Nové multivalentné imunoglobulíny

Číslo patentu: E 11411

Dátum: 26.06.2007

Autori: Rüker Florian, Wozniak-knopp Gordana, Himmler Gottfried

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka multivalentného ímunoglobulínu, alebo jeho časti, ktorý sa špecificky viaže na aspoň dve povrchové molekuly jednej bunky, s aspoň jednou modiñkáciou v aspoň jednej oblasti štrukturálnej slučky uvedeného imunoglobulinu určujúcou viazanie na epítop uvedených povrchových molekúl bunky, pričom nemodiñkovaný imunoglobulín sa nevíaže významne na uvedený epítop.Monoklonálne protilátky sa považujú za užitočné na mnohé terapeutické, diagnostické a analytické použitia.Bude tu vysvetlená základná štruktúra protilátky, pričom ako príklad bude použitý intaktný lgGl imunoglobulín. Dva rovnako ťažké (heavy, H) a dva rovnako ľahké (light, L) reťazce sa spájajú za vzniku molekuly protilátky v tvare Y. Každý z ťažkých reťazcov má štyri domény. Amino-terrninálne variabilné domény (VH) sú na hrotoch Y. Po nich nasledujú tri konštantné domény CHI, CH 2 a karboxy-tenninálna CH 3, na päte Y-ovej stopky. Krátke rozpätie(streteh), spojka (switch), spája ťažké reťazce variabilných akonštantných oblastí. Kĺb(hinge) pripája CH 2 a CH 3 (Fc fragment) k zvyšku protilátky (Fab fragmenty). Jeden Fc adva rovnaké Fab fragmenty sa môžu vytvárať proteolytickým štiepením kĺbu v intaktnej molekule protilátky. Ľahké reťazce sú vytvorené z dvoch domén, variabilnej (VL) a konštantnej (CL), oddelených spojkou.Disulfidové väzby v kĺbovej oblasti spájajú dva ťažké reťazce. Ľahké reťazce sú spriahnuté s ťažkými reťazcami s prídavnými disulñdovými väzbami. Asn-spojené sacharidové časti sú pripojené v rozličných polohách v konštantných doménach v závislosti od triedy imunoglobulínu. Pre lgGl dve disulfidové väzby v kĺbovej oblasti, medzi Cys 235 a Cys 238 párrní, spájajú dva ťažké reťazce. Ľahké reťazce sú spriahnuté s ťažkými reťazcami dvomi prídavnými disulñdovými väzbami, medzi Cys 229 s v CHI doménach a Cys 2 l 4 s v CL doménach. sacharidové časti sú pripojené k Asn 306 každej CH 2, pričom vytvárajú výrazné vyklenutíe v stopke Y.Tieto vlastnosti majú vážne funkčné dôsledky. Variabilné oblasti ako ťažkých, tak ľahkých reťazcov (VH) a (VL) ležia na hrotoch, kde sú umiestnené tak, aby reagovali s antigénom. Tento hrot molekuly je miestom, na ktorom je umiestnený N-koniec aminokyselinovej sekvencie. Stopka Y vyčnieva spôsobom, aby sa účinne sprostredkovali funkcie efektom, ako je aktivácia komplementu a interakcie s F c receptormi, alebo ADCC a ADCP. Jej CH 2 a CH 3domény sa vydúvajú, aby uľahčili interakcie sproteínmi efektora. C-Koniecaminokyselinovej sekvencie je umiestnený na protiľahlej strane hrotu, ktorá môže byť označená výrazom dno Y.V protilátkach sa nachádzajú dva typy ľahkých reťazcov, označené ako lambda O.) a kappa(K). Daný imunoglobulín má buď K reťazce alebo l reťazce, nikdy jeden z každého. Medzi protilátkami obsahujúcimi k alebo K ľahké reťazce sa nezistil žiadny funkčný rozdiel.Každá doména V molekule protilátky má podobnú štruktúru dvoch beta skladaných listov navzájom tesne zbalených proti sebe a stlačených antiparalelne k beta-plášťu. Táto zachovaná štruktúra sa označuje ako ímunoglobulínové zbalenie (immunoglobulín fold). lmunoglobulínový fold konštantných domén obsahuje 3-vláknovú štruktúru zbalenú oproti 4 vláknovej štruktúre. F old je stabilizovaný vodíkovými väzbami medzi beta vláknami každého skladaného listu, hydrofóbnymi interakciami medzi zvyškami opačných štruktúr vo vnútri a disulfidovou väzbou medzi skladanými listami. 