Oxidoreduktázy na stereoselektívnu redukciu ketozlúčenín

Číslo patentu: E 17972

Dátum: 20.07.2006

Autori: Gupta Antje, Dupont Maria, Tschentscher Antje

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložený vynález sa týka spôsobu enantioselektívnej enzymatickej redukcie ketozlúčeniny na zodpovedajúcu chirálnu hydroxyzlúčeninu, pri ktorej sa ketozlúčenina redukuje pomocou oxidoreduktázy. Vynález sa týka ďalej nových oxidoreduktáz na použitie pri enantioselektívnej redukcii ketozlúčenín0002 Opticky aktívne hydroxylové zlúčeniny sú cenné chirálne konštrukčné prvky so širokým použitím pre syntézu farmakologicky účinných zlúčenín,aromatických substancií, feromónov, agrochemikálií a enzýmových inhibítorov. Pri tom je obzvlášť vsektore farmácie stále stúpajúci dopyt po chirálnych zlúčeninách a teda po vytvorení syntéznych technológií, nakolko v budúcnosti skoro žiadne racemické zlúčeniny nebudú nachádzať použitie ako liečivá.0003 Asymetrická redukcia prochirálnych ketozlúčenín je jeden sektor stereoselektívnej katalýzy, v ktorom predstavuje bíokatalýza výkonnú konkurenčnú technológiu kchemickej katalýze. Chemická asymetrická hydrogenácia vyžaduje použitie vysoko jedovatých a životné prostredie poškodzujúcich katalyzátorov na báze ťažkých kovov, extrémnejšie a tak na energiu náročnejšie reakčné podmienky, ako aj veľké množstvá organických rozpúšťadiel. Ďalej sa tieto spôsoby často vyznačujú vedľajšími reakcíami a0004 Redukcie prochirálnych ketozlúčenín na hydroxylové zlúčeniny a naopak sa vyskytujú vprírode vpočetných biochemických procesoch, ako v primárnej látkovej výmene, tak aj v sekundárnej látkovej výmene, v každom organizme a sú katalyzované pomocou rôznych typov alkoholdehydrogenáz a oxidoreduktáz. Tieto enzýmy sú spravidla závislé od kofaktorov.0005 Principiálna uskutočniteľnosť využitia biokatalyzátorov na redukciu prochirálnych ketozlúčenín na chirálne hydroxylové zlúčeniny bola vminulej dobe opakovane demonštrovaná na základe modelových systémov, pri ktorých sa pracovalo ako s izolovanými oxidoreduktázami, tak aj s biotransformačnýmisystémami na báze celých buniek. Pritom sa ukázali biokatalytické systémyv podstate s ohľadom na mierne reakčné podmienky, na chýbajúce vedľajšie produkty a často na v podstate lepšie dosiahnuteľné nadbytky enantiomérov,ako výhodné. Použitie izolovaných enzýmov sa javí oproti spôsobom s celými bunkami s ohľadom na dosiahnuteľný nadbytok enantiomérov, vznik produktov odbúravania a vedľajších produktov, ako aj s ohľadom na izoláciu produktov,ako výhodné. Ďalej použitie procesov sceiými bunkami v každej chemickej výrobe nie je vždy možné, nakoľko je ktomu potrebné špeciálne vybavenie a know how.0006 Vposlednej dobe mohlo byt ukázané, že použitie izolovaných oxidoreduktáz vo vodnolorganickom dvojfázovom systéme sorganickými rozpúšťadlami je možné nanajvýš eficientné, ekonomické a taktiež vo vysokých koncentráciách ( 5 ). V opísaných systémoch tvoria pri tom redukované,väčšinou vo vode zle rozpustné ketozlúčeniny spoločne sorganickým rozpúšťadlom organickú fázu. Čiastočne je taktiež možné od použitia organického rozpúštadla samotného upustiť, potom sa organická fáza tvori zredukovanej ketozlúčeniny (DE 10119274, DE 10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). Regenerácia koenzýmu sa pri tom realizuje súčasnou oxidáciou sekundárnych alkoholov, pri ktorej sa vo väčšine prípadov používa0007 Ako príklady vhodných R- a S-špeciñckých oxidoreduktáz a dehydrogenáz s vysokou enantioselektivitou je možné uviesť0008 R-špecifické sekundárne alkoholdehydrogenázy zorganizmov rodu Lactobaci/Ius(Lactobacillus kefir (US 5200 335), Lactobacil/us brevis (DE0009 Dnes známe enzýmy však nedostačujú nato, aby sa rozšírili na celkový potenciál trhu a uspokojili dopyt po stereoselektívnej redukcii ketozlúčenín. To je na jednej strane odôvodnené tým, že jednotlivé enzýmy disponujú veľmi rozdielnymi vlastnosťami s ohľadom na substrátové spektrum,optimum hodnoty pH, ako aj na stabilitu voči