Spôsoby detekcie a diagnostiky rakoviny zahŕňajúce primery a sondy na špecifickú detekciu markera MAGE-A3

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložený vynález sa týka diagnostickej metódy na detekciu MAGE-AS,DOTERAJŠI STAV TECHNIKY0002 MAGE (melanómový antigén) rodina génov sa pôvodne identiñkovala prostredníctvom toho, že bola rozoznávaná cytolytickými lymfocytmi izolovanými z krvných lymlocytov pacientov s rakovinou (Van der Bruggen a spol. 1991). MAGE génová rodina teraz zahŕňa viac ako 20 členov a je tvorená MAGE A, B, C a D génmi (Scanlan a spol., (2002) Immunol Rev. 188222-32 Chomez a spol., (2001) Cancer Res. G 1(14)554451). Sú zoskupené na chromozóme X (Lucas a spol., 1998 Cancer Res. 587435152 Lucas a spol, 1999 Cancer Res 594100-4103 Lucas a spol., 2000 lnt J Cancer 87255-60 Lurquin a spol., 1997 Genomics 46397-408 Muscateííi a spol., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 9224987-4991 Pold a spol., 1999 Genomics 592161-167 Rogner a spol. 1995 Genomics 29725-731) a ešte nie je definovaná ich funkcia (Ohman a spol. 2001 Exp Cell Res. 265(2)185-94). MAGE gény sú vysoko homologické a najma členovia MAGE-A rodiny majú 60-98 homológiu. MAGE gény sa neexprimujú v normálnych bunkách. s výnimkou expresie v spermatogóniách a v placente (Haas a spol. 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 1847-51 Takahashi a spol. 1995 Cancer Res 5523478-382).0003 Reaktivácia MAGE génovej expresie pri rakovine je spôsobená abnorrnálnou demetyláciou promótora(De Smeet a spol. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93(14)7149-53 De Smeet a spol. 1999 MoI Cell Biol. 19(11)7327-35). 12 MAGE-A génov sa variabilne nadexprimuje pri nasledujúcich typoch rakoviny tranzičný bunkový karcinóm, ezofagiálny karcinóm, melanóm, rakovina močového mechúra a iných ako malých buniek pľúc (NSCLC) (Scanlan a spol. 2002 lmmunol Rev. 188222-32). Nadexprimovanie a špeciñcita MAGE expresie v rakovinových tkanivách viedla k tomu, že sa MAGE-A 3 proteín používa ako antigén pre rakovinové vakcíny(Scanlan a spol. 2002 lmmunol Rev. 18822-32). Avšak kvôli tomu, že u pacientov s rakovinou dochádza k širokému rozsahu expresie, musí sa expresie MAGE-A 3 presne odhadovať u každého pacienta, aby sa dosiahla priama Vakcinácia pacientov exprimujúcich tento proteín. MAGE-A 3 sa často zamenitelne označuje ako MAGE-3. Tu sa používajú obe označenia.0004 Pacienti s malígnym melanómom s distálnymi metastàzami (IV. štádium podľa klasifikácie American Joint Committee on Cancer (AJCC majú medián prežívania jeden rok, pričom dlhodobo z nich prežíva len 5. Aj štandardná chemoterapia lV. štádia melanómu ma mieru terapeutickej reakcie len 8-25, pričom nemá žiadny účinok na celkové prežlvanie. Pacienti s regionálnymi metastázami (Ill. štádium) majú medián prežlvania dva až tri roky s veľmi nízkou šancou na dlhodobé prežlvanie aj po adekvátnom chirurgickom ošetrení primárnych a regionálnych metastáz (Balch a spol., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6)400-14). Váčšine pacientov s melanómom v