3-Vláknový skladaný list obsahuje vlákna C, F a G a 4-vláknový skladaný list máivlákna A, B, E a D. Písmená A až G označujú sekvenčné polohy beta-vlákien pozdĺž aminokyselinovej sekvencie imunoglobulínového foldu.Fold variabilných domén má 9 beta-vlákien usporiadaných v dvoch skladaných listoch zo 4 a 5 vlákien. 5-Vláknový skladaný list je štruktúrne homológny s 3-vláknovým skladaným listom konštantných domén, ale obsahuje prídavné vlákna C a C. Zvyšné vlákna (A, B, C,D, E, F, G) majú rovnakú topológiu apodobnú štruktúru ako ich protipóly v konštantných doménových imunoglobulinových foldoch. Disulñdová väzba spája vlákna B a F v protiľahlých skladaných listoch, ako v konštantných doménach.Variabilné domény ako ľahkých tak ťažkých imunoglobulínových reťazcov obsahujú tri hypervariabilné slučky alebo oblasti určujúce komplementaritu (complementarity-determining regions, CDRs). Tri CDRs z V domény (CDRl, CDR 2, CDR 3) sú zoskupené na jednom konci beta-plášťa. CDRs sú slučky, ktoré spájajú beta-vlákna B-C, C-C a F-G imunoglobulínového foldu. Zvyšky v CDRs sa líšia od jednej imunoglobulínovej molekuly po ďalšiu, pričom každej protilátke prepožičiavajú antigénovú špeciñckosť.VL a VH domény na hrotoch molekúl protilátky sú tesne zbalené tak, že 6 CDRs (3 na každej doméne) spolupôsobia pri skonštruovanl povrchu (alebo kavity) pre antigén-špeciñckú väzbu. Prirodzene antigénové miesto protilátky teda pozostáva zo slučiek, ktoré spájajú vlákna B-C,C-C a F-G ľahkého reťazca variabilnej domény a vlákna B~C, C-C a F -G ťažkého reťazca variabilnej domény.Slučky, ktoré nie sú CDR-slučkami v natívnom imunoglobulíne, alebo nie sú súčasťouantigén viažuceho žliabku ako je určené CDR slučkami, nemajú antigénovú väzbu aleboepitop viažucu špeciñckosť, ale prispievajú k správnemu zbaleniu celej molekuly imunoglobulínu a/alebo jej efektora alebo k ďalším funkciám, a sú preto nazvané štrukturálnymi slučkami na účely tohto vynálezu. Dokumenty z doterajšieho stavu techniky ukazujú, že imunoglobulín sa ako skelet použil na účely manipulácie existujúceho väzbového miesta antigénu, čím sa zaviedli nové väzbové vlastnosti. Avšak doteraz boli skonštruované len CDR oblasti pre viazanie antigénu, inými slovami, v prípade imunoglobulínového zbaľovania, bolo modifikované len prirodzene väzbové miesto antigénu, aby sa zmenila jeho väzbová afinita alebo špecifickosť. Existuje veľké množstvo literatúry, ktoré opisuje rozličné formy takto manipulovaných imunoglobulínov, často exprimovaných vo forme jednodielneho reťazca F v fragmentov (single-chain FV, scFv) alebo F ab fragmentov, bud exprimovaných na povrchu čiastočiek fágov alebo rozpustne exprimovaných v rozličných prokaryotíckých alebo eukaryotických expresných systémoch.PCT/EP 2006/050059 opisuje spôsob konštruovanía imunoglobulínu, ktorý zahŕňa modiñkáciu v oblasti štrukturálnej slučky, aby sa získalo nové väzbové miesto antígénu. Tento spôsob je široko použiteľný na imunoglobulíny a môže byť použitý na vytvorenie série imunoglobulinov cielených na rôzne antigény. Multivalentné spojivá cieľov na povrchu bunky nie sú explicitne opísané.US 2005/266000 Al opisuje polypeptidy obsahujúce premenlivý ťažký reťazec variabilnej kostrovej domény (variable framework domain VFR). VFR je súčasťou antigén viažucej dutiny alebo žliabku, ktoré môžu kontaktovať antigén. VFRs sú súčasťou CDR slučkovej oblasti a sú lokalizované na variabilnej doméne na boku CDR slučiek na podporenie viazania antigénu cez