Selektivní adsorbens pro vázání imunokomlexů

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

vynález se týka adsorbentu pro selektivni vázání cirkulujících imunokomplexů obsažených v tělnich tekutínách, prováděně pomocí opakovaného a reprodukovatelného použití povlečeného nosiče. Postup Je použitelný ve farmaceutickém průmyslu 1 v lěkařství.Ja prokázéno. že V tělních tekutinách, například v krvi, mají cirkulující imunokomplexy podetatný pathugenetický význam u řady onemocnění (mj. u antiimunitnich onamocnění jako Lupus erythematodes visceralis a rheumatoídní arthritida, u odvržení transplanteto, infekčních onemocnění, případně u neoplaaií). Cirkulující imunokomplexy se mohQgzmgt na stěnách cév e vyvolávat u orgánů, které Jsou k tomu právě náchylně, zánětlivé reakce (mj. vasculitie, arthrítís. nephritia, serositís, carditis, cerabrítis,anaamii, leukopenii,grombopenii) projevující se odpovídejícími symptomy. Zvláště při autoímunítních onemocněních koreluje koncentrace imunokomplexu V eéru (plazmě nebo jiných tělních tekutínách) se stupněm onemocnění. Proto Jo vhodná ovlivnit pethomechanismus těchto onemocnění odstraněním cirkulujících imunokomplexů z tělních tekutín. Tim se dosáhne zbrzdění postupu shore menovaných nemocí, sníží sa aktivita onemocnění a potlačí se nobo udstraní s nimi spojené symptomy. Úspěchy plasmaphoresy spnčívaji mj. v odstranění,případně v omezení pathogeneticky významných imunokomplexů /viz. E. Apostoloff aj., Dt. Gesundhaítsw. 35, 54 (l 979) H. F. Perry aj., Ann. Rheum. Dis. 52, 224 až 228 (198 l)Nevýhodou této metody je neselektivní odstranění všech složek plazmy, což vyvoláva nutnost dodávání větších množství cizí plazmy nebo lidského albuminu. To může být 2 kapacitnich nebo ekonomických důvodů limitujícím faktorom. Proto existuje Již několik let snaha o vývoj adsorbentu, která umožňují selektivní odstranění cirkulujicích lmunokomplaxú z tělních tekutin. Přitom bylo v podstatě postupováno těmito způsoby-Stefylokokový protein A fixovaný na nerozpustný nosič (fixované stafylokoky, protein A-Sepherose) gerovnej D. S. Torman aj., J. Imunol. łgi, 793 (1980) New England 3. Mad. § 25, 1195 E. Behm a H. Klinkmann v Plasma Separation and Plasma Fractionatíon,str. 254 až 265 (Karger, Basel 1983)/-porézní pryskyřice na bázi estero kyseliny akrylová jhapř. XAS-7, dodává firma Rohm a Haas Co., USA srovneg T. Agishi, Zinko Zoki, g, 264 (l 980)7-iontoměniće Jako karboxymetyl celulóza šrovnej L. D. Johnson aj., Can. J. Biochem. 13, 795 (1964), -adsorbens, obsahující povrch, na nějž je vázěn při nejmenším jeden hydrofobní člen s 6 až 700 uhlikovými atomy a člen, který vytváří přinejmenším jeden nagativní náboj 1. Kuroda aj Japonský patent 3. P. P 5 e~ 59199, P sa-59192/.Tyto adeorbenty mají však různé nevýhody Protein A je schopen vázet imunokomplaxy. avšak nikoliv dostatečně selektivně. protože váže rovněž IgG, který není vázán na imunokomplex. Mimoto je protein A cizí protein e tomu odpovídajícímí nevýhodami v případech,kdy je používán ve styku s tělními tekutinami. Výrobní náklady proteínu A jsou velmi vysoké. Použití inaktívovaných atafylokokú jako přirozených nosičů proteínu A umožňuje použití proteínu A bez jeho dalšího čištění, přináší však dodatečná problémy při styku tělní tekutiny e inaktivovanýmí bakteriemi (např. uvolňověni pyrogenů). Údajně dochází rovněž k aktivízaci komplementárního systému nosiči proteínu A. Porězní pryekyřice na bázi eaterů kyseliny akrylově a kerboxymethylcelulózy se vyznačuji Jen omezenou adeorpčni kapacitou z tělní tekutiny. Adaorhens, který se skládá 2 hydrofobního členu a z členu,který obsