Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov a takto získaný koncentrát

Číslo patentu: 279533

Dátum: 02.12.1998

Autori: Burnouf-radosevich Miryana, Burnouf Thierry

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov z kryoprecipitovanej frakcie plazmy predčistenej na hydroxide hlinitom, ktorý zahŕňa tri po sebe nasledujúce chromatografické stupne, z ktorých prvé dva predstavujú iónovo výmennú chromatografiu na vinylickej polymérnej živici s veľkými pórmi, teda pórmi s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 106 daltonov, s nadväznými dietylaminoetylskupinami a tretí spočíva v afinitnej chromatografii na géli želatína-sepharosa. Takto pripravený koncentrát má vysokú špecifickú aktivitu nad 300 U CBA/mg proteínu alebo 180 U RCo/mg proteínu, jeho pomer aktivity k antigénu je aspoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulárnych multimérov je aspoň 65 %.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov a takto získaného koncentrátu, ktorý je vhodný najmä na terapeutickć účely.Doteraj ší stav technikyVon Willebrandov faktor (vWF) je najväčšia známa molekula, ktorá je v obehu V plazme. Existuje ako rad veľkých multimérov, spojených disulfidickými mostíkmi, ktorých základná jednotka má molekulovú hmotnosť asi 260 kDa (kílodalton). Najmenšou formou vWF v plazme je dimer s asi 440 až 500 kDa a nzýväčšiu formu predstavujú multiméry tohto diméru s molekulovými hmotnosťami, dosahujúcimi až 20 miliónov daltonov. Zoskupenie navzájom spojených jednotiek môže byť špecifické pre bunky, v ktorých je obsiahnuté, pričom vWF je syntetizovaný a polymerizovaný v megakaiyocytoch a endoteliálnych bunkách.Tento faktor hrá podstatnú úlohu pri hemostáze prostredníctvom dvoch rôznych funkcií transportuje a stabilizuje faktor VIII V krvnom riečisku a ako adhézny proteín umožňuje rozptýlenie, prilipnutie a zhlukovanie krvných doštičiek na vaskulámom subendotéliu, a tak prispieva k rýchlemu hojeniu poškodených ciev.Vrodený nedostatok vWF alebo štruktúme anomálie tohto faktora vyvoláva von Willebrandovu chorobu, ktorá má spočiatku formu hemoragie, najmä kože a slizníc. Klinické formy tejto choroby sú veľmi rôznorodé a pôsobia ťažké problémy v prípadoch chirurgíckćho zákroku. Liečba von Willebrandovej choroby je nevyhnutná na nápravu anomálií primárnej hemostázy (čas krvácania) a zrážavosti (aktívny cefalínový čas a zrážacia aktivita faktom VIII).Choroba sa lieči substitučnou terapiou ľudskej plazmy obohatenej vWF (napríklad kryoprecipitovanou frakciou plazmy alebo koncentrátmi faktora VIII, obsahujúcimi dostatočné množstvo vWF). Tieto produkty však nie sú štandardizované na liečbu von Willebrandovej choroby. Okrem toho málo čistene frakcie krvnej plazmy,najmä kryoprecipitát, nie sú bez rizika vírusovej kontaminácie, pretože často nie sú podrobované účinnej vírusovej inalctivácii. Navyše vyvolávajú prebytok kontaminujúcich proteínov, ktoré pacient nepotrebuje a ktoré môžu po opakovaných injekcíách spôsobovať imunologicke reakcie.