I. až Ill. štádiu sa nádor chirurgicky odstráni, ale pretrváva u nich podstatné riziko recidívy. Teda pretrváva potreba prevencie progresie melanómu a lepších terapeutických režimov pre metastázujúci melanóm a potreba prídavných terapií pre pacientov, ktorým sa primámy nádor odstránil.0005 Existujú dva typy rakoviny pľúc rakovina iných ako malých buniek pľúc (NSCLC) a rakovina malých buniek pľúc (SCLC). Tieto označenia jednoducho opisujú typ buniek, ktoré sa nachádzajú v nádoroch. NSCLC zahŕňa karcinóm šupinatých buniek, adenokarcinóm a karcinóm veľkých buniek, a podieľa sa na približne 80 rakoviny pľúc. NSCLC sa veľmi ľažko lieči a dostupné terapie majú tendenciu mat za ciel čo najviac predlžovat život a zmierňovat symptómy ochorenia. NSCLC je najbežnejším typom rakoviny pľúc a spája sa s velmi slabými výsledkami. Zo všetkých NSCLC pacientov má približne 25 lokoregionálne ochorenie v čase diagnostiky a ešte stále je možné ich liečiť chirurgickým odstránením (podľa AJCC klasitikácie sú to štádia IB,IIA alebo IIB). Avšak u viac ako 50 týchto pacientov dôjde do dvoch rokov po kompletnej chirurgickej resekcii k recidive. Pre týchto pacientov je preto potrebná lepšia liečba.0006 Predtým sa množstvo metód pokúšala merať expresiu MAGE-A 3 génov tak v bunkových Iíniách, ako aj v nádorových vzorkách. Používa sa RT-PCR (De Plaen a spol. 1994 lmmunogenetics 40(5)360-9), ďalšie techniky na báze PCR, ako aj nízkohustotný mikrorad (Zammatteo a spol. 2002 Clinical Chemistry 48(1) 2534). V mnohých týchto štúdiách je však hlavným problémom veľmi vysoká homológia medzi členmi MAGE rodiny, ktorá sposobuje falošne pozitívne výsledky. Na rozsiahle skúšania v Il. a Ill. fáze je potrebný kvantitatívny vysokovýkonný text, ktorý by bol schopný špeciñcky identiñkovaf MAGE-Aa-exprimujúce vzorky,s redukovanou pravdepodobnosťou falošne pozitívnych testovacích vzoriek.0007 Ďalší problém súvisí s používaním vo fonnalíne fixovaného a parafíne obaleného (F FPE) nádorového tkaniva, ktoré je výsledkom zvyčajnej metódy konzervovanie nádorových tkanív na klinikách. Fixácia voforrnalíne meni štruktúru molekúl RNA v tkanive, čo spôsobuje krlžovú reakciu a aj čiastočnú degradáciu. Čiastočná degradàcia vedie k vytvoreniu malých kúskov RNA s veľkosťou 100-300 bázových párov. Tieto štrukturálne zmeny RNA sťažujú používanie RNA extrahovanej z FFPE tkaniva pri bežných diagnostických technikach.Stručný opis obrázkov 0008Obrázok 2 Špeciñcita TaqMan RT-PCR s Minor Groove Binding (MGB) sondou pre MAGE-AS expresiu. Obrázok 3 Testovanie špeciñcity MAGE-A 3 primerov v prítomnosti MAGE-A 3 a MAGE-ô plazmidov. Obrázok 4 Expresia MAGE-A 3 nádorom, meraná prostrednictvom kvantitatlvnej TaqMan PCR.Obrazok 6 a Špeciñcita MAGE-A 3 primerov určených na použitie s F FPE tkanivom.Obrázok Sb Testovanie linearity primerov pri roznych množstvách RNA.Obrázok 7 Porovnanie testu s neskoršie zmrazenou RNA a PCR FFPE tkaniva.Obrazok 8 Relatlvne porovnanie testu s neskoršie zmrazenou RNA a FFPE testu na báze MAGE-A 3. Obrázok 9 Nukleotidovà sekvencia kodujúca fúzovaný