Spôsob čistenia serínových proteáz použitím rekombinantného inhibítora z Erythrina caffra

Číslo patentu: 282430

Dátum: 28.12.2001

Autori: Stern Anne, Kohnert Ulrich, Fischer Stephan

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob čistenia serínových proteáz zo zmesi proteínov založený na viazaní serínovej proteázy na imobilizovaný polypeptid, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, odstránení neviazaných podielov zo zmesi proteínov, oddelení serínovej proteázy od inhibítora, separácií imobilizovaného inhibítora od rozpustnej serínovej proteázy a izolácií serínovej proteázy, a ktorého podstata spočíva v tom, že sa ako polypeptid použije polypeptid, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie exogénnej nukleovej kyseliny a je vyčistený chromatograficky cez anex, katex alebo stĺpec chelátu niklu. Tento inhibítor má zlepšenú špecifickú aktivitu a je vhodný najmä na čistenie aktivátorov plazminogénu ako tkanivových aktivátorov plazminogénu t-PA a jeho derivátov.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka zlepšeného spôsobu čistenia serínových proteáz použitím rekombinantnćho inhibítora DE-3 z Erythrina cąfra.lmobilizované inhibítory trypsinu z Erythrina (ETI) sú účinnýmí činidlami na atinimé chromatografickć čistenie serínových proteáz, najmä aktivátorov plazminogénu (C. Heussen, J. Biol. Chem. 259 (1934) 11635 - 11638), B-trypsínu, a-chymotrypsínu a trombinu (S. Onesti et al., J . Mol. Recogn. 5 (1992) 105 - 114). Tieto inhibítory trypsínu sú známe dlho (C. Heussen, Haemostasis ll (1982) P 47inhibítor DE-3 z E. cajýira je vhodný výhodne najmä na čistenie afinítnou chromatografiou aktivátorov plazminogénu (F. J. Joubert in Thrombosis and Haemostasis 57(1987) 356 - 360). V tejto publikáciije opísaná aj kompletná Sekvencia aminokyseliny tohto inhibítora. DE-3 sa môže izolovať zo semíen E. caffra a čistiť (F. J. Joubert, Int. J. Biochem. 14 (1982) 187 - 193).Teixeirom et al., Biochimica et Biophysica Acta 1217(1994) 16 - 22 je opísaný rekombinantný ETI, ktorého špecifická inhibičná aktivita pre tkanivo aktivátor plazminogénu je približne l,7.109 U/mmol. špecifická inhibičná aktivita prirodzeného ETl je oproti tomu priblibie 1,94.l 09 U/mmol. To platí analogicky pre inhibičnú aktivitu proti trypsínu (2,63.10) (3,21.1 o). Tým je špecifická inhibičná aktivita rekombinantného ETI, vyrobeného podľa Teixeira, pre trypsín a tkanivový aktivátor plazminogénu menšia o 20 ako aktivita prirodzeného ETI.Rekombinant ETI sa podľa Teixeira získava a čistí zrážaním síranu amónneho 80 sýtenie, dialýzou proti vode a štiepením kyanobromidu, pričom N-terminálne sekvencie sa odštiepia vrátane metionínu. Nakoniec sa uskutoční stĺpcová afinitnà Chromatografia (Sephadex 100).Úlohou vynálezu je zlepšenie účinnosti spôsobu čistenia serínových proteáz použitím ETI.Predmetom vynálezu je spôsob čistenia serínových proteáz zo zmesi proteínov viazaním serínovej proteázy na imobilizovaný polypeptid, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina cajfra, odstránením neviazaných podielov zo zmesi proteínov, oddelením serínovej proteázy od inhibítora, separáciou imobilizovaného inhibítora od rozpustnej serínovej proteázy a izoláciou serínovej proteázy,ktorého podstata spočíva v tom, že sa ako polypeptid použije polypeptid, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie exogénnej nukleovej kyseliny (výhodne DNA) a čistí sa chromatograficky cez anex, katex alebo cez stĺpec chelátu s niklom.S prekvapením sa zistilo, že rekombinantný polypeptid vyrobený podľa vynálezu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrína cafŕa, má V protiklade k inhibítora DE-3, izolovanému z prírodných zdrojov z E. cajra, značne väčšiu špecifickú aktivitu proti serínovým proteázam.Pod pojmom aktivita inhibítora DE-3 z E. caýa sa v podstate rozumie špecifická inhibičná aktivita pre serínove proteázy, najmä pre tkanivovć aktivátory palzminogénu.Špecifické inhibičná aktivita inhibítora je pritom približne 1,07 U/mg alebo vyššia oproti trypsínu. Inhibícia sa uskutočňuje pomocou väzby medzi inhibítorom a serínovou proteázou.Spôsob podľa vynálezu je vhodný najmä výhodne na čistenie aktivátorov plazminogénu, ako napríklad tkanivových aktivátorov plazminogénu (t-PA) a ich derivátov (napríklad mutáciou a deléciou), vhodné t-PA a deriváty sú opísanć napríklad v EP-B 0 093 619, USP 5,223 256,W 0 90/09437 a T. J. R. Harrisom, Protein Engeneeríng 1Výroba rekombinantného inhibítora sa môže uskutočňovať pomocou metód, ktoré sú odborníkovi bežne známe.Na tieto účely sa najskôr vyrobí nukleová kyselina (výhodne DNA), ktorá je schopná produkovať proteín, ktorý má alctivitu inhibítora DE-3. DNA sa klonuje na Vektor,ktorý sa môže transferovať do hostiteľskej bunky a tam replikovať. Takýto Vektor obsahuje prfdavne k sekvencii inhibítora prvky operátora, ktoré sú nevyhnutné na expresiu DNA. Tento vektor, ktorý obsahuje inhibítor DNA a prvky operátora, sa transferuje do vektora, ktorý je schopný exprimovať DNA inhibítora.Hostiteľská bunka sa získava z týchto buniek. Pritom sa pomocou vhodných opatrení zabezpečí, aby aktivátor mohol zaujať aktívnu terciámu štruktúru, v ktorej prejavuje vlastnosti inhibítora.Pritom nie je nutné, aby inhibítor mal exaktnú sekvenciu aminokyseliny zodpovedajúcu SEQ ID N 012. Rovnako sú vhodné inhibítory, ktore majú v podstate rovnakú sekvenciu, a polypeptidy s aktivitou (schopnosťou viazať sa na serínové proteázy, najmä na t-PA) inhibítora z DE-3 z Erythrina cajra. Ukázalo sa, že je výhodná 80 až 90 zhoda sekvencie aminokyseliny. Sekvencia aminokyseliny SEQ ID N 022 sa používa však výhodne, pričom v prípade expresie do prokaryotických hostiteľských buniek, ale nie po eukaryotickej expresíi, je obsiahnutý N-tenninálny metionín.Ďalším predmetom vynálezu je nukleová kyselina, ktorá je v podstate identická s nukleotidmi 9 až 527 SEQ ID N 0 l aje kódovaná pre polypeptidy s aktivitou inhibítora DE-3 z Erylhrina cajfra, alebo nukleová kyselina, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid. Výhodnáje DNA, najmä DNA sekvencia 9 až 527 SEQ ID NOzl. Na expresiu v eukaryotických alebo polykaryotických hostiteľských bunkách obsahuje nukleová kyselina na 5-konci eukaryotické alebo prokaryotické translačné a transkripčné signály, ktoré sú pre odbomíka bežné.Sekvencia nukleovej kyseliny inhibítora je výhodne identická s nukleotidmi 9 až 527 SEQ ID N 011. Samozrejme je možnć na uľahčenie výroby vektorov alebo na optimalizáciu expresie vytvoriť modifikácie. Takými modifikáciami sú napríkladzmena nukleovej kyseliny, aby sa zaviedli rôzne identifikačné sekvencie reštrikčných enzýmov na uľahčenie krokov ligácie, klonovania a mutagenézy, zmena nukleovej kyseliny na zabudovanie výhodného kodónu pre hostiteľskú bunku, doplnenie nukleovej kyseliny o dodatočne prvky operátora, aby sa optimalizovala expresia v hostiteľskej bunke, Expresia inhibítora sa uskutočňuje výhodne v mikroorganizmoch, ako je E. coli. Expresia v eukaryotických bunkách, ako napríklad v kvasinkáeh, bunkách CHO alebo bankách hmyzuje tiež možná.Na to sa používajú biologicky funkčné plazmidy alebo vírusové vektory DNA, ktore v podstate obsahujú nukleotidy 9 až 527 SEQ ID NO 1, alebo obsahujú nukleovú kyse SK 282430 B 6linu, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid. Takými vektonni sa stabilne transfonnujú alebo transferujú prokaryoticke alebo eukaryotické hostiteľskć bunky.Expresívne vektory musia obsahovať promótor, ktorý umožní expresiu proteínu inhibítora v hostiteľskom organizme. Takéto promótory sú odbomíkom známe a sú to napriklad lacpromótor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp (Goedded et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057),ÄPL-promótor (Shimatake et al., Náture 292 (1981) 128) a T 5-promótor (US patent č. 4 689 4067). Vhodne sú aj syntetické promótory, ako napriklad tae-promótor (US patent č. 4 551 433). Vhodne sú tiež kopulovanć systémy promótorov, ako napríklad T 7-RNA-polymeráza/promótor systém(Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Tiež sú vhodné aj hybridné promótory z promótora bakteriofágov a regiónu operátora mikroorganimu (EP-A 0267 851). Dodatočne k promótom je nevyhnutné účinne miesto väzby ribozómov. Pre E. coli sa toto miesto väzby ribozómov označuje ako Shine-Dalgarno-/SD/-sekvencia (Shine et al.,Nature (1975) 25434 J. Samhrook et al., Expression of cloned genes in E. coli in Molecular Cloning A laboratory manuál (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,(USA).Na zlepšenie expresie je možné exprimovať proteín inhibítora ako fúzny proteín. V tomto prípade sa obvykle fúzuje DNA, ktorá je kódovaná pre N-tenninálnu časť endogénneho bakteriálneho proteínu alebo iného stabilného proteínu. Na S-konci sekvencie kódovanej pre proteín inhibítora. Príklady pre to sú 1 acZ, trpE.Po expresii sa fúzrte proteíny výhodne štiepía enzýmami, napríklad faktorom Xa (Nagal et al., Nature 309 (1984) 810). Dalšlmi príkladmi miest štiepenia sú štiepne miesto lgA-proteázy (W 0 91/11520) a štiepne miesto ubiquitinuRekombinantný proteín, získaný najskôr ako inaktívny inclusic bodies sa môže premeniť na rozpustný aktívny proteín spôsobmi, ktoré sú pre odbomíka bežné. Na to sa inclusion bodies redukuje napríklad rozpustený s hydrochloridom guanidlnu alebo močovinou v prítomnosti redukčnćho činidla, redukčné čínidlo sa odstráni napríklad dialýzou a výhodne sa renaturuje použitím redoxného systému, ako napríklad redukovanćho alebo oxidovaného glutatiónu.Takéto metódy sú opísanć napríklad v US patente 4 933 434, EP-B 0 241 022 a EP-A 0 219 874.Tiež je možné sekrćtovat proteíny ako aktívne proteíny z mikroorganizmov. Na to sa používa výhodne fúzny proteín, ktorý sa skladá zo signálnej sekvencie, ktorá je vhodná na sekrćciu proteínov v použitých hostiteľských milqoorganizmoch (US patent č. 4 336 3367, a nukleovej kyseliny,ktorá je kódovaná pre proteín inhibítora Protein sa pritom sekretuje bud do média (u giampozitívnych baktérií), alebo do periplazmatického priestoru (u gramnegatívnych baktérií). Medzi sekvenciou signálu a sekvenciou kódovanou pre inhibítor je výhodne štiepne miesto, ktoré umožní odštiepiť proteín inhibítora buď pri procese, alebo pri pridavnom kroku. Takýmito signálnymi sekvenciami sú napríklad ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984), 2437), a phoAĎalej obsahujú vektory ešte tenninátory. Terminátory sú sekvencie DNA, ktoré signalizujú koniec transkripčnćho pochodu. Vyznačujú sa zvyčajne dvomi štruktúmymi zvláštnosťami obrátene repetitívnym G/C-bohatým regiónom, ktorý môže tvoriť intramolekulovo dvojitú skrutkovicu, ako aj počtom U/, prípadne T/zvyškov. Príklady sú trpDodatočne obsahujú expresívne vektory zvyčajne selektovateľný marker na selektovanie transformovaných buniek. Takými selektovateľnými markermi sú napríklad rezistentné gény pre ampicilín, chloramfenikol, kanamycín,neomycín a tetracyklín (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Vhodnými selektívnymi markermi sú aj gény pre esenciálne látky biosyntezy látok nevyhnutných pre bunku, ako napríklad histidín, tryptofán a leucín.Je známy celý rad vhodných bakteriálnych vektorov. Vektory boli opísané napríklad pre nasledujúce baktérie Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183,Studíer et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ, Microbial. 54 (1988) 655), Streptococcus lívidans a Streptomyces livídans (US patent č. 4 747 056).Expresia proteínu inhibítora je možná okrem v prokaryotických mikroorgariizmoch aj v eukaryotoch (ako napríklad CHO bunkách, kvasinkách alebo bunkách hmyzu). Ako eukaiyotický system sú výhodné bunky kvasiniek a bunky hmyzu. Expresia v bunkách sa môže uskutočňovať cez tri druhy vektorov kvasiniek (intejgrujúce Ylp) yeast integrating plazmidovć /vektory replíkujúce YRp (yeast replicon plazmidovć) vektory a epizomalne YEp/yeast episomal plazmidové/vektory. Podrobnosti k tomu sú opísanć napríklad v S. M. Kingsman et al., Tibtech 5 (1987) 53 - 57.Ďalšie genotechnologické spôsoby výroby a expresie vhodných vektorov sú opísanć v J. Sambrook et al., Expresion of cloned genes in E. coli v Molecular Cloning A laboratory manuál (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.Po výrobe nasleduje čistenie rekombinanmćho ETI chromatograñcky alebo anexom, napriklad cez stlpec Q-sepharosyn, katex (napríklad na báze sulfopropylu) alebo cez stĺpec chelátu niklu, ako je to opísané napríklad v Porsth, J.a. Olin, B. Biochemístry 22 (1983), 1621 - 1630. S prekvapením sa týmto spôsobom čistenia získa rekombinantný ETl, ktorého inhibičnâ aktivita oproti serínovým proteázam, ako napríklad trypsínu a tkanivovému aktivátoru plazminogénu je podstatne vyššia ako inhibičná aktivita prirodzeného ETI.Takto vyrobený a vyčistený polypeptid má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina cajjřa a dá sa ziskat kultiváciou prokaryotických alebo eukaryotíckýeh hostiteľských buniek, ktoré sú transfonnovane alebo transfekovane exogćnnou nukleovou kyselinou (výhodne DNA), ktorá zodpovedá v podstate sekvencii nukleotidu 9 až 527 SEQ ID NO 1,alebo nukleovou kyselinou, ktorá je V rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid, spôsobom, ktorý umohií hostiteľským bunkám exprimovať za vhodných podmienok živín polypeptid a izoláciu žiadanćho polypeptidu, ktorý má špecifickú aktivitu inhibítora asi 1,07 U/mg alebo vyššiu (výhodne 1,07 až 1,8 U/mg) proti trypsínu. Pri rôznych šaržiach rekombinantnćho ET 1 bola ako špecifická nájdené aktivita napríklad 1,2 1,5 a. 1,6 U/mg. Táto aktivita sa získa po chramatogratickorn čisteni na anexe, katexe alebo na stĺpci chelátu niklu.Ďalším predmetom vynálezu je spôsob výroby rekombinantnćho polypeptidu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erjythrina cajra (ETI), kultiváciou prokaryotických alebo eukaryotíckýeh hostiteľských buniek, ktoré sú transformované alebo transfekovanć exogćnnou nukleovou kyselinou(výhodne DNA), ktorá v podstate zodpovedá sekvencii nukleotidov 9 - 527 SEQ ID NO 1, alebo nukleovou kyse SK 282430 B 6linou, ktoráje v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid, spôsobom, ktorý umožní hostiteľským bunkám, aby exprímovali za vhodných podmienok živín polypeptid, izoláciu polypeptidu z hostiteľských buniek a chromatograñcke čistenie na anexe, katexe alebo na stĺpci chelátu niklu.Čistenie serínových proteáz použitím rekombinantnćho ETI sa uskutočňuje spôsobmi, ktoré sú pre odbomíka bežne(porov. napríklad F. J. Joubert (1987. Na to sa ETI viaže kovalentne na matrícu (napriklad stĺpec CNBr-sephamsy) a zmes proteínov, ktorá obsahuje serínovú proteázu, sa vnesie za neutrálnych alebo mieme alkalických podmienok na stĺpec a uskutoční sa Chromatografia Elúcia sa uskutočňuje znížením pH pH 5,5 alebo použitím tlmivých roztokov,ktoré obsahujú chaotropné činidlá ako napríklad KSCN. Čistota proteínu v eluáte je väčšia ako 95 vzhľadom na serínovú proteázu. Na ďalšie použitie sa serínová proteáza výhodne prevedie dialýzou do teraz žiadaného tlmivého roztoku.Imobilizácia inhibítora všetky ďalšie kroky spôsobu čistenia serínovej proteázy a t-PA sa môžu uskutočňovať analogickým spôsobom ako pre inhibítor DE-3, ízolovaný z E. cajjí-a. Takéto spôsoby sú uvedené napríklad v EP-B 0 218 479, EP-B 0 112 122, USP 4 902 623. Imobilizàcia sa výhodne uskutočňuje na inertnom nosiči, výhodne naNasledujúce príklady a protokoly sekvencií ďalej opisujú vynález.S použitím výhodnćho kodónu z E. coli sa zo sekvencie aminokyseliny z ETI z Erythrína cajra (Joubert und Dowdle, Trombosis and Haetnostasis 57 (3) (1987) 356 - 360) odvodila zodpovedajúca sekvencia nukleovej kyseliny a zosyntetizovala metódou Beattie a Lowler (Nature 352(1991) 548 - 549). Aby sa uľahčilo klonovanie, zaviedlo sa na 5-koniec miesto rezu pre reštrikčný enzým EcoRI a na 3-koniec miesto rezu pre reštrikčný enzým HindIII. Nukleová kyselina, vyrobená syntézou, sa reštringovala enzýmami EcoRI a Hindlll a ligovala klonovaeím vektorom pBS (Stratagene, US, Catalogue No. 211201, Derivàt des Phagen íl und Stratagenďs pBS Plasmid mít T 3, und T 7 Promotor-Gen, Ampicillin-Resístanz-Gen, íl origin, CoIE-l origin, lad Gen, LacZ Gen und einer Multiple Cloning Site), ktorý bol predtým tiež strávený EcoRI a Hindlll. Vsádzka ligácie sa transformovala V Ercherichia coli. Získané klony, selektovanć na ampicilínc, sa analyzovali reštrikciou s enzýmami EcoRI a HindIII. Výsledný klon, pBS ETI, obsahuje prídavný fragment EcoRI/Hindlll s veľkosťou 539 bp s SEQ 1 D NOl.Plazmid pBS E 11 bol reštríngovaný reštrikčnými enzýmami EcoRI a Hindlll a 539 bp veľký fragment sa izoloval. Expresívny Vektor pBTacl (Boehringer Mannheim GmbH, Katalóg č. 1081365, na báze pUC 8, H. Haymerle et al., Nucl. Acid Res. 14 (1986) 8615 - 8624) sa tiež strávil enzýmamí EcoRI a Hindlll a izdoval sa približne 4,6 kb veľký fragment vektora. Obidva fragmenty sa ligovali aspolu s Helferovým plazmidom pUB 8520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) (109 - 114), ktorý obsahuje lac-represorový gén) sa transfonnovali do E. volí (DSM 5443). Sclekcia klonov sa uskutočňovala cez ampicilínovú,prípadne kanamycínovú rezistenciu, sprostredkovanú plazeniarni. Získaný plazmíd pBTETI obsahuje v porovnaní s východiskovým vektorom pBTac 1 ďalší EcoRI/Hindlll ü-agment s veľkosťou 539 bp.Analogickým spôsobom sa môže namiesto DSM 5443 používať aj DSM 3689, ktorý už obsahuje 14 plazmíd. V tomto prípade nie je Helferov plaznid pUB 520 nutný.c/ Expresia rekombinantného ETI (res. ETI) v E. coliNa preskúšanie výkonu expresie sa kmeň E. coh DSM 5443 kultívoval s plazmidtni pBTETI a pUB 8520 v LB médiu (Sambrook et al., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor) za prítomnosti ampicilínu a kanamycinu(teraz 50 ug/ml) výslednej koncentrácie až do optickej hustoty (OD) 0,6 pri 550 nm Expresia sa iniciovala pridaním 6 mM IPTG. Kultúra sa inkubovala ďalšie 4 hodiny. Následne nato sa E. coli zhromaždila odstredením a resuspendovala v tlmivom roztoku (50 mM Tris-HC 1, pH 8, 50 mM EDTA) lýza E. COÍÍ sa dosiahla pôsobením zvuku. Novým odstredením sa zhromaždili nerozpustné frakcie proteínov(inclusion bodies) a resuspendovali pôsobením zvuku. Suspenzía sa doplnila 1/4 objemu vsadenćho tlmivého roztoku(250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,01 M EDTA, 5 SDS, 5 merkapto-etanolu, 50 glycerolu a 0,005 brómfenolovej modrej) a analyzovala pomocou 12,5 SDS-polyakrylamidového gélu. Ako kontrola sa uskutočnila preparácia s kultúrou E. coli (pBTE-TI/pUBS 520), ktorá nebola doplnená IPTG a nanosená v polyakrylamidovom góle. V preparácii kultúry indukovanej IPTG sa môže po zafarbení gelu 0,2 Cootnassieovou modrou R 250 (rozpustenou, v 30 metanole a 10 kyseline octovej) a odfarbení gélu v zmesi metanolu a kyseliny octovej, pozorovať výrazný pas s molekulovou hmotnosťou asi 22 kD. Tento pás sa v preparácii neindukovanej E. coli buniek nenachádza.50 g nerozpustnej frakcie proteínov (Inclusion Bodies/IBs) sa rozpúšťalo s 0,1 M Tria-HCl, pH 8,5, 6 M guanidínu, 0,1 M DTE, l mM EDTA (90 minút pri 25 °C,CW 10 mg/ml) a po ustanovení hodnoty pH na 2,5 (HCl) sa dialyzovalo proti 3 mol/l guanidínu/HCl. Dialyzát sa odstredil (SS 34, 13000 ot/m) a koncentrovaním cez YM 10 nastavil na CW, 36,9 mg/ml. Jednolitrová reakčnà nádoba sa naplnila 0,1 M Tris-HC 1, pH 8,5, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0,1 mM GSSG. Renaturáeía sa uskutočňovala pri 20 °C ló-násobným prídavkom dialyzátu (teraz 600 g proteínu/ml tlmivćho roztoku) v časovom odstupe 30 minút.resET 1 sa renaturuje v 0,1 M Tlis/HCl, pH 8,5, l mM EDTA, 1 mM GSH, 0,1 mM GSSG. Renaturát sa zriedi vodou v pomere 1 2, nastaví pomocou HCl na pH 8,0,dialýzuje proti 50 mM Trís/HCl pH 8,0 a nanesie na stlpec ekvilibrovanej Q-Sepharozy (5 mg proteín/ml gélu). Po premytl stĺpca ekvilibračným tlrnivým roztokom a 50 mM Na 2 HPO 4/H 3 PO., pH 8,0 (teraz 5 objemami stĺpca), sa uskutoční elúcia 50 mM/ Na 21-1 PO 4/H 3 PO., pH 8,0, 0,2 M NaCl.Renaturovaný ETI sa nastavil prldavkom HC 1 na pH 4,0 a dialyzoval proti 50 mM NaOAc/HCI, pH 4,0 (Cross Flow). Dialyzát sa odstredil (13 000 ot/m, 30 min. 33 34) a naniesol na TSK-SP-stĺpec ekvilibrovany 50 mM NaOAc/HCI, pH 4,0, (katex s bočnými skupinami sulfopropylu, Merck, Deutschland, objem 15 ml). Po premyti stlpca ekvilibračným tlmivým roztokom a 50 mM NaOAc/HCI, pH 4,0, 0,1 M NaCl, sa uskutoční elúcia 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0, 0,2 M NaCl.