Čistený faktor VIII je možne naproti tomu podrobiť účinnej vírusovej inaktivácii, ale proces jeho čistenia bol Optimalizovaný na liečbu hemoñlie A a nie na nedostatok vWF. Nedávno vyvinuté a stále účinnejšie procesy,ako je imunoañnime alebo ionexovć čistenie, používané na prípravu faktora VIII, v skutočnosti produkujú koncentráty, ktore už neobsahujú vWF v množstve, dostatočnom na účinnú liečbu von Willebrandovej choroby. Na uspokojenie tejto potreby účinnej liečby von Willebrandovej choroby vyvinul prihlasovateľ nový priemyselný postup čistenia vWF, umožňujúci optimalizovať izoláciu rôznych plazmatických molekúl. Umožňuje najmä jednostupňovú prípravu koncentrátu faktora VIII (postupom podľa EP-A-D 359 593) a získavanie frakcie vWF z rovnakej šarže kryoprecipitátu, teda optimálne využitie ľudskej plazmy. Takto získaná frakcia vWF sa čistí ďal šlmi dvoma chromatografickými stupňami, poskytujúcimi koncentrát vWF s veľmi vysokou čistotou.Čistenie vWF je v dôsledku zložitosti jeho molekuly ťažké. Boli už opísané metódy v malom meradle, tzn. 5 až 2000 m 1 na účely analytických štúdií (Thorell et al.,Thromb. Res., 1984, 35 431 -450), ale nebolo možné tieto metódy prípravy vWF adoptovať na priemyselné meradlo. Okrem toho sa nepredpokladalo čo najlepšie využitie kryoprecipítátu výrobou vWF popri FVIII.Von Willebrandov faktor bol čistený diferentnou rozpustnosťou na sulfátovaných zlúčeninách v prítomnosti glycínu (Bemtorp et al., Vox Sang. 1989, 56 212) sulfátovaných zlúčeninách (Winkelman et al., Vox Sang. 1989, 57 97) a pri použití rôznych metód Chromatografického delenia, ako je použitie molekulámych sít (Perret et al., Haemostasis 1984, 14 289) a výmena iónov (Austen et al., Thromb. Haemostas. 1982, 48 295). Tieto metódy však bud poskytujú nízky výťažok vWF, alebo majú nízku kapacitu gélu, alebo neumožňujú súčasnú izoláciu FVIII a vWF, a sú teda menej zaujímavé na priemyselnú aplikáciu.Bemtorp et al. (Vox Sang. 1989, 56 212) okrem toho získavajú vWF s nízkou čistotou 45 U Ag/mg (str. 213),zatiaľ čo prihlasovateľ dosahuje 205 U Ag/mg proteínu. Podobne Winkelman et al. (Vox Sang. 1989, 57 97) získava 10 U Ag/mg proteínu (str. 101).Perret et al. (Haemostasis 1984, 14 289) uskutočnili stupeň detibrinácie (na odstránenie tibrinogćnu vo forme molekúl fihrínu) s použitím vápnika a rovnako enzýmov z hadieho jedu táto príprava je teda zjavne nevhodná na terapeutické účely. Okrem toho zariadenie na gćlovú filtráciu, ktoré použili, je ťažko použiteľné v priemyselnom meradle, pretože umožňuje iba prietok 10 cm/h alebo menej a je veľmi náchylné na upchávanie, najmä v prítomnosti fibrinogénu a fibronektínu. Faktor čistenia v tomto chromatografickom systému je rovnako obyčajne nízky vplyvom nízkeho rozlíšenia proteínov.Austen et al. (Thromb. Haemostas. 1982, 48 46) tiež získavajú koncentrát s nízkou čistotou (8 U Ag/mg proteínu) a relatívne nízkym výťažkom pravdepodobne v dôsledku použitých drastických podmienok chromatograñe (pH 5,5).Harrison et al. (Thromb. Res. 1988, 50 295) používajú ako chromatograñckú matricu dextránsulfát-sepharosu tento materiál má níúçu retenčnú kapacitu pre vWF. V dôsledku toho získavajú preparát vWF s nízkou špecifickou aktivitou 2 až 4 U Ag/mg proteínu (str. 301).Väčšina týchto produktov konečne obsahuje pomerne veľký podiel denaturovaných alebo inaktívnych foriem vWF, čo dokazuje kofaktorová aktivita ristocetínu(RCo)/antigćn rádovo 0,08 až 0,8 (Lawrie et al. Br. J. Haematol. 