach 0,1 až 10, l až 25 alebo 10 až 30 g.Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál pripravený podľa tohto vynálezu sa tiež môže miešať s kyselinou askorbovou (vitamín C). Podľa našich pokusov môže kyselina askorbová pri materiáli pripravenom podľa tohto vynálezu zvýšiť inhibičný účinok na metastázu. Pomer hmotnosti fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu a kyseliny askorbovej môže byť napríklad 10 l až 1 1, výhodneó l až 2 1, ešte výhodnejšie 3 1,4 l alebo 51.Vynález sa tiež týka imunostimulačného liečenia alebo liečenia pri potláčaní metastázy fermetnovaným a vysušeným rastlinným materiálom, pripraveným podľa tohto vynálezu. Cieľom liečenia je dať pacientovi účinnú dávku fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu.Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál sa môže tiež použiť ako diétny doplnok pre cicavcov. V tomto prípade je výhodne podávať zmes obsahujúcu maltodextrín a bežné pomocné látky používané v potravinárskom priemysle, napríklad aromatické látky, sladidlá, farbiace činidlá atd. Diétny doplnok sa môže napríklad vyrábať granulovaním zmesi obsahujúcej 60 hmotnostných percent suchého materiálu a 40 hmotnostných percent maltodextrinu spolu s aromatickými látkami a sladidlami v tuhom mklade a balením instantného granulátu napríklad do vriec.Prehľad obrázkov na výkresochObrázok l. Kalihračná krivka na stanovenie 2,6-DMBQ pomocou HPLC.Obrázok 2. HPLC chromatogram chlorofonnového extraktu z materiálu.Obrázok 3. HPLC chromatogram etanolového extraktu z materiálu, Obrázok 4. Väzba nádorových buniek B 16 v prítomnosti lyoíílizovaného materiálu pri rôznych koncentráciách v 60. a 90. minúte po pridaní. (Každá hodnota predstavuje priemer ôsmych paralelných meraní d štandardná odchýlka,podľa spektrofotometrickćho merania).Obrázok 5. Účinok rôznych dávok lyofilizovaného materiálu na bujnenie buniek Bl 6 za 24 a za 48 hodin od začiatku pôsobenia. (Každá hodnota predstavuje priemer ôsmych paralelných meraní t štandardná odchýlka, podľa spektrofotometrickćho merania).Obrázok 6. Vývoj ľudského melanúmu A 2058 v prítomnosti rôznych dávok lyoñlizovaného materiálu 24 hodín od začiatku pôsobenia. Vyhodnotenie kultúr sa uskutočnilo na základe proteínu (SRB) a dehydrogenázovej aktivitypredstavuje priemer ôsmych paralelných meraní t štandardná odchýlka).Obrázok 7. Podiel apoptotických buniek (FACS analýza) v in vitro kultúrach ľudského melanómu A 2058 po pôsobení rôznymi dávkami lyofilizovaného materiálu.Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu fermentovaného a vysušeného rastlinného materiálu pripraveného podľa tohto vynálezu, jeho prípravy a farmakologických účinkov.Príklad l Fermentácia pšeničných klíčkov v laboratómom meradle Suspenzia 33,3 g kvasiniek (Saccharomyces cerevisiae) a 1000 ml pitnej vody sa pridalo k 100 g čerstvých pšeničných kllčkov (podľa maďarského štandardu MSZ-08136 l-80) rozomletých na múčku. Zmes sa trepala v trepačke počas 18 hodín pri 30 °C. Počas tohto času prechádzala fermentovaná tekutina do penového stavu a dosiahla trojnásobok svojho pôvodného objemu. Po fermentácii sa zmes centrifugovala 15 minút i 3000 otáčkach/minútu. Po povarení a ochladeni sa supematant vysušil lyofilizaciou a výsledná lyofilizovaná látka sa na ďalšie použitie uložila do mrazničky (-l 0 °C). Obsah 2,6-DMBW vo výslednom lyoñlizáte bol 0,4 mg/g sušiny (0,04 hmotnostného percenta).Príklad 2 Fermentácia pšeničných kllčkov vo veľkom meradle300 kg pšeničných kličkov rozomletých na múku (podľa maďarského štandardu) a 100 kg kvasiniek sa umiestnilo do fermentora s objemom 5 m 3 a pridala sa pitná voda, kým objem dosiahol 4000 litrov. Čas fermentácie bol 18 hodín,počas nej sa používalo stale zavzdušňovanie (0,5 1 vzduchu/1 fermentovanej tekutiny/minútu) a pomalé miešanie(30 otáčok/minútu). Aby sa zabránilo tvorbe peny, pridal sa ku zmesi slnečnicový olej - l l/m 3. Po fermentácii sa zavzdušňovanie a miešanie prerušilo a fermentovaný roztok sa oddelil najprv na slimákovom odstreďovacom zariadeni,potom v odlučovači a nakoniec pretláčaním filtračným zariadením s textilným filtrom. Ako pomocný materiál sa pridalo 10 kg filtračného perlitu/m 3. Fermentovaná tekutina sa prudko odñltrovala a kvalita filtrovania sa kontrolovala mikroskopicky. Filtrovaná fermentovaná tekutina prakticky neobsahovala žiadne bunky, čo znamená, že pri 10 pozorovaníach sa nenašlo spolu viac ako jedna kvasinková bunka. Výsledná fermentovaná tekutina, ktorá obsahovala 1,5 hmotnostného percenta sušiny sa odparovala vo vákuovom kondenzáte pri teplote 40 až 50 °C a po ukončení vákua sa povarila pri atmosférickom tlaku počas 15 minút. Potom sa stanovil obsah sušiny v roztoku a pridalo sa toľko maltodextrinu - najprv sa rozpustil v horúcej vode a potom sa schladil - že obsah sušiny v roztoku bol 30 jej hmotnosti. Potom sa roztok sušil vysušovanlm rozprašovanej tekutiny v rotačnom sušiacom prístroji s dýzou, v ktorom bola teplota vychádzajúceho vzduchu 90 °C. Výsledný konečný produkt - prášok - obsahoval 6 hmotnostných fermentuvaného, vysušeného rastlinného materiálu, pripraveného podľa predloženého vynâlezu a 40 hmotnostných maltodextrinu. Obsah 2,6-DMBQ - stanovené HPLC metódou,opísanou v nasledujúcom príklade - bol 0,4 mg/g sušiny.Príklad 3 Charakteristiky látky pripravenej podľa predloženého vynálezuLátka pripravená podľa predloženého vynálezu sa môže charakterizovať dvoma spôsobmi, bud určením obsahu 2,6-DMBQ alebo tzv. odtlačkom palca na chromatograme. V obidvoch prípadoch sa použije HPLC Chromatografia.Analýza sa uskutočnila aj pri látke vytvorenej ako sa opísalo v príklade l, aj pri látke ziskanej ako sa oplsalo v príklade 2, a výsledky boli v obidvoch prípadoch zhodné.A. Kvantitatívna a kvalitatívna analýza benzochinónových derivátov Príprava vzorkyPred analýzou bolo nevyhnutné zvýšiť koncentráciu benzochinónov v lyoñlizáte. Aby sa toto dosiahlo, rozpustil sa lyoñlizát na pôvodnú koncentráciu v destilovanej vode(na obsah 1 hmotnostného sušiny) - (0,5 g lyofilizátu, 50 ml destilovanej vody). Roztok sa extrahoval v troch krokoch vždy s 25 ml chloroformu, Zvyšková vlhkosť v chloroformovej fáze sa nakoniec odstráníla bezvodým síranom sodným. Po filtrácii sa chloroformová fáza odparila a ku zvyšku sa pridal chloroform do celkového objemu 5 ml. Táto vzorka sa injektovala na HPLC analýzu.Kvantitatívna a kvalitatívna analýza benzochinónových derivátov sa uskutočnila metódou HPLC.Použité HPLC zariadenie sa skladá z pumpy Beckman model 114 M, LaborMim W, príp- Merck-Hitachi-DAD mod. 4500 diodearray-detektora a integračnej jednotky Waters typ 740. Na merania sa použila kolóna 10 m Chromsil C 18 (250 x 4 mm). Detekcia sa uskutočňovala pri vlnovej dĺžke 290 nm a rýchlosť prietoku mobilnej fázy bola 2 ml/minútu.Zloženie použitého elučného roztoku bolo nasledujúceNa 2 HPO 4 25 mmol, Nal-IZPO 25 mmol, NaZEDTA 25 mmol, NHZOHHC 20 mmol, 10 objemových metanolu, pH 6,05. Opísanou metódou sa analyzovali tri rôzne benzochinóny a hydrochinóny. .le však malý rozdiel medzi elučnými časmi týchto zlúčenín. Znižením koncentrácie elučného roztoku organickej fázy na 10 - sa zvýšil rozsah selektivity. Analýza retenčných údajov ukázala, že p-benzochinóny majú vyššiu retenciu než zodpovedajúce hydrochinóny a retencia sa s počtom metoxy- skupín zvyšuje. Koncentrácia všetkých troch štandardov bola 0,1 mg/ml. Tabuľka 5 ukazuje údaje o retenčných časoch (tu) štandardov a kapacitnom faktore (k). Pretože účelom meraní bola detekcia a kvantitativne stanovenie Ló-dimetoxy-p-benzochinónu, bude ďalej táto časť meraní detailne diskutované. Testovalo sa,či je vypracovaná metóda vhodná na kvantitativnu analýzu 2,6-dimetoxy-p-benzochinónu. Použitá kalibračná krivka je zobrazená na obráúcu 1. Výsledkom je priamka s korelačným koeficientom 0,99. Kontrolovalo sa tiež, či sú merania reprodukovateľné, pri každej vzorke sa uskutočnili tri paralelné merania a vypočíta sa rozptyl výsledkov. Tabuľka l ukazuje výsledky paralelných meraní uskutočnených na vzorkách v priebehu obdobia šiestich mesiacov a ich rozptyl. Naše výsledky ukazujú, že meracia metóda je vhodná na presné a reprodukovateľné merania 2,6-dimetoxy-p-benzochinónu.Tabuľka l Paralelne hodnoty kvantitatívnej analýzy 2,6-DMBQ a rozptyl výsledkovObrázok 2 ukazuje l-IPLC chromatogram chloroforrnovej vzorky pripravenej tak, ako bolo opísané. Chromatogram ukazuje len jeden pík, charakteristický pre 2,6 DMBQ. Obsah 2,6-DMBQ vo vzorke sa určil na základe nasledovnćho.B. Odtlačok palca na chromatografe Príprava vzorky50 ml 96 etanolu sa pridalo k 5 g vysušenej látky(pripravenej ako je opísané V príklade 2). Zmes sa trepala počas 30 minút pri teplote 50 °C a 200 otáčok/min. Potom sa zmes ŕiltrovala, vysušila do sucha a zvyšný materiál sa rozpustil v 10 ml metanolu. Filtrovaný roztok sa injektoval na kolónu.Vybavenie HPLC, kolóna a opísane podmienky sa použili tiež tu, ale zloženie elučného roztoku bolo nasledujúce NazHPoi 1,25 mmol, NaH 2 PO 4 1,25 mmol, NazEDTA 1,25 mmol, NHIOHHC 2,50 mmol, 5 objemových metanolu.Obrázok 3 ukazuje výsledný HPLC chromatogram. Je zrejmé, že za týchto podmienok sa objavili dva charakteristické píky, jeden V 4,7 minúte (5) ajeden v 5,8 minúte(6). Pri retenčnom čase 7,3 a 7,7 minúty nasledovali rýchlo následne za sebou dva píky, ktoré nie je možné úplne oddeliť. Pík s menšou intenzitou sa objavil v 9,8 minúte (9),nasledovaný Charakteristickým píkom (ll) v 13,1 minúte. V 15 minútach nasledoval menší pík (12) a ďalší intenzívny pík (15) a okolo času 31 minút plochejší pík obsahujúci niekoľko látok.Rozklad látky prípravenej podľa tohto vynálezu sa zisťoval pomocou zmien koncentrácie Lú-dimetoxy-p-benzochinónu. Uskutočnili sme pokusy s uložením pri troch rôznych teplotách (teplota miestnosti 20 °C, 40 °C a 60 °C). Lyofilizát - l g - sa uložil v skúmavkách, ktoré boli vzduchotesne uzavreté. Pokus trval 8 mesiacov a každýtýždeň sa uskutočnili tri paralelne merania na vzorkách odoberaných zo všetkých troch sérií uložených pri rôznych teplotách. Kvantitatívna