Chimerická DNA plymeráza fágu fí 29

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Chimerická DNA polymeráza fágu fí 290001 Predložený vynález spadá do oblasti biotechnológie. Najmä sa týka chimérickej DNA polymerázy obsahujúcej aminoterminálnu(N-terminálnu) oblasť kódujúcu DNA polymerázu typu 29 a karboxylterminálnu (C-terminálnu) oblasť obsahujúcu najmenej jednu HhH doménu, ktoré sú viazané pomocou spájajúcej aminokyselinovej sekvencie jej použitia na replikáciu,amplifikáciu alebo sekvencovanie templátovej DNA. Predložený vynález sa tiež týka spôsobu replikácie, amplifikácie alebo sekvencovania deoxyribonukleovej kyseliny s uvedenou chimérouDNA polymerázy a súpravy na vykonávanie tohto spôsobu.0002 Jediný enzým požadovaný bakteriofágom 29 na replikáciu jeho genómu je jeho DNA polymeráza, 66 KDa monomérny proteín schopný katalyzovať iniciáciu replikácie aj predlžovaniesyntetizovaného vlákna. Na iniciáciu sa táto polymeráza viažek proteínu známemu ako terminál (TP), rozpoznáva koniec 29 DNA a katalyzuje tvorbu TP-dAMP kovalentného komplexu. Po polymerizácii 10 nukleotidov, DNApolymeráza/TP heterodimér sa rozpadá a uskutočňuje sa predlžovanie vlákna pochádzajúceho0003 Replikačné DNA polymerázy vyžadujú interakciu s doplnkovými proteínmi, ktoré stabilizujú viazanie medzi enzýmom a touto DNA (Kuriyan and ODonnell. J Mol Biol. 1993 234 915-925). Na druhej strane uvedené DNA polymerázy potrebujú spojiť polymerizáciu s oddelením vlákna DNA, ktoré nie je kopírované, pre ktorú sa požaduje ich funkčné spojeniek proteínom helikázového typu. V tomto zmysle DNA polymerázabakteriofágu 29 má rôzne vnútorné funkčné charakteristiky, ktoréa) vysoká procesivita (definovaná ako počet nukleotidov zavedených väzbovou udalosťou).b) Vysoká kapacita na oddelenie vlákna, ktorá dovoľuje replikáciu genómu uvedeného bakteriofágu V neprítomnosti doplnkových proteínov helikázového typu. Tieto dvecharakteristiky, procesivita a odpojenie vlákna umožňujú, aby ó 29 DNA polymeráza bola schopná syntetizovať DNA vlákna s dĺžkou viac ako 70 kb (Blanco a kol. J Biol Chem. 1989 264 8935-8940).c) Vysoká presnosť inzercie nukleotidov v novom vlákne0004 Všetky tieto charakteristiky viedli k vývoju širokej rozmanitosti izotermických procesných (pri konštantnej teplote) protokolov na amplifikáciu dvojvláknovej DNA (dsDNA) založenýchna použití týchto polymeráz. V jednoduchom usporiadaní kapacita29 DNA polymerázy použiť kruhovú jednovláknovú DNA (ssDNA) dovoľuje amplifikáciu DNA metódou rolling circle (alebo amplifikácia RCA - rolling circle), za produkcie ssDNA molekúl s veľkou dĺžkou a obsahujúcich viac ako 10 kópií kruhového templátu (Blanco a kol. J Biol Chem. 1989 264 8935- 8940 US 5001050, US 5 l 98543 and US 5576204). V spôsobe na amplifikáciu dsDNA vyvinutom Amersham Biosciences/Molecular Staging (Dean akol. Genome Res. 2001 11 1095- 1099 Dean a kol. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 99 5261- 5266) kombinácia použitia 29 DNA polymerázy s použitím primérov hexamérových (hexa-nukleotidov) náhodných sekvenčných primérov dovoľuje získanie faktorov amplifikácie 104 až 10 ° začínajúcej zpikogramov kruhovej plazmidovej DNA Templiphi od GE Healthcare alebo 10nanogramov genómovej DNA Genomiphim od GE Healthcare aRepli-G®od Qiagen. Produkované výrobky sú vysokej kvality a môžu byť štiepené alebo sekvencované priamo bez potreby purifikácie demonštrovalo sa, že 29 DNA polymeráza je najrobustnejšímenzýmom na tento účel. Bežný pufor na uskutočnenieamplifikačných reakcií s 