Způsob přípravy enzymové, resp. afinitní elektrody

Číslo patentu: 234183

Dátum: 01.04.1987

Autori: Káš Jan, Marek Miroslav, Valentová Olga

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález se týká způsobu přípravy enzymové, resp. afinitní elektrody. Způsob spočívá v tom, že se fixace enzymu, resp. interagující bílkoviny, provede kovalentní vazbou prostřednictvím reakce karbonylových, karboxylových a aminových, popřípadě isokyanidových skupin bílkovin, nosiče a přidaných substancí. V případě glykoproteinových enzymů či syntetických glykoproteinů se provede imobilizace přes jejich cukerné složky aktivované jodistanovým oxidačním štěpením. Enzymy, resp. interagující bílkoviny, je vhodné imobilizovat na nylonovou sítku, obsahující karboxylové a aminové skupiny vzniklé částečnou hydrolyzou amidových vazeb. Přetažením síťky s imobilizovaným enzymem (interagující bílkovinou) přes elektrochemické čidlo se získá enzymová (afinitní) elektroda, která má zvláště v případě imobilizace přes cukernou složku glykoproteinu velmi dobrou stabilitu. Elektrody připravené podle vynálezu jsou vhodné pro sledování průběhu enzymových reakcí, popřípadě ke stanovení jejich reakčních produktů.