protein z Iipoprotein D fragmentu, Mage 3 fragmentu a histidínového ohvosta, a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia (SEQ ID N 0 35 a 36). Obrázok 10 Fúzovaný protein z NS 1-MAGE 3 a histidínového chvosta (SEQ ID N 037).Obrázok 11 DNA kódujúca fúzovaný protein NS 1-MAGE 3-His (SEQ ID N 0238).Obrázok 13 DNA fúzovaného proteínu GLYTA-MAGE 3-His (SEQ ID N 0140).Obrázok 14 Usporiadanie sekvencii rodiny MAGE-A génov na navrhnutie RT-PCR primerov a sond pre MAGE-A 3. ~Obrázok 15 Usporiadanie MAGE-A 3 a MAGE-AG sekvencil na identifikáciu oblasti, ktoré obsahujú cieľová sekvencie (v rámikoch).Obrázok 16 Triedy semi-kvantitatívnej MAGE-A 3 RT-PCR príklad ako može byť päť tried priradených semi-kvantitatlvnemu MAGE-AS RT-PCR testu.Obrázok 17 Grañcké porovnanie Ct hodnôt z MAGE-A plazmidov s použitlm 20, 2. 0,2. 0,02 pg DNA. Obrázok 18 Grafické porovnanie Delta Ct hodnôt vo vzťahu k MAGE-A 3 pre ostatné MAGE-A plazmidy, s použitlm 20,2. 0,2 0.02 pg DNA.Obrázok 19 Linearita FFPE xenoštepovej GERL RNA - 2- nasobné seriálne riedenia zo 100 až 0,1 ng RNA Inputu.Obrázok 20 znázorňuje graf log (základ 2) RNA inputu versus Delta Ct medzi MAGE-A 3 a B-aktlnom.Tabuľka 1 Oligonukleotidové primery používané na semikvantitatívnu MAGE RT-PCR. Tabuľka 2 Oligonukleotidové primery používané na TaqMan kvantitatlvnu RT-PCR. Tabulka 3 Porovnanie MAGE-A 3 semikvantitatlvnej PCR a kvantitativnej TaqMan PCR. Tabulka 4 Porovnanie Ct a Delta Ct hodnôt s použitím PCR zmesi 1 a PCR zmesi 2.Tabuľka 5 Oligonukleotidove primery použité na MGB TaqMan kvantitetívnu RT-PCR zo zmrazeného tkaniva.Tabuľka 6 Triedy semi-kvantitatlvnej MAGE-A 3 RT-PCR priklad ako môže byť päť tried priradených semi-kvantitatívnemu MAGE-A 3 RT-PCR testu (s odvolaním sa na obrázok 16).Tabulka 7 Sekvencie COBAS TaqMan MAG E-A 3 primerov a sondy.Tabuľka 8 Sekvencie COBAS TaqMan B-aktlnových primerov a sondy.Tabuľka 9 Validný CT rozsah COBAS TaqMan vzoriek 8. kontrol.Tabuľka 10 Proñl COBAS Taqman termálnych cyklov - PCR termálny profil pre experiment s MAGE-A 3 exkluzivitou.Tabuľka 11 RT-PGR termálny proñl pre Iinearitu a RT-PCR účinnost. experimenty s analytickou citlivosľou (detekčný limit), koreláciou metódy a reprodukovateInostou.Tabulka 13 Delta Ct hodnoty vo vzťahu k MAGE-A 3 pre ostatné MAGE-A plazmidy, s použitím 20, 2, 0,2 0.02 pg DNA.Tabuľka 23 Miera Ct zásahov pre MAGE-A 3, N 24 pre každý stav.-3 Tabuna 24 Percentuálna miera Ct zásahov pre MAGE-A 3, N 24 pre každý stav.Tabuľka 25 Miera Ct zásahov pre B-aktín, N 24 pre každý stav.Tabulka 26 Percentuálna miera Ct zásahov pre (l-aktín, N 24 pre každý stav.Tabuľka 27 MAGE génové FAM kontrolné Cts.Tabulka 322 Zhmutie krížovej validácie vzoriek.Tabuľka 33 COBAS a prototypové testy, pozitívne a negatívne, podľa porovnania percenta zhody. Tabulka 34 COBAS prototypové testy, pozitivne a negatívne, podľa porovnania percenta zhody, so zrnrazeným testom, aby sa vyriešili nesúhlasné výsledky.Tabuľka 35 Experimentálne kontrolné MAGE génové Cts.Tabulka 41 1. kolo - MAGE-A 3 expresný signál pre vzorky na