1989, 73 100). Z tohto dôvodu sú menej účinné pri terapeutickom použití pri von Willebrandovej chorobe. Naproti tomu postup prihlasovateľa umožňuje získavať vWF s pomerom RCo/antigén vyšším ako jeden, porovnateľným s natívnym vWF z normálnej plazmy.Konkrétne je predmetom vynálezu spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnyeh multimérov z kryoprecipitovanej frakcie plazmy predčistenej na hydroxide hlinitom, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa tri po sebe nasledujúcechromatograñcke stupne, z ktorých prvé dva predstavujú iónovo výmennú chromatograŕiu na vinylickej polymérnej živici s veľkými pórrni, teda pórrni s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 105 daltonov s nadväznými dietylaminoetylskupinami a tretí spočíva v afinitriej chromatografii na géli želatina-sepharosa.Ďalším predmetom vynálezu je koncentrát von Willebrandovho faktora pripravený opísaným spôsobom,ktoreho podstata spočíva v tom, že má vysokú špecifickú aktivitu nad 300 U CBA/mg proteínu alebo 180 U RCo/mg proteínu, jeho pomer aktivity k antigénu je aspoň 1,5 a jeho obsah vysokomolekulárnych multimćrov je aspoň 65 .Spôsob podľa vynálezu umožňuje získať vWF ako vedľajší produkt pri výrobe vysoko čistého FVIII z veľkých objcmov plazmy, a tak optimaúizovať využitie kryoprecipitátu. Vysokomolekuláme multiméry, ktorými sa koncentrát podľa vynálezu obohacuje, súvisia s biologickou aktivitou vWF. Východiskovým materiálom je kryoprecipitovaná frakcia ľudskej plazmy, podrobená klasickému predbežnému čisteniu adsorpciou na hydroxid hlinitý. Tento materiál sa potom podrobí vírusovej inaktivácii, napríklad pôsobením rozpúšťadla-detergentu, a potom sa čistí.Postup čistenia podľa vynálezu zahŕňa kombináciu troch po sebe nasledujúcich stupňov chromatografie vedľajšieho produktu z výroby FVIlI, z ktorých prve dva spočívajú v ionexovej a tretí v afinitnej chromatografii.Obidve ionexové chromatografie sa uskutočňujú na rovnakej živici z vynilického polymćru, na ktorom sú naviazané dietylaminoetylové (DEAE) skupiny, konkrétne na kolónach DEAE-Fractogelu TSK 650 (Merck), ekvilibrovaných tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,01 M Citrát sodný, 0,1 lM chlorid sodný, 0,00 lM chlorid vápenatý, 0,12 M glycín a 0,0 l 6 M Iyzín s pH 7.DEAE-Fractogel TSK 650 je syntetický hydroiilný gél. Nosičom je kopolymér oligoetylenglykolu, glycidínmetakrylátu a pentaerynitoldimetakrylátu, na ktorý sú naviazanć dietylaminoetylové skupiny, tzn. -O-CHZ-CH 2 N(C 2 H 5)2 HCl, vďaka ktorým tvorí slabo alkalický menič aniónov. DEAE-Fractogel TSK 650 je dostupný v dvoch veľkostiach častíc (po zvlhčení vodou) typ S(0,025 až 0,050 mm) a typ M (0,045 až 0,090 mm). Na uskutočňovanie vynálezu sú vhodné obidva typy.Kryoprecipitovaná frakcia plazmy, ktorá bola podrobená predpurifikácíi a vírusovej inaktivácii obvyklým spôsobom, sa nanáša na prvú chromatografickú kolónu,ktorá zadŕža veľký podiel vWF. vWF sa potom eluuje zvyšovaním koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,14 až 0,15 M.Takto vymytá frakcia, obohatené vWF, sa aplikuje na druhú chromatografickú kolónu za rovnakých podmienok ako pri prvej kolóne. Pretože veľké množstvo proteínov(najmä FVIII a tibronektínu), ktoré súťažílo o adsorpčne miesta, bolo už z tejto frakcie odstránené v priebehu prvého chromatograiickeho stupňa, je kapacita druhej kolóny na adsorpciu vWF výhodne oveľa väčšia. Po odstránení Íiltrátu a premytí kolóny ekvilibračným tlmivým roztokom sa adsorbovaný vWF vymýva zvyšovaním koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,15 až 0,17 M. Vďaka vysokej kapacite a účinnosti živice DEAE-Fractogel pre vWF je možné vWF z kolóny eluovať s veľmi vysokou špecifickou aktivitou (vyššou ako 150 U RCo/ml). Nie je teda nutné aplikovať mechanické sily ultrafiltrácie, ktoré by vyžadovali koncentrovaníe produktu.Takto eluovaná frakcia sa podrobuje añnitnej chromatografii na géli, odvodenom od želatíny, V rovnakom ekvilibračnom tlmivom roztoku, takže nie je nutné modifikovať zloženie solí napríklad dialýzou alebo ultrafiltráciou táto kolóna je nutná na zadržanie molekúl zvyškového tibronektínu, ktoré ešte kontaminujú vWF. Výber želatínového gélu nie je rozhodujúci rovnocenne je možne použiť želatínovú Sepharosu, želatínový Ultrogel,želatínový Spherodex a želatínový Fractogel. Najvýhodnejšia sa javí želatínová Sepharosa, pretože za podmienok tohto procesu ñxuje 5 až 10 mg tibronektínu/ml gélu.Pri použitých podmienkach sa vysoko čistený vWF naviaže na gél aje vymývaný vo íiltráte pretože pri použitej afinitnej chromatografii nedochádza k významnému riedeniu frakcie vWF, je produkt priamo k dispozícii bez potreby zahusťovania napríklad ultrafiltráciou. Vplyvom neprítomnosti proteolytických enzýmov je finálny produkt veľmi stabilný a počas sterilnej filtrácie a lyoíilizácie nevyžaduje prítomnosť stabilizátorov.Koncentrát von Wíllebrandovho faktora, získaný spôsobom podľa vynálezu, má výnimočne vysoký faktor čistenia, dosahujúci viac ako l 0000-násobok vo vzťahu k pôvodnej plazme a jeho špecifická aktivita je 345 U CBA/mg proteínu (merná jednotka pre väzbovú aktivitu kolagénu) a viac ako 100 U RCo/mg proteínu (jednotka aktivity ristocetínového kofaktora). Príspevok každého chromatografickćho stupňa k čisteniu vWF je ilustrovaný na obr. l.Zlepšovanie kvality produktu v priebehu jednotlivých stupňov čistenia bolo konkrétne sledované ako funkcia podielu vysokomolekulárnych multimérov (molekuláma forma vWF s vysokou biologickou kvalitou) elektorforetickou analýzou.Tato analýza ukazuje progresívne obohacovanie o multiméry Ž 4 (obr. 2), ktoré predstavujú 79 polymérov vWF, napriek tomu, že pri kryoprecipitácii sa ich polovina stratí. Nepredpokladalo sa, že Chromatografia na DEAE-Fractogéli TSK 650 bude takto podporovať selektívnu retenciu veľmi vysokých multimérov a odstraňovať z tiltrátu formy s malou veľkosťou, abnormálnou štruktúrou (pri ktorých došlo k čiastočnej proteolýze) a nízkou aktivitou.Štandardizovaný koncentrát vWF s vysokou čistotou,vysokou špecifickou aktivitou a vysokým obsahom vysokomolekulárnych multimérov, získaný spôsobom podľa vynálezu, je preto veľmi vhodný na terapeuticke použitie pri rôznych formách von Willebrandovej choroby,ako bolo potvrdené predbežnými klinickými skúškami.Predbežné klinické skúšky ukázali, že tento koncentrát spôsobuje účinné skrátenie času krvácanía pri hemoragiách.Skúšky in vitro potvrdili identitu jeho biochemických a fyziologických vlastností s natívnou molekulou, najmä V prípade schopnosti fixácie krvných doštičiek v perfúznom prístroji a schopnosti viazať in vivo endogénny faktor VIII.Vysoká čistota koncentrátu von Wíllebrandovho faktora, ziskaného spôsobom podľa vynálezu, rovnako umožňuje predpokladať jeho rôme laboratóme aplikácie(na jemnú štruktúmu analýzu, štúdium funkcionality,diagnostiku a pod.) a použitie na výrobu špecifických protilátok.Koncentrát podľa vynálezu môže rovnako byť používaný ako stabilizátor pri produkcii faktora VIII bunkami,transformovanými genetickým inžinierstvom, aj pri čistení takto vyrobeného faktora VIlI.Prehľad obrázkov na výkresochObr. l znázorňuje SDS-PAGE frakciu vWF počas čistenia. Pruh 1 kryoprecipítát, pruh 2 kryoprecipitát ošetrený rozpúšťadlom-detergentom, pruh 3 frakcia naviazaná na DEAE-Fractogel, pruh 4 prvý eluát vWF,pruh 5 druhý eluát vWF, pruh 6 frakcia nenaviazaná na želatínový gél, pruh 7 štandardy.Obr. 2 predstavuje distribúciu multimérov vWF vo frakciách počas čistenia. Pruh l normálna plazma, pruh 2 kryoprecipitát, pruh 3 kryoprecipitát ošetreny rozpúšťadlom-detergentom, pruh 4 frakcia naviazaná na DEAE-Fractogel, pruh 5 prvý eluát VWF, pruh 6 druhý eluát vWF, pruh 7 frakcia nenaviazaná na želatínový gél.Kryoprecipitát sa pripraví z čerstvej plazmy, odoberanej v prítomnosti citrátu sodného (4 ) alebo antikoagulačného roztoku CPO (citrát, fosfát, dextróza) a zmrazenej najviac 6 h po získaní. Plazma sa hlboko zrnrazí na-60 °C a potom sa uchováva pri -35 °C. Šarže plazmy obsahujú 1800 až 2000 1 a na každé vykonanie procesu sa preskupí do šarži po 4000 l. S cieľom roztopiť sa plazma umiestní na 12 h do teplotne regulovanej komory,kde sa pomaly pravidelne ohreje na -7 °C a potom sa roztopí za stáleho miešania v terrnostaticky kontrolovanej uzatvorenej nádobe pri 0 až 2 °C. Kryoprecípitát(ktorý predstavuje asi 9 g/l plazmy) sa získa odstred vaním za studena.Kryoprecipitát, získaný po odstredení, sa opäť rozpusti a podrobí adsorpcií na hydroxide hlinitom na odstránenie niektorých nečistôt, konkrétne zložiek protrombínového komplexu (najmä faktora VII) a faktora XII. Supernatant sa potom ochladí na 15 °C (čím sa čiastočne odstráni tibrinogén a ñbronektín).Táto operácia umožňuje získať z kryoprecipitátu 80 až 86 zmesi faktora VIII a von Willebrandovho faktora špecifická aktivita faktora VIII je 0,7 lU/mg a špecifická aktivita vWF predstavuje 0,6 U RCo/mg (aktivita kofaktora ristoeetínu) a 1,2 U CBA/mg (väzbová aktivita kolagćnu).Roztok, obsahujúci zmes faktora VIII a von Willebrandovho faktora sa podmbí pôsobeniu rozpúšťadla-detergentu, ktore ako je známe, účinne likviduje vírusy s lipidickým obalom (Horowitz et al., Transfusion, 1985,25 516) a ktoré zahŕňa inkubácíu počas 8 hodín pri 25 °C V prítomnosti 0,3 tri-n-butylsulfátu (TnBP) a l Tweenu 80.Po tejto operácii sa získa 95 aktivity faktora VIII a von Willebrandovho faktora, merane v predchádzajúcom stupni. Elektroforézou je možné potvrdiť, že vWFje stále V multimémej forme.Cistenie vWF je odvodené z postupu čistenia faktora VIII, opísaného rovnakým prihlasovateľom v EP-A-O 359 593.Prvá Chromatografia sa vykonáva na kolóne DEAE-Fracctogeli TSK 650 (typ S alebo M, Merck). Ekvilib račný tlmivý roztok obsahuje citrát sodný (0,01 M), chlorid vápcnatý (0,001 M), glycín (0,12 M), L-lyzín(0,0 l 6 M) a chlorid sodný (0,11 M). V kolóne sa zachytí vWF, faktor VIII a fibronektín kontarninujúce proteíny(hlavne fibrinogén a niektoré IgG), zachytené voľne alebo nezachytené kolónou, a zvyšky z vírusovej inaktivácie sa odstránia niekoľkonásobným premytím rovnakým tlmivým roztokom.Kolóna sa používa s lineámym prietokom 100 cm/h.Za týchto podmienok má použitá kolóna retenčnú kapacitu pre vWF približne 75 nastrieknutćho množstva (merané ako antigén Ag) zvyšok sa stráca vo filtráte. Táto väzbová kapacita zodpovedá 45 U vWF Ag/ml gélu.Von Willebrandov faktor sa z kolóny desorbuje zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,15 M. Získaná frakcia vWF obsahuje 30 až 35 pôvodného VWF, zatiaľ čo 40 zostáva koadsorbovaných s faktorom VIII a bude s ním koagulovanć ďalším zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,25 M a podrobene spoločnému čisteniu.Frakcia, obsahujúca VWF, eluovaná z tejto prvej kolóny, sa nastriekne po miernom zriedení ekvilibračným tlmivým roztokom na zníženie iónovej sily frakcie vWF na ekvivalent 0,11 M chloridu sodného do druhej identickej kolóny.Pretože nečistoty a faktor VIII, ktoré v prvej kolóne súťažili s vWF o adsorpčnć miesta, boli počas prvého chromatogratického stupňa takmer odstránené, je vázbová kapacita druhej kolóny oveľa väčšia, 320 U vWF Ag/ml gélu. vWF sa desorbuje zvýšením koncentrácie NaCl v tlmivom roztoku na 0,17 M.Táto druhá chromatogratia umožňuje koncentračný faktor 8 až 10 vyšší ako v prvom stupni, a tak nevyžaduje ďalšie zahusťovacie operácie, napríklad ultrafiltráciu. Pri použití štandardných metód sa zisťujú tieto množstvá,resp. aktivity vWF antígén (Ag) 88 k 9 IU/ml kofaktor ristocetínu (RCo) 97 i 19 IU/ml väzbová aktivita kolagénu (CBA) 149 i 13 IU/ml vysokomolekuláme multiméry (Ž 4) 79Jednotky CBA (väzbová aktivita kolagénu) sú kvantiftkovane pomocou ELISA podľa Browna a Bosaka(Thromb. Res., 43 303). Na vyjadrenie hodnôt v medzinárodných jednotkách bola ako kontrola použitá štandardná plazma, kalibrovaná proti 2. britskému štandarduPomer CBA/Ag rovnajúci sa 1,69 ukazuje, že aktivita vWF je dobre zachovaná. To je v súlade s vysokým percentom vysokomolekulámych multimérov (79 ) a vychádza priaznivo v porovnaní s natíimym vWF (70 ) Z plazmy.Elektroforetíckou analýzou tohto eluátu vWF sa zisťuje miema kontaminácia ñbronektínom a inter-alfa trypsínovým inhibítorom, serín-proteázovýqn inhibítorom.Druhý eluát vWF sa potom podrobuje tretiemu stupňu čistenia na kolóne želatínovej Sepharosy CL 4 B(Pharmacia), ekvilibrovanej elučným tlmivým roztokom z predchádzajúcej kolóny, s cieľom odstrániť ñbronektín.Tento añnitný chromatografický gél má retenčnú kapacitu pre fibronektín väčšiu ako 5 mg/ml, čo umožňuje znížiť množstvo tejto nečistoty vo frakcii vWF na nedekovateľné množstvo (pod 4 mg/ l).Čistený vWF podľa vynálezu sa nachádza vo tiltráte z tohto posledného stupňa aje vhodný na priame použitie a lyoñlizáciu.Elektroforetickou analýzou finálneho produktu už nie je možne detekovať žiadne nečistoty. Obsah vWF je 205 U Ag/ml proteínu a jeho špecifická aktivita je 345 U CBA/mg proteínu a 186 až 220 U RCo/mg proteínu.Celkový stupeň čistenia vo vzťahu k pôvodnej plazme je 10 OOO-násobný.Elektroforetieká analýza (SDS-agmóza a skanovanie pásov) ukazuje, že vWF, získaný týmto postupom čistenia, je 65 až 80 tvorený vysokomolekulámymi multimérmi tento podiel je porovnateľný s pôvodnou plazmou, kde robi 70 .Stabilita koncentrátu bola študovaná počas 24 hodín v kvapalnom stave pri teplote miestnosti neboli nájdené známky proteolytickej aktivity ani zmeny špecifickej aktivity.Absencia trombogénnej aktivity v koncentráte bola potvrdená konvenčnými testami, ako je NAPTT (non-activated partial thromboplasm time). Nebolo možné detekovať trombin, PKA ani kallikreín.Získaný finálny koncentrát vWF teda nevyžaduje prídavok stabilizátora.Čistenie vWF špecifickým postupom, pri ktorom sa vWF získava ako vedľajší produkt výroby faktora VIII,po prvýkrát umožňuje výrobu vysoko čistého, vysoko účinného terapeutickćho koncentrátu, štandardizovaného na liečbu von Willebrandovej choroby.l. Spôsob prípravy štandardizovanćho vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulových multimérov z kryoprecipitovanej frakcie plazmy predčistenej na hydroxide hlinitom, vyznačujúci sa tým,že zahŕňa tri za sebou nasledujúce chromatografickć stupne, z ktorých prvé dva predstavujú ionexovú chromatografiu na vinylovej polyměrnej živici s veľkými pórmi, teda s pórmi s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti nad 105 daltonov, s naviazanými dietylaminoetylovými skupinami, a tretí spočíva v afinitnej chromatograñi na gćlí želatína-sepharosa.2. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č u j ú e i s a t ý m , že prvou a druhou ionexovou živicou je vinylový polymér so zakotvenými dietylaminoetylovými skupinami, ekvilibrovaný tlmivým roztokom obsahujúcim 0,01 M citrátu sodného, 0,11 M chloridu sodného,0,001 M chloridu vápenatého, 0,12 M glycinu a 0,016 M L-lyzinu.3. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č uj ú ci s a t ý m , že predčistená kryoprecipitovaná frakcia plazmy sa aplikuje na prvú ionexovú chromatograñckú kolónu a prvá frakcia, obsahujúca von Willebrandov faktor, sa eluuje zvýšením koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,14 až 0,15 M.4. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č u j ú ci s a t ý m , že eluát z prvej chromatograñe obsahujúci von Willebrandov faktor sa aplikuje na druhú ionexovú chromatograíickú kolónu a von Willebrandov faktor saeluuje zvýšením koncentrácie chloridu sodného v tlmivom roztoku na 0,15 až 0,17 M.5. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č u j ú ci s a t ý m , že eluát z druhej chromatografie sa spracuje chromatograñou na géli želatína-sepharosa ekvilibrovanom elučným tlmivým roztokom z predchádzajúceho chromatografického stupňa k selektívnej adsorpcii zvyškového fibronektínu.6. Spôsob podľa nároku l, v y z n n č uj ú ci s a t ý m , že ñltrát z kolóny gélu želatína-sepharosa obsahujúci von Willebrandov faktor sa zachytí, jeho koncentrácia sa nastaví na konečnú hodnotu aspoň 30 IU/ml, rozdeli sa do 20-mililitrových fľaštičiek a lyofilizuje sa.7. Koncentrát von Willebrandovho faktora pripravený spôsobom podľa niektorého z nárokov 1 až 7,vyznačujúci sa tým, žepreukazujevysokú špecifickú aktivitu nad 300 U CBA/mg proteínu alebo 180 U RCO/mg proteínu, jeho pomer aktivity k antigénu je aspoň l,5 a jeho obsah vysokomolekulových multimérov je aspoň 65 .

MPK / Značky

MPK: C07K 1/16, C07K 1/18, C07K 1/22, C07K 14/745

Značky: čistého, faktora, štandardizovaného, koncentrátů, takto, ľudského, vysokomolekulárnych, vysokým, willebrandovho, přípravy, spôsob, podielom, multimérov, vysoko, koncentrát, získaný

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/7-279533-sposob-pripravy-standardizovaneho-vysoko-cisteho-koncentratu-ludskeho-von-willebrandovho-faktora-s-vysokym-podielom-vysokomolekularnych-multimerov-a-takto-ziskany-koncentrat.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého koncentrátu ľudského von Willebrandovho faktora s vysokým podielom vysokomolekulárnych multimérov a takto získaný koncentrát</a>

Podobne patenty