Text

Pozerať všetko

vynález ee týka způeobu přípravy enzymové, resp. afinitní elektrody.Aplikace enzyaů v analytické cheaii znamená výrazný pokrok předevšía z hlediska vysoká epecifity probíhaiícich reakcí,a tí ieelektívnoeti prováděaýeh analýz. Reakoe katalyzpvaaé enzyay pobíhajipři velmi nízkých koncentracích aubetrátu a vysokou reakčai rychloetg aniž by vyładovaly extréauí hodnoty teploty, tlaku či pH reakčnieaěaí. Z uvedených důvodů je anížeaa-na aindaua aožnoet ovlivnění výsledku analýz tvorbou vedlejších produktů reakce, případněcreakoeni jiných složek analyžované aaěei látek.Průběh enzyaové reakce je možno sledovat bud náalednýai cheaiekýai reakceainapř. vzniklýeh reakčních produktů, nebo 3 výhodou fyzikálíníai či ryzizuné cheaicxýní aetodaai. vedle velai často používané epektrofotoaetrie má výlký výsnal spojeni enzyaové reakce a elektrooheaickýmihčidly detegujícíui substráty, produkty či jiné látky ovlívňudící průběh enzyaové reakce.Z enzynovýeh reakcí je aožno elektrochenicky sledovat takové,při nichž dochází ke zaěnáa konoentraoí 02, HŽOZ, NAD/P/H, C 02, ą, NH , přĺpgdně dalších iontů, např. GN apmLNejvětší aožnostijgou tedy při elektrochenickén sledování průběhu reakcí katalyzovaných oxidoreduktasaai, hydrolasaai, lyaeaai a ligasaai.Použití volných enzyuů naráží v některých případech na technické či ekonoaické problény jejích zíekávání. Z tohoto důvou je velai atraktivní jejich fixace v blízkosti elektrocheaického čidla,čínž je zíekán senzor /enzynová elektroda/ opakované použitelný při stovkách analýz bez jakékoliv spotřeby cheaikálií /v některých případech pouze pufru/. Tento postup je označován jako bezreagenční analýza.Enzynové elektrody je možno připravit 234153 1. Použití rozpuatného eazynu, který se oddělí v blízkosti elektrochenického čidla od okolního prostředí seniperneabílní nenbŕánou /tzv. paeudoinobilisace/. 2. Enzyn se zachytí ve etruktuře gelu /polyakrylanidového gelu,želatiny, alginátů ep./ na povrchu eenzoru. 3. Eazy je některou z inobilisačních technik vázán na přirozené/hapř. kolagen/ nebo synthetické Ienbrány. 4. Enzyn je norbován na povrchu nelbrány a pak zenítěn bifunkčniliAnalytickl využitelnoet enzylovýeh elektrod je podstatné ovlivněna jejich stabilitou. Jednín z hlavních faktorů, které ovlivňují stabilitu enzynových elektrod, je způsob inobilisaoe enzyn. Při pseudoiIobilieaei obvykle nepřeoáhne stabilita takto připravené enzylové elektrody 1 týden, fyzikální eovpĚe,doŠÉüjeprodloúžení stability enzynové elektrody na 5 až 4 týdny a aplikace chenieké vazby na několik něeíeů až rok. nvedle aktivity enzynů nohou být elektrochenicky sledovány i různé bioapecifieké interakee, např. iaterakce entigenu 3 protilátkou nebo bílkoviny e vhodný afinitnín liganden. Fixací jedné složky z uvedených iatenagujícícn dvojíc v blízkosti elektroehenického čídla je pak připravena efinitní elektroda.Způsob přípravy enzynové nebo afinitní elektrody podle vynálezu opočívá v ton, že se enzyn nebo interagující bílkovina fixuje na nosič uníetěný v blízkosti elektrocheuiekého čidla kovalentní vazbou lezi fumkčníui skupinani karboxylovýni, aminovýni, aldehydovýli e popřípadě iaokyanidovýni enzyiu, interagujíeí bílkoviny,nosiče a případně dalších rozpuatných složek reakční elěei, například cyklohexylieokyanidu nebo bifunkčníeh činidel, Jako je glutaraldehyd nebo glyoxal.Při uvedené reakci je využívĺno aninoskupín, příp. karboxylových skupin enzy,reep. interagující bílkoviñy. V případě glykoproteinů je s výhodou využito aldehydových skupin.vytvořených jodistanovýn štěpenín cukerné složky glyzoproteinu. Tento způsob234 103 ilobílisace enzynu je zvláětě výhodný, poněvadž zaručuje Kovaleátní vazbu Iino aktivní centrum enzylu. U enzynů, které neobeahujíp cukernou složku, je možno reakcí s aldehydovýni skupinami přidaného polyeacharidu /bxidoveného jodistanen aodnýn/ přípravit syntbetický glykoprotein.Způeoben podle vyàálezu je enzyn, resp. interagující bílkovi na ilobiliaována na Ieubránu, resp. eítku obsahujíeí jednu ze čtyřskupin podílejících se na čtyřkonponentní reakei, tj, aldehydové,ieokyenidové, karboxylové čí aninoskupíny. S výhodou je možno po~ užít nylonové eítky 3 částečně hydrolyzovanýni anidovýni vazbani. Parciální deetrukci nylonu je možno provést hydrolytíckýn účinken zředěnýeh Iinerálních kyselín.Vlastní příprava enzymové elektrody podle vynálezu epočívá v aplikaci reagujících složek Ugího reakce na povrchu sířky, resp. membrány e aktivními skupinami e po proběhnutí kondenzační reakce a náaledném promwtí vhodâm pufrem ve fixací sížky e navázeným enzymem na povrchu elektrochemického čidla.Výhodou způeobu přípravy eazymové, resp. afinitní elektrody podle vynálezu je větší pevnoet vytvořené kovalentnt vazbg např. ve srovnání e.nejčaetěji používenou fixací enzymn pomocí glutaraldehydą,a především větší stabilita získané elektrodm zvláätě v případě.1 mobilieaee přes cukernou složku glykoproteinn.vynález je dokumentován příklady použití.Povrch nylonové eíłky byl částečně hydrolyzován půeobením 3 M chlorovodíkové kyseliny po dobu 20 minut. Po promwtí destilovanou vodou byly na povrch síčky aplikovány 0.1 ul cyklohexylisokyanidu,0,3 ul 2,5 glutareldehydu a 15 ul glukoeeoxidasy /l mg/100 ul 0,1 M foefátového pufru pH 6,8/. Po 6 h byla sítka s navázanou glukosaoxidaeou důkladně promwta 0,1 M foefátovým pufrem pH 6,8 a potüu byla fixovuną na povrchu kyslíkověho článku /výrobce Chemoprojekt,Praha 9-Setalíce/z Pomocí takto pripravené enzymové elektrody byla stanovena D-glukosa na základě úbytkůkye 1 íku v reakční směsi /mě4 234153 řeno amperometricky s použitím měřiče malých proudů - výrobce unemoprojekt, Praha 9-Sataliee/. odozva enzymové elektrody v zavia loati na koncentraci D-glukosy byla lineární v rozsahu koncentrací 10 až 1 o 5 mol/1.Roztok glukosaoxidany obsahující 65 mg bílkoviny ve 130 ml 0,1 M acetátového pufru pH 5 byl oxidován 5,2 ml 0,05 M jodiutann sodného po dobu 4 h za nepříetupu světla při 4 °C. PřebytekJodish tann sodaáho byl odatraněn přídavkem 0,14 ml ethylenglykolu. Po další 0,5 h míchání byla reakční směa.dia 1 yàovína 16 h proti 0,05 Ľ fosfátovému pufru pH 6. získaný roztok oxidované glukosaoxidaay byl zahuštěn Aquacidem na 1/10 objeu.Na povrch nylonové aířky upraveněñle příkladu 1 býlo aplikováno 30 ul oxidované glukonaoxidaay, 0,2 ul 0,5 M octové kyseliny a 0,1 ul cyklohgxyliaokyanidu. Po 10 h byla aířkas navázanou glukoaaoxidasou důkladně promwta 0,1 M foafátovým pufrem pH 6 a použita k enzymovémn stanovení D-glukosy vis. příklad 1.Na povrch nylonové aířky upravené jako v příkladu 1 byla aplikována směa enzymú invertaay a glúkoeaoxidaoy /poměr enzymovýeh aktivít 1 9/ v množství 20 ul, 0,5 ul 2,5 gíyoxalu a 0,2 ul cyklohexyliaokyanidn. Po 4 h reakce byla oířka promwta Meľlvainovým pufrem /citrát/fosfát 0,1 a 0,2 mo 1.am 3/ pH 7,0 a pak připévněna na povrch kyalíkového č 1 ánku.jako v příkladu 1. Stejným způsobem byla stanovena i koncentrace g 1 ukoay.Kbncentrace stanovované sacharoay je pak úměrná množství stanovené glukosy, která vznikla hyrolýzou sacharoey koimobiliaovanou inrertasou.Příklad 4 Směs enzymú inyertasy a glukoaaoxidaay v poměru enzymovýehaktivít /1 10/, ve fosfátovém pufru pH 6,0 byla oxidována 5 mm jodiatanem aodným po dobu 2 hod při 4 °C vêämě. Po skončené reakei byl přebytek jodistanu odstraněn přídavkem etnylenglykolu a měn dialyzována proti 0,05 M fosfátovému pufru pH 6. Oxidovaná mělenzymñ byla koncentrována odstředěním pomocí ultrafiltračnich membrán Amicon.

MPK / Značky

MPK: C12M 1/40

Značky: enzymové, způsob, elektrody, afinitní, resp, přípravy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/8-234183-zpusob-pripravy-enzymove-resp-afinitni-elektrody.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob přípravy enzymové, resp. afinitní elektrody</a>

Podobne patenty