Rekombinované plazmidy a kmene Escherichia coli obsahujúce tieto plazmidy

Číslo patentu: 278106

Dátum: 14.10.1992

Autori: Vojtíšek Vladimír, Plháčková Kamila, Branny Pavel

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Rekombinované plazmidy kódujú syntézu hydrolázy 7beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánovej kyseliny. Ich deriváty vzniknú deléciou nekódujúcich oblastí, sú odvodené od základného plazmidu pK19 a sú označené pKS118, pKS946 a pKS55. Kmeň mikroorganizmu Escherichia coli CCM 4229 obsahuje niektorý z uvedených rekombinovaných plazmidov a môže byť využitý ako zdroj enzýmu na prípravu 7-amino-cefalosporánovej kyseliny (7-ACK) z 7beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánovej kyseliny (glutaryl-7-ACK).

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka rekombinovaných plaanidov pKS 1 18, pKS 946, pKSSS a ich derivátov nesůcich gén pre hydrolázu B-(ct-karboxybutanamidoxefalosporánovej kyseliny a kmeňov mikroorganizmu Escherichía wli CCM 4229 (pKSl 18), CCM 4229 (pKS 946), CCM 4229 (pKSSS) obsahujúcich tieto plazmidy.Je známe, z niektoré kmene mikroorganizmov, obzvlášť z rodu Pseudomonas, napr. kmene Pseudomonas sp., CCM 3635 a CCM 3987 získané podľa čs. autorských osvedčení č. 239 293 a č. 260 068 a ďalej z rodu Comanonas (japonské patentove spisy č. 75101584 a č. 7670884) a rodov Bacillus, Arthrobacter a Alcaliqenes Uaponské patentové spisy č. 77128293 a č. 7886094). produkujú enzým hydrolyaujúci amidovú väzbu 70-(4-karboxybutanamidokefalosporánovej kyseliny (ďalej len glutaryl-7-ACK) na 7-aminocefalosporánovú kyselinu (ďalej len 7-ACK).V patentovej a odbomej literatúre (japonský patentový spis č. 85110202 Matsuda a Komatsu, J. Bacteriol. 163. 1222-1228, 1985) je opisané molekuláme klenovanie štmkturálneho génu pre hydrolázu 7 B-(4-karboxybutanamidokefalosporánovej kyseliny ( ďalej len hydroláza glutaryl-7-ACK) prostrednictvom plazmidov pBR 322 a pBR 325 a ich derivátov z inducibilných alebo konštitutlvnych kmeňov Comamonas resp. Pseudomonas do vhodných recipientných kmeňov Escherichia coli O 600. Špecilická enzýmová aktivita spomenutého kmeňa E. coli nesůceho rekombinovaný plazmid bola 1,6 až 2 krát vyššia V porovnani s pôvodným rodičovským konštitutivnym kmeňom Pseudomonas.Podstatou vynálezu sú rekombinované plazrnidy pKSl 18, pKS 946, pKSSS a ich deriváty, ktoré vznikli delćciou nekódujúcich oblasti, kódujúce syntézu hydrolázy 7 B-(4-karboxybutanamido)cefalosporánovej kyselíny charakterizovanej vloženým fragmentom DNA kmeňa Pseudomonas sp. s veľkosťou 4,0 kb v prípade pKS 1 18,5,5 kb v pripade pKS 946 a 2,5 kb pre pKSSS a reštrikčnou mapou znázomenou na obr. l, obr.2 a obr.3.Ďalej sú podstatou vynálem kmene Escherichia coli obsahujúce tieto plazmidy a uložené v Zbierke mikroorganizmov Mikrobiologíckého ústavu ČSAV v Prahe pod označením CCM 4229 (pKSI 18), CCM 4229 (pKS 946) a CCM 4229 (pKSSS).Rekombínované plazmídy pKSl 18 a pKS 946 boli pripravené s cieľom získať kmene s vysokou produkciou spomínaného priemyselne významného enzýmu spôsobom molekulárneho klonovania tohto štrukturálneho génu do vhodných vektorov, hlavne do plazmídu pKl 9. Po transfomiácii do vhodných recipientných kmeňov Escherichia coli boli v zaiačnom počte kópií transkribované, z čoho renrltovala niekoľkonásobne vyššia špecifická aktivita hydrolázy glutaryl-7-ACK.Ako východiskový biologický materiál na izoláciuDNI( bol použitý konštitutivny loneň Pseudomonas sp. CCM 3987 nesúci šmikturálny gén pre hydrolázu glutaryl-I-ACK (čs. autorské osvedčenie 260 068), ako východiskový Vektor na pripravu rekombinovaných plamiidov bol použitý malý multikópiový plazmid pKl 9 nesírci gén zodpovedný za kanamyclnovú rezistenciu (KmR gén) a funkčná časť Iac-operónu (Pridmore, KG., Gene 56, 309-312, 1987). Princíp selekcie transformovaných buniek E. coli týmto plazmidom spočíva v schopnosti rastu kolónii na pevných Zivných pôdach, obsahujúcich antibiotikum kanamyctn, XGaL(S-bromoA-chloro-in-dolyl-B-D-galaktopyrnnozid) a IPTG (impropyl-B-D-tiogalaktopyranozid- zdarma induktor pre B-galaktoúdáztr), pričom kolónie buniek nesúcich rekombinovaný plaznid sú biele (XGaL nie je hydrolyzovaný, pretože DNK z rodičovského kmeňa Pseudomonas je inzertovaná v oblasti funkčného miesta lac-operónu) a kolónie buniek nesúcich nerekornbinovaný plazrnid pKl 9 sú modré.Recipientnć kmene Escherichia coli použité na transfomáciu rekombinovanými plazmidmi bolí nasledovné Escherichia coli XL l-Blue a Escherichia Coli JM 83. Kmeň E. coli XL 1-Blue obsahuje kryptický plazmid kódujúci okrem iného lac-represor, rezistenciu na tetracyklín (TJ), kmeň je dependentný na tiamín(thi). Kmeň Escherichia coli JM 83 je auxotmfný kmeň a jeho základné vlastnosti sú uvedené v YanischPerron et al., (Gene 33, 103-109, 1985).Na prípravu genovej banky (ímlácia DNL z rodičovského kmeňa), na pripravu rekombinovaných plazmidov a ich derivátov odvodených od základného plannídu pKl 9 a transformáciou zvolených recipientných kmeňov E. coli týmito plazmidmi, vrátane molekulárnej hybridizácie, boli použité metódy opísané v aboratómom manuáli Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J.,Cold Spring Harbor Labs. Press, 1982.Kmene Escherichia coli nesúce rekombinované plazmidy pKS 118, pKS 946, pKSSS a ich deriváty ziskané po transformácii boli kvantitatívne hodnotené z hľadiska produkcie a špecifickej aktivity hydrolázy glutaryl-7-ACK, Množstvo hydrolázy glutaryl-7-ACK v bunkách bolo určované meraním počiatočnej rýchlosti hydrolázy g 1 utaryl-7-ACK v 0,1 M fosfátovorn pufri s pH 7,0 a teplotou 37 °C v oblasti enzýmovej kinetiky nultého rádu. Produkt reakcie -7-ACK- bol stanovený spektrofotometricky s použitím p-dirnetylaminobenzaldehydu(Balasingham a sp., Biochim. Biophys. Acta 276, 250260, 1972). Jedna jednotka (U) enzýrmovej aktivity je množstvo enzýrnu, ktore zodpovedá tvorbe jedného mikromólu 7-ACK za minútu. špecifická aktivita je defmovaná ako U.g suchej hmoty buniek.Predmetné kmene Escherichía coli sú použiteľné na enzýmovú hydrolýar g 1 utary 1-7-ACI( na 7-ACK. Výhodne je možné tieto kmene vyuät ako východiskový zdroj na výrobu imobilizovaných buniek, alebo je možné ich využiť na izoláciu surového enzýmu a jeho následnú imobilizáciu.V nasledujúcom prehľade sú zhmute základné vlastnosti predmetných kmeňov Escherichia coli tmnsfonnovaných spomenutýrni plazmidmi a ich derivátmi v porovnani s rodičovským kmeňom.Kleñ Špecifické ak» iviřa U.§I Pseudouonas sp. CCM 3987 10 Eschertchla coil JH aa nesura rekonblnované plsznldy nkslla 70 pKS 946 65 pKS 55 Ideriváł Ddvodeny od pxsllôl 180Uvedené kmene kultivovanć v LB pôde (Luria Broth- Maniatís et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Labs. Press, 1982).Výhodnosť využitia predmetného kmeňa Eschericltia coli CCM 4229, ktorý nesie najlepší derivát rekombíno Kmeňvaného plazmidu a ktorý vyrástol pn optimálnych podmienkach submemiej kultivácie v porovnaní s rodičovským kmeňom, je zrejmé z nasledujúceho prehľadu.CC 3987 4229 špecifická aktivitu ďU.q 1 | in - 70 180 - 220 Doba kuleiváie th 35 - 40 20 - 25Šperifírká aktivita nezla dúclch esteráz rU.qi() Aktivita esteráz hodnotené spektrofotometricky s použitím p-nitrofenylacetàtu ako substrátu.Prehľad obrázkov na výkresochNa pripojených obrázkoch je na obr.l znázomený rekombinovaný plazmid pKS 118 nesůci gén pre hydrolázu 7 B-(4-karboxybutanarnidokefalosporánovej kyseliny. Veľkosť plannidu je 6,66 kb. Klonovaný fragment DNI( (4,0 kb) je vyznačený dvojitou čiarou. Obr.2 predstavuje rekombinovaný plazmid pKS 946 nesúci gén pre hydmlúzu 7 B-(4-karboxybutanamído)cefalosporánovej kyseliny. Veľkosť plannidu je 8,16 kb. Klonovaný fragznent DNI( (5,5 kb) je vyznačený dvojitou čiarou. Na obr.3 je mázomeríý rekombínovaný plazmid pKS 55 nesúci gén pre hydrolázu 7 B-(4-karboxybutanamido)cefalosporánovej kyseliny. Veľkost plazmidu je 4,5 kb. Klonovaný ůagment DNI( (2,5 kb) je vyznačený dvojítou čiarou.Ďalej je vynález doplnený nasledujúcimi príkladmi uskutočnenia bez toho, aby sa nimi obmedmvul.Zmrazenć bunky Pseudomonas sp. boli suspendované v 5 ml roztoku 50 mM TrisHCl, 50 mM EDTA, pH 8,0. K suspenzii bolo pridané 0,5 ml roztoku lyzozýmu(20 mg/ml) a zmes inkubovaná 15 min. pri 37 °C. K protoplastom bol pridaný l ml 10 dodecylsulfonátu sodného (SDS) a 100 l proteinàzy K (10 mg/ml) azmes inkubovaná l hodinu pri 50 °C. Po inkubácii bol lyzát extmhovaný zmesou fenol-chloroformu (l l) toľkokrát, až po rozdelení fázy nebola zjavné interfáza. Vodná fáza potom bola ínkubovaná pri 37 °C s RNázou A (ribonukleázotl, 50 plg/ml). Po pridaní 0,25 objemu 5 M roztoku NaCl bolo DNI( precipitovaná 30 roztokom polyetylénglykolu (PEG 6000) do finálnej koncentrácie 10 . Po premytí zmzeniny 70 etnnolom bol precipitát rozpusteny v 10 mM roztoku TrisHC 1, lmM EDTA, pH 8,0 (TE). Po rozpustení bola chromozómová DNI( opät precipitovaná dvoma objemami absolútneho etanolu za prítomnosti 0,3 M roztoku octanu sodnćho s pH 5,2. Po premytí 70 etanolom a vysušenlm bola DNK rozpustená v TE pufri pri 4 °C.Chromozómové DNK bola parciálne našlíejmná reštrikčnou endonukleázou Sau 3 A, pričom koncentrácia enzýmu bola zvolená tak, aby najvyššie percento tvorila frakcie s veľkosťou 5-7 kb. Chromozómové fragmenty boli ďalej frakcionovanć centrifugáciou v 10 - 40 sacharózovom gradiente (I M NaCl, 20 mM Tris-HCl), (pH 8,0, SmM EDTA), počas 20 hodín pri 40 000 otáčkach/min. Frakcíe obsahujúce lłagmenty 5-7 kb boli spojené, precipitovanć etanolom a rozpustené v TE puľri pri 4 °C.Ako klonovací Vektor bol použitý plaanid pKl 9 linearizovaný reštrikčnou endonukleázou Bam HI a defosforylovaný alkalickou fosfatázou. Ligačná zmes s celkovým objemom 100 l obsahovali l g vektorovej DNK, 3 g chromozómových fragmentov, 25 mol Tris-HCI s pH 7,5, 10 mM MgClz, 10 mM ditiotreitol(DTľ) 0,4 mM ATP a 2 jednotky T 4 DNK lígázy. Reakcia prebiehala 14 hodín pn 14 °C. Po ukončení reakcie bola zmes precipitovaná elanolom, rozpustená v10 TE puíii a použitá na transfomiaciu kompetentných buniek Escherichia coli XL l-Blue pripravených rubidiumchloridovou metódou podľa Maniatis a sp.,Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs. Press, 1982.Suspenzia buniek na transformáciu bola vysiata na pevné živné LB pôdy na Petriho misky obsahujúce 50 ug/ml kanamycínu, 30 gIrn 1 XGaL a 7 jig/ml IPTG a misky inkubované 24 hodín pri 37 °C. Z celkového počtu 791 vyrastených kolónii bolo 59 bezfarebných(teda suspektne nesúcich rekombinovaný plannid) a 200 modrých. Individuálne biele kolónie boli pomocou sterilných drevených špáradiel prenesené na Petriho misky obsahujúce pevnú živnú LB pôdu s kanamycínom a inkubované 2 dni pri 30 °C. Potom boli individuálne klony suspendované pomocou sterilných špáratdiel v jarnkách serologických doštičiek z plastickej hmoty, obsahujúce 50 l roztoku g 1 utaryl-7-ACK (5 mgŕml, 0,1 M putru s pH 7,0). Doštičky boli inkubované pri 37 °C cez noc v individuálnych polyetylénových obaloch brániacich vyschnutiu suspenzie. Potom boli doštičky vybrané a do individuálnych jamôk bolo pridaných 200 l detekčného činidla so zložením 20 kyselina oetová, 0,1 M NaOH, 0,5 p-dimetylaminobenzylaldehydu(pDAB) v metanole, zmiešané v pomere 2 l 0,5. Z uvedeného súbom klonov boli vybrané 2 pozitívne kmene zodpovedajúce suspenzii reakčných zmesí, v prípade ktorých sa detegovalo pozitívne žlté sfarbenie(tvorba Schiíľovej žltej bázy medzi pDAB a vytvorenou 7-ACK).Klony obsahujúce gén pre hydolýzu glutary 1-7 ACK boli označené pKSI 18 a pKS 946. Tieto rekombinované plazmidy boli izolované z buniek E. coli podľa Manilisa a spol., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Labs. Press, 1982).Prítomnosť štrukturálneho génu pre hydrolázu glutarylJ-ACK v rekombinovaných plannidoch bola overená molekuláruou hybridizáciou reštringovanej clu-amoznmovej DNK Pseudomonas sp. s rádioaktívne omaěenými plazmidrni pKSll 8 a pKS 946 ako sondami, pričom sa postupovala metodicky podľa už skôr spomínaného laboratórneho manualu.Získané klony boli očkované kľučkou do tekutej LB pôdy (50 m 1 v 500 ml Erlenmayemvých bunkách) obsahujúcej 50 mglml kanamyclnu a obsahujúcej,resp. neobsahujúcej IPTG (0,5 mM). Banky boli prenesené do recipročného trepacieho stroja a ínkubované 22 hodín pri 30 °C. Výsledky sú úimuté nasledovne.Rekombinovaný plazmid pKSl 18, ktorého spôsob prípravy bol opísaný v príklade 1, bol lineariznvaný reštrikčnými enzýmami Hind Il a Bani