29 DNA polymerázou obsahuje tris-HCl(pH 7,5) plus rôzne koncentrácie hr milimolárnonl ráde) NaCl alebo KC 1 a MgCl 2 (US 20030207267). Avšak napriek prijateľnosti týchto protokolov vo veľmi rozdielnych situáciách, je rastúca potreba na vývoj protokolov V iných situáciách, ktorá dovoľuje0005 Motívy HhH (he 1 ix-spona-helix) viažu DNA bez ohľadu na svoju sekvenciu a zistili sa V rôznych DNA polymerázach,ligázach a glykozylázach (Shao and Grishin. Nucleic Acids Res. 2000 28 2643- 2650 Doherty a kol. Nucleic Acids Res. 1996 242488- 2497). Tieto motívy obsahujú pár anti-paralelných ahelixov spojených slučkou typu spona. Druhý u~helix nevyčnieva zo štruktúry a preto na rozdiel od iných DNA väzbových motívov, nemôže byť vložený do hlavného žliabka DNA. Kryštalografickéslučku medzi dvomi a-helixami. Táto slučka je zahrnutá vo vytváraní nešpecifických interakcií s DNA a normálne obsahuje konsenzus sekvenciu GhG, kde h je hydrofóbny zvyšok normálne I,V alebo L. Vyriešenie kryštalografických štruktúr navrhuje, že interakcie sú vytvorené medzi dusíkom polypeptidového vlákna a kyslíkom fosfátov DNA. Navyše polárne aminokyseliny, ktoré by mohli vytvoriť dodatočné interakcie s fosfátovými skupinami,majú tendenciu existovať V polohách 2 a 3 vzhľadom na druhé G.Posledná G konsenzus sekvencia tvorí N-terminálnu časť druhého a-helixu a hydrofóbny zvyšok h prispieva k interakciám medzidvomi a-helixami tohto motívu. Dva a-helixy sú zabalené a tvoria uhol 25 až 50 ° medzi nimi navzájom a určujúcharakteristický hydrofóbny vzor v sekvenciách. Motívy HhHvšeobecne tvoria časť hlavných štruktúr známych ako (HhH)2tvorených dvomi HhH motívmi viazanými a-helixom a tvoria zrkadlovú symetriu vzhľadom na to, že DNA uľahčuje jej stabilné viazanie (Shao and Grishin. Nucleic Acids Res. 2000 28 26432650 Doherty a kol. Nucleic Acids Res. 1996 24 2488- 2497 Thayer a kol. EMBO J. 1995 14 4108- 4120).0006 Tvorba chimér medzi DNA polymerázami stabilnými za tepla ako je Taq a Pfu a nešpecifickými DNA väzbovými motívmi sa predtým používala na zvyšovanie DNA Väzbovej kapacity uvedených polymeráz. (Pavlov a kol. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 99 13510-13515 WO 2004013279 Wang a kol. Nucleic Acids Res. 2004 32 1197-1207).0007 Kryštalografické vyriešenie štruktúry 029 DNA polymerázy poskytlo molekulárne bázy zodpovedné za procesívnu polymerizáciu spojenú s oddelením vlákna, špecifickú charakteristiku tohto enzýmu (Kamtekar a kol. 2006 EMBO J 25 1335-1343).0008 Porovnávacia analýza s inými DNA polymerázami eukaryotického typu (rodina B) ukazuje podobné všeobecné skladanie C-terminálna polymerizačná doména tvorená(thumb) a tvoriaca kanál, cez ktorý je viazaná DNA a 3-5 Nterminálna exonukleázová doména zodpovedná za odstránenie nukleotidov omylom zavedených počas polymerizácie. Hlavnýštrukturálny rozdiel medzi DNA polymerázami známej štruktúry a fágu 29 je prítomnosť vo fágu dvoch dodatočných subdomén v jeho polymerizačnej doméne, zodpovedných za inzercie konzervovanej sekvencie v podskupine DNA polymeráz použitím proteínu nazvaného TPR 1 a TPR 2 ako priméru. Subdoména TPR 1 jeumiestnená blízko dlane a kontaktuje sa s DNA duplexom.Subdoména TPR 2 s B-sponovými štruktúrnymi formami tvorí blízko

MPK / Značky

MPK: C12N 9/12, C12Q 1/68

Značky: plymeráza, fágu, chimérická

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/70-e15529-chimericka-dna-plymeraza-fagu-fi-29.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Chimerická DNA plymeráza fágu fí 29</a>

Podobne patenty