CDR slučkovú oblasť. Štrukturálne slučky iné ako VFR neboli mutované na učely konštrukcie antigén viažuceho miesta.Proteíny povrchových buniek spriahnuté s humánnou rakovinou môžu byt účinnými cieľmi monoklonálnej terapie. Protilátky môžu vyvolať protinádorovú odpoveď moduláciou bunkovej aktivácie alebo zosilnením imunitného systému.Niektoré mAbs pôsobia sčasti zosietovaním cieľa, čim môžu hromadiť ciele, čo vedie k aktivácii, inhibícii alebo amplííikácii bunkovej signalizácie, čo nakoniec končí zadržaním bunky a/alebo apoptózou bunkového cieľaBolo preukázané, že niektoré MAbs (anti-CDl 9, -CD 20, - CD 21, a -CD 22), ktoré majú malý alebo žiadny inherentný protirastový účinok na bunkové linie lymfómov, sa môžu zmeniť na silné protirakovinové činidlá, ked sa použijú ako tetravalentne homodiméry. Tieto účinkymôžu byť zväčšené in vivo zosilnením efektorových buniek a/alebo komplementu.Ďalšou stratégiou používanou pre terapeutické mAbs je pripojenie cytotoxického liečiva na mAb. Takýto ímunotoxín sa môže viazať na cieľ na povrchu bunky, nasleduje internalizácia,uvoľnenie liečiva na usmrtenie bunky. Nevyhnutnou podmienkou intemalizácie môže byt zhlukovaníe cieľa.Na zvýšenie sily mAbs, ktoré pôsobia cez zhlukovaníe cieľových molekúl, sa navrhli rôzne úpravy multivalentných Ab. Boli navrhnuté kovalente spojené IgGs celej dĺžky, ktoré tvoria tetravalentné Abs, a prirodzene sa vyskytujúce lgM a IgG Abs, napodobňujúce polyméme lgM and IgA, použitím ich sekrečných koncoviek. Ďalší tetravalentný variant sa navrhol pridaním Fab na C-koniec každého H reťazca IgG celej dĺžky.Aby sa zlepšila penetrácia tumom, na vytvorenie multivalentných komplexov sa navzájom spojili menšie konštrukty s použitím fragmentov jednoduchých reťazcov F v (scFv) (každý F v zahŕňa variabilnú ľahkú doménu a variabilnú ťažkú doménu, spojené peptidovými linkermí). Takéto konštrukty môžu mať relatívne krátke polčasy rozpadu (v porovnaní s polčasmi rozpadu mAbs celej dĺžky), následne sa toto vyriešilo napojením týchto scFv multimérov na Fc fragmenty IgG. S scFv a podobnými štruktúrami je náročné kontrolovať vznik presného multimerizačného stupňa, t.j. dimérov, trimérov, tetramérov, aväčšie komplexy sa môžu tvoriť v premenlivých pomeroch v závislosti od základného konštmktu a spôsobu expresied WO 2006/036834 A opisuje molekuly a spôsoby, ktorými sa biologicky účinné peptidy včlenia do slučkovej oblasti Fc domény.WO 01/83525 Azverejňuje fúziu Fc domén sbiologicky účinnými peptidmi, aby sa zvýšil polčas rozpadu peptidov in vivo.Adachi Masaaki a kol. (Protein Science, Cambridge University Press, Cambridge, GB roč. 12,č. 10 (2003) 2125-2131) zverejňuje modifikáciu CL-CH 1 na kontrolu añnity antigénprotilátka pre F v.WO 02/32925 A opisuje knižnice fragmentov ñbronektínu s náhodnými slučkami podobnými CDR vo variabilných doménach.Ktorýkoľvek známy spôsob na produkciu multivalentných imunoglobulínov ma určité nevýhody, ako sú imunogenicita, in vivo polčas rozpadu alebo výrobné problémy.Predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť modulámy systém, ktorý umožní navrhnúť multivalentný imunoglobulín cielený na bunku podľa príslušných potrieb, aby sa vyriešiliproblémy doterajšieho stavu techniky.

MPK / Značky

MPK: C07K 16/00, C12N 15/62, C07K 19/00

Značky: multivalentné, nové, imunoglobulíny

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/79-e11411-nove-multivalentne-imunoglobuliny.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Nové multivalentné imunoglobulíny</a>

Podobne patenty