Čistota eluátu sa skusala pomocou SDE/PAGE a cez RP-HPLC.ETI sa viaže za použitých podmienok na stĺpec TSK-SP a môže sa eluovať 0,2 M NaCl. Analytika RP-HPLG ukazuje, že čistotu je 95 .Porovnanie špecifickej aktivity resETl zo semien Erythrína cajfrarecETI a ETI, izolovanć zo semien E. cajýia, sa dialyzovali proti 50 mM NaZHPO 4/H 3 PO., pH 8,0, 0,2 M NaCl a nastavili na koncentráciu proteínu 0,8 mg/ml. Koncentrácia proteínu sa určovala meraním UV-absorpcic pri 280 nm.Inhibícia trypsínu ETI sa meria pomocou N-a-benzoylesteru (RAEE) ako substrátu, 40 roztoku trypsínu(0,13 mg/ml 2 mM HCI) sa zmieša v kremennej kyvete so 60 testovacieho tlmíveho roztoku (0,1 M Tris/HCl, pH 8,0) a 100 pi roztoku ETI a 5 ntinút sa inkubuje pri 30 °C,Po prídavku 800 l roztoku BAEE (20 mg BAEE x HCI) 100 ml testovacieho tlmivćho roztoku) sa stanoví zvýšenie extinkcie pri 253 nm.Aktivita ETI sa zisťuje podľa nasledujúceho vzorcaEvzorka zvýšenie extinkcie/min. inhibovanej vzorky Etrypsín zvýšenie extínkcie/min. neinhibovanćho trypsínuCtrypsín koncentrácia trypsínu v testovanej vsádzkc V predbežné zriedenie roztoku ETIVýsledok špecifická aktivita recETI je o 20 vyššia ako špecifická aktivita ETI izolovaného klasickým spôsobom zo semien E. cajjřa.Pri ďalších šaržiach rekombinantného ETI sa ako špecifická aktivita našlo napríklad 1,2, 1,5 a 1,6 U/mg.Príklad 4 Kopulácia recETI na SNBr-Sepharozu170 mg vyčístenej recETI sa dialyzovalo proti 0,05 M H,B 03/NaOH, pH 8,0, 0,5 M NaCl (kopulačný tlmivý roztok) a R zrniešalo sa so 7,5 g CNBr-Sepharozyk (cez noc napučanej v 500 m l mM HCI, potom odsatej a suspendovanej v kopulačnom tlmivom roztoku). Suspenzia sa inkubovala 90 minút pri teplote miestnosti, odsala a pretrepávala cez noc so 400 ml Tris HCl, pH 8,0, recETI sepharoza sa odsala a ekvilibrovala s 0,7 M arginín/H 3 P 04,pH 7,5.54 mg rekombinantneho aktívátora plazminogćnu K 2 P(vyrobeného podľa W 0 90/09437 alebo USP 5 223 2567 sa vnieslo na recETI-Sepharozu ekvilibrovanú 0,7 M arginín/H 3 P 04, pH 7,5. Po premyti ekvilibračným tlmivým roztokom a 0,3 M arginín/-H 3 P 04, pH 7,0 (teraz 5 objemami stĺpca) sa uskutočňovala elúcia s 0,3 M arginín/H 3 PO 4, pH 4,5. Obsah aktívátora plazminogénu v eluáte sa stanovil s S 2288 ako substrátom (Kohnert et al.,Prot. Engineer. 5 (1992) (93 - 100).Výsledok väzbová kapacita recETl-Sepharozy pre aktivátor plazrninogćnu je 1,2 mg a zodpovedá 0,63 MU (aktivátora plazminogénu/ml recETI-Sepharozy).Protokol. týkajúci sa sekvencií l. Všeobecné informácie i/ PrihlasovateľA. Meno Boehringer Mannheim GmbHE. Poštové smerovacie číslo D-68305ii/ Názov prihlášky vynálezu Použitie rekombinantného inhibitora z Erythrina cą/fra na čistenie serínových proteáz iii/ Počet sekvencií 2A. Nosič údajov Floppy diskB. Počítač IBM PC compatibleD. Softvér Patentln Release 1,0, Verse 1,25 (EPA)2. Informácie k SEQ ID NO l i/ Charakteristika sekvencie A. Dĺžka 539 párov bázD. Iné údaje /note Met only included in prokaryotie expression/D. Iné údaje funkcia multiple Cloning site xi/ opis sekvencie SEQ ID N 021

MPK / Značky

MPK: C12N 1/21, C12N 15/15, C12N 5/10, C12N 9/72, C07K 14/81, C12N 1/19

Značky: caffra, erythrina, proteáz, rekombinantného, použitím, inhibítora, čistenia, spôsob, serínových

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/7-282430-sposob-cistenia-serinovych-proteaz-pouzitim-rekombinantneho-inhibitora-z-erythrina-caffra.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob čistenia serínových proteáz použitím rekombinantného inhibítora z Erythrina caffra</a>

Podobne patenty