HI a jednostranné skrátený exonukleázou 11. Po reparácii koncov bola DNK cirkularizovana ligáciou ako v príklade l a rekombinovaný skrátený plazmid bol transformovaný do recipienmého kmeňa E. coli .IM 83.Suspenzia buniek po transfonnácii bola vysiata na pevné živné LB pôdy na Petriho misky ako je uvedené v príklade l a po rovnakým spôsobom vykonanej inkubácií sa získalo celkovo 84 bezfarebných kolónií a 10 kolónií modrých. Všetkých 84 beäarebných klonov bolo preočkovaných opísaným spôsobom a testovaných na serologických doštjčkách spôsobom uvedeným v príklade l. Z uvedeného súboru klonov bolo celkovo 13 úplne negatívnych klonov, zostávajúcich 71 klonov bolo pozitívnych. Z uvedeného súboru pozitívnych klonov bolo náhodne vybraných 16 klonov, tieto klony sa namnožili v mikrokvantoch v skůmavkách (1,5 m LB tekutej živnej pôdy a kanamycinom) a po inkubáeii cez noc pri 30 °C na recipročnom trepacom stroji bola uskutočnené minipreparácia plazmidu zo všetkých 16 kultúr podľa Maniatisa a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Labs. Press 1982). Podľa citovaných autorov bola taktiež uskutočnené gélová elektroforéza a ústilo sa, že 11 izolovaných plazrnidov zo 16 klonov má velkost okolo 4,5 kb.Zodpovedajúce klony na Petriho miskách (11 klonov zo 16) boli kvantitatívne hodnotené submermou kulti 25vúciou v tekulej LB živnej pôde spôsobom uvedeným v príklade l. Z týchto ll klonov 5 klonov vykazovalo vyššiu špecifickú aktivitu uvedeného enzýmu v porovnaní s kmeňom E. coli JM 83 nesúcim pôvodný (neskrátený) plazmid pKS 1 18. Z týchto 5 klonov bol vybraný jeden klon, ktorý mal výrazne vyššiu aktivitu v porovnani s lcmeňmi E. coli XL l-Blue (pKSllžš), E. coli XL l-Blue (pKS 946) a označený ako Escherichia coli CCM 4229 (pKSSS).Výhodné vlastnosti tohto kmeňa v porovnaní s rodičovským kmeňom Pseudomonas sp. sú uvedené v opise vynálezu na str. 4 v tabuľke. Z týchto výsledkov vyplýva, že za rovnakých podmienok kultivácie a stanovenia špecifickej enzýmovej aktivity došlo k zvýšeniu celkom o 1800 .Plazmidy a kmene Escherichia coli podľa vynálezu je možné použiť na pripravu medziproduktov na výrobu antibiotík tzv. polysyntetických cefalosporinov napr. cefazolinu.PATENTOVÉ NÁROKY 1. Rekombinované plaznidy pKSl 18, pKS 946, pKS 55 a ich deriváty vzniknutú deléciou nekódujůcich oblasti, kódujíice syntézu hydrolázy 7 B-(4-karboxybu SK 278106 B 6tanalnidokefalosporánovej kyseliny charakterimvanej vložznýtn fragmentom DNA kmeňa Pseudolnonas sp. s velkosťou 4,0 kb v pripade pKSl 18, 5,5 kb v pripade pKS 946 a 2,5 kh pre pKSSS a reštríkčnou mapou. 2. Kmene Escherichia coli CCM 4229 (pKSll 8), 5CCM 4229 (pKS 946) a CCM (pKSSS), obsahujúce plazmidy podľa nároku l.

MPK / Značky

MPK: C12P 35/00, C12N 15/70

Značky: escherichia, obsahujúce, tieto, kmene, rekombinované, plazmidy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-278106-rekombinovane-plazmidy-a-kmene-escherichia-coli-obsahujuce-tieto-plazmidy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Rekombinované plazmidy a kmene Escherichia coli obsahujúce tieto plazmidy</a>

Podobne patenty