teplote a rozpúšťadlám, ktoré sa často navzájom dopĺňajú. Preto môžu samotné pomerne podobné, homológne enzýmy mat s ohladom na určitý substrát úplne rozdielne schopnosti pri reakcii. Na druhej strane nie sú dávno všetky opísané enzýmy klonované a v dostatočnej miere nadmerne exprimovatelné, čo znamená, že tieto enzýmy nie sú na priemyselné použitie kdispozícii. Preto je kmožnému širokému čerpaniu syntetického potenciálu enzymatickej asymetrickej hydrogenácie nutné dať kdispozícii pokial možno široké portfólio priemyselne dostupných rôznych oxidoreduktáz, ktoré by boli vhodné na použitie vo vodno/organických0010 Predmetom predloženého vynálezu je teraz rad nových,enantioselektívnych R- a S-špeciñckých oxidoreduktáz, ktoré sa vyznačujú dobrou stabilitou vo vodno/organických dvojfázových systémoch, ako aj dobrou exprimovateľnosťou v Escherichia coli ( 500 Jednotiek/g E. coli vlhkejbiomasy), ako aj spôsob enantioselektívnej enzymatickej redukcie ketozlúčeniny na zodpovedajúcu chirálnu hydroxylovú zlúčeninu.0011 Oxidoreduktázy podľa vynálezu sa vyznačujú tým, že majú aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej je aspoň 75 aminokyselín identickýchs aminokyselinami aminokyselinovej sekvencie SEQ ID No 4.0012 Polypeptid, ktorý zodpovedá SEQ ID No 4, sa môže získať z baktérií zo skupiny Leuconostoc, obzvlášť z Leuconostoc carnosum DSMZ 5576. Predmetom vynálezu je ďalej sekvencia nukleových kyselín SEQ lD No 12, ktorá kóduje proteín saminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No 4. Tentopolypeptid je obzvlášť vhodný na redukciu 2-oktanónu na R-2-oktanol a na oxidáciu R-2-oktanolu. Je taktiež veľmi dobre vhodný na redukciu 4 haloacetoacetát esteru na estery kyseliny S-4-halogén-3-hydroxymaslovej.0013 Oxidoreduktáza z Leuconostoc carnosum je homodimér s molekulárnou hmotnosťou zistenou v SDS-géli, 27 i 2 kDa. Optimum hodnoty pH pre redukčnú reakciu leží pre túto oxidoreduktázu v rozmedzí 5,0 až 6,0 a optimum hodnoty pH pre oxidačnú reakciu leží v rozmedzí 6,0 - 9,0. Oxidoreduktáza z Leuconostoc carnosum má dobrú stabilitu voči teplote, pH a rozpúšťadlám a vykazuje pri hodnote pH v rozmedzí 4,5 až 10, ako aj pri teplotách až 35 °C taktiež pri dobách inkubácie viacerých hodín len nepatrnú stratu aktivity.0014 Vynález sa týka ďalej fúznych proteínov, ktoré sa vyznačujú tým, že predstavujú oxidoreduktázy saminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No 4,alebo ich homológy, ktoré sú peptidicky spojené s ďalším polypeptidom na Nterminálnom alebo na karboxy-terminálnom konci. Fúzne proteíny sa môžu napríklad ľahšie oddeliť od iných proteínov alebo sa môžu vo väčšom množstve0015 Vynález sa týka ďalej protilátok, ktoré sa špecificky viažu na oxidoreduktázy podľa SEQ ID No 4, alebo na ich homológy, Výroba týchto protilátok sa uskutočňuje pomocou známych metód s imunizáciou vhodných cicavcov a nasledujúceho získavania vytvorených protilátok. Protilátky môžu byť monoklonálne alebo polyklonálne.0016 Porovnanie aminokyselinových sekvencií sa môže napríklad uskutočniť na internete v proteínových bankách, ako je napr. SWISS-PROT a PIR, ako aj v DNA bankách, ako je napr. EMBL, GenBank apod. za využitia programu FASTA alebo programu BLAST.0017 Optimálny alignement sa pri tom zistí s pomocou BLAST algoritmu(Basic Local Alignement Search Tool) (Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87 2264 - 2268). Ako scoring-matrica pre výpočet sekvenčnej podobnosti sa berie za základ PAM 30-matrice (Dayhoff M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C.1978. A model of evolutionary change in Proteins in Atlas of Protein Sequence

MPK / Značky

MPK: C12P 41/00, C12N 9/02, C12P 7/02

Značky: redukciu, stereoselektívnu, ketozlúčenín, oxidoreduktázy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/76-e17972-oxidoreduktazy-na-stereoselektivnu-redukciu-ketozlucenin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Oxidoreduktázy na stereoselektívnu redukciu ketozlúčenín</a>

Podobne patenty