analýza benzochinónových derivátov sa uskutočnila pomocou HPLC.Testy ukázali, že suchá látka pripravená podľa tohto vynálezu zostala stabilná dokonca po troch rokoch pri teplote miestnosti, t. j. obsah 2,6-DMBQ zostal prakticky nezmenený. Súčasne látka nie je stabilná pri 40 °C - 2,6-DMBQ sa rozkladá počas niekoľkých týždňov a pri 60 °C sa obsah 2,6-DMBQ zníži rýchlo počas niekoľkých dní.V obidvoch sćriách meraní sa tiež študoval rozklad 2-metoxy-p-benzochinónu. Táto zlúčenina je ešte menej stabilná než 2,6-dimetoxy-p-benzochinón a následkom tohojeho prítomnosť nie je možné preukázať už po jednomtýždni pri vzorkách uložených pri teplote 40 °C alebo 60 °C. Pri teplote miestnosti zostáva koncentrácia tejto zlúčeniny tiež nezmenená.Aj pri lyoñlizovanom preparáte pripravenom ako je opísanć v príklade 1, aj pri látke vysušenej pri rozprašovaní ako je opísané v príklade 2, sa testovala ich účinnosť, Použila sa štandardizovaná sušina s obsahom 2,6-DMBQ 0,4 mg/g sušiny a jej HPLC krivka bola taká, ako zobrazuje obrázok 2. S obidvoma látkami sa získali rovnake výsledky teda látka pripravená podľa tohto vynálezu sa bude naďalej nazývať jednoducho lyotilizát. Ďalej budú diskutované výsledky biologických a toxikologických testov, ktoré sa týkąiú tohto lyoíilizátu, so zvláštnym dôrazom na opätovne nastavenie imunity, nádorový rast a na potlačenie vzniku metastáz.l. Nádorový rast a účinok na potlačenie metastáz (testy in vivo)Pri testoch sa použili nasledujúce ínjektovane typy nádorov rastúce na myšiach a krysách silno metastázujúci variant (3 LL-HH) Lewisovho pľúcneho karcinómu (myšia rakovina pľúc), myší melanóm Bló a xenoimplantát ľudského karcinómu hrubého čreva HCR-25.Nádory 3 LL-HH (LLT-HH) a Bló sa udržiavali na inbredných myšiach C 57 Bl/6. Xenoimplantát HCR-ZS sa injektoval myšiam CBA/CA, pri ktorých sa vopred potlačila imunita pomocou operatívneho odstránenia týmusu a ožiarením celého tela. V prípade nádorov 3 LL-HH a HCR 25 sa bunky transplantovali do sleziny, v prípade melanómu Bl 6 do svalov ľavej zadnej končatiny. Zvieratám v liečenej a kontrolnej skupine, ktorým sa injektoval nádor HCR-25 sa tiež odstránila slezina 21 dní po transplantácii nádoru.Liečenie lyofilizátom, opísané vo vynáleze, sa začalo 24 hodín po injektovaní nádoru. Denné davky 3 g/kg telesnej váhy sa podávali ústami žalúdočnou sondou vo fomie vodnej suspenzíe 0,6 g/ml.Testy v prípade nádoru 3 LL-HH sa ukončili 14 dní po transplantácii, v prípade Bl 6 2 l dni po transplantácii a v prípade nádoru HCR-25 51 dní po transplantácii úplným vykrvácaním zvierat v narkóze.Liečenie Počet injektovanych buniek Počet metastaz v pečeníkaždá testovaná skupina obsahovala 10 zvierat

MPK / Značky

MPK: A23L 1/172, A23L 1/30, A61K 35/78

Značky: doplnok, rastlinného, fermentovaný, materiálů, vysušeného, použitie, vysušený, diétny, přípravy, spôsob, materiál, rastlinný, výrobok, farmaceutický

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-282917-fermentovany-a-vysuseny-rastlinny-material-sposob-jeho-pripravy-farmaceuticky-vyrobok-dietny-doplnok-a-pouzitie-vysuseneho-rastlinneho-materialu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Fermentovaný a vysušený rastlinný materiál, spôsob jeho prípravy, farmaceutický výrobok, diétny doplnok a použitie vysušeného rastlinného materiálu</a>

Podobne patenty