prieskum reprodukovatelnosti. Tabulka 422 2. kolo - Prah MAGE-A 3 expresie z GERL RNA kontrol.Tabulka 432 2. kolo - MAGE-A 3 expresný signál pre vzorky na prieskum reprodukovateľností. Tabuľka 44 Validácia reprodukovateľnosti.SEQ ID N 021 - MAGE 3-E 2 F (primer pre semikvantitatlvny MAGE 3 test) (tabuľka 1).SEQ ID N 022 - MAGE 3 ~E 3 R (primer pre semikvantitatlvny MAGE 3 test) (tabulka 1).SEQ lD N 024 - E 3 MAGE 3 TMR (reverzný primer pre 3. exón MAGE-AS) tento primerje reverzným doplnkom MAGE-A 3 exónovej sekvencia. ktorú rozoznáva) (tabulka 2).SEQ ID N 026 - 13 MAGE 3 TMR (reverzný primer pre 3. lntrón MAGE-AB) tento primer je reverzným doplnkom MAGE-A 3 intrónovej sekvencia, ktoni rozoznáva) (tabulka 2).SEQ lD N 028 - MAGEA 3-849 R (reverzný primer pre MAGE-A 3 tento primerje reverzným doplnkom MAGEA 3 sekvencia, ktorú rozoznáva) (tabulka 5).SEQ ID N 0210 - MAGEA 3 e-1037 R (reverzný primer pre MAGE-A 3 tento primerje reverzným doplnkom MAGE-A 3 sekvencie. ktorú rozoznáva) (tabulka 5).SEQ lD N 0212 - MAGEA 3 f-697 R (reverzný primer pre MAGE-A 3 tento primer je reverzným doplnkom MAGEA 3 sekvencia, ktorú rozoznáva) (tabulka 5).SEQ ID N 0235 - nukleotidová sekvencia fúzovaného proteínu z fragmentu lipoprotelnu D. MAGE 3 fragmentu a histidínového chvosta (obrázok 9).SEQ ID N 0237 - aminokyselinová sekvencia fúzovaného proteínu z NS 1, MAGE 3 a histidlnového chvostaSEQ ID N 039 - aminokyselinová sekvencia fúzovaného proteínu z CLYTA, MAGE 3 a histidinového chvosta (obrázok 12).SEQ lD N 0240 - nukleotidová sekvencia kódujúca fúzovaný protein z CLYTA, MAGE 3 a histidlnového chvosta (obrázok 13).SEQ ID NO 52 - MAGE-AG fragment (obrázok 15).SEQ lD NO 53 - sekvencia MAGE-A 3 syntetickej sondy MAGEA 3 F-646 MOD (tabulka 7). SEQ ID NO 54 - sekvencia MAGEA 3 F-646 MOD sondy s nemodiñkovanými nukleotidmi. SEQ ID N 0255 - sekvencia js-aktínového prímera RGI BACT F 2 (tabuľka 8).SEQ ID N 0256 - sekvencia B-aktínového primera RGI BACT R 2 (tabuľka 8).SEQ lD N 0257 - sekvencia B-aktinovej sondy HW RGIBACT H (tabulka 8).0010 Pôvodcovia predloženého vynálezu vyvinuli test na identifikáciu pacientov s nádorovým tkanivom exprimujúcim MAGE-AS, ktorí by tak mohli využívat výhody MAGE-A 3 špeciñckej imunoterapie. 0011 Vjednom uskutočneníje poskytnutá sada primerov, ktorá pozostáva z nasledujúceho páru primerov0012 V ďalšom aspekte predloženého vynálezu je poskytnutá sonda pozostávajúca z nukleotidovej sekvencie, ktorou je SEQ ID N 0 17, s fluorescenćnou reporterovou farbičkou na 5 konci a nefluorescenčnou zastavovacou látkou na 3 konci, alebo SEQ lD N 0253.0013 Ďalšie uskutočnenie poskytuje kit, ktorý zahŕňa(i) primer pozostávajúci zo SEQ ID N 0211(ii) primer pozostávajúci zo SEQ ID N 0212 a(iii) sondu pozostávajúcu so SEQ ID N 0217, ktorá má ô-karboxyfluorescenčnú látku na 5 konci a nefluorescenčnú zastavovaciu látku na 3 konci.0014 V ďalšom uskutočnení je poskytnutý kit, ktorý zahŕňa (1) primer pozostávajúci zo SEQ lD 11 primer pozostávajúci zo SEQ ID NO 12, a sondu pozostavajúcu zo SEQ ID NO 53.0015 Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje sposob stanovovania prítomnosti alebo neprítomnosti MAGE-A 3 v nádorovom tkanive ñxovanom vo formalíne a obalenom v paraflne (FFPE). ktorý zahŕňa krok uvedenia izolovanej nukleotidovej sekvencie získanej alebo izolovanej z FFPE nádorovej tkanivovej vzorky, so sadou primerov, ktorá pozostáva zo SEQ lD N 0211 a SEQ ID N 0212, a so sondou podľa nároku 2.0016 Ďalší aspekt poskytuje spôsob diagnostikovania pacienta, ktorý zahŕňa krok uvedenia izolovanej nukleotidovej sekvencie získanej alebo izolovanej z PFFE nádorovej tkanivovej vzorky do kontaktu so sadou primerov pozostávajúcou zo SEQ lD N 0211 a SEQ ID NO 12, a so sondou podľa nároku 2, a vyhodnotenie. či sa v danej vzorke exprimuje MAGE-A 3.0017 Tento spôsob môže zahŕňať aj krok amplitikácie nukleotidovej sekvencie a detekcie tejto ampliñkovanej nukleotidovej sekvencie vo vzorke.0018 Tento spôsob môže zahŕňať aj krok stanovovania, či ízolovaná nukleotidová sekvencia hybridizuje s primerom alebo so sondou v prísnych podmienkach, a tým detekovanie, či je nádorové tkanivo MAGE-AS pozitívne. V jednom uskutočnení môže tento spôsob zahŕňať aj krok používania in silu hybridizácie, aby sa detegovalo, či nukleotidová sekvencia hybridizuje aspoň s jedným primerom alebo sondou.0019 Tak ako sa používa tu, výraz cieľová sekvencia označuje určitú oblast MAGE-A 3 nukelokyselinovej sekvencie (bud DNA, alebo RNA, napr. genomickej DNA, mesendžerovej RNA alebo ich ampliñkovaných verzií), s ktorou sa sonda alebo primer čiastočne (tzn. s určitým stupňom nespárovania) alebo úplne zhodujú. Hoci reverzný primer je opačným doplnkom (alebo, ako bolo uvedené vyššie, s určitým stupňom nespárovania) sekvencie, ktorú rozoznáva. Cieľová sekvencia vo všeobecnosti označuje určitú oblast MAGE-A 3 sekvencie,ktorá sa aspoň v jednom nukleotide líši od inej alebo od všetkých ostatných MAGE-A nukleotídových sekvencil. V niektorých uskutočneníach predloženého vynálezu však cieľová sekvencia može byt, pre jeden alebo viacero primerov a sondu, identická v rámci MAGE-A nukleotídových sekvencií, za predpokladu, že najmenej jeden alebo dva z primerov a sondy, ktoré sa majú použiť, rozoznávajú cieľovú sekvenciu, ktorá sa líši v jednotlivých génoch, ktoré sa majú rozlíšiť.0020 Takže v jednom uskutočnení by sa špecifický primer alebo sonda viazali na cieľovú MAGE-A 3 sekvencíu bez nespárovaných báz a viazali by sa na ekvivalentnú oblasť dalsej MAGE-A sekvencie, napríklad sekvencie MAGE-G, s nespárovanim jednej alebo viacerých bàzových párov.

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/68

Značky: mage-a3, detekciu, zahŕňajúce, rakoviny, detekcie, markera, spôsoby, sondy, primery, špecifickú, diagnostiky

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/74-e12671-sposoby-detekcie-a-diagnostiky-rakoviny-zahrnajuce-primery-a-sondy-na-specificku-detekciu-markera-mage-a3.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsoby detekcie a diagnostiky rakoviny zahŕňajúce primery a sondy na špecifickú detekciu markera MAGE-A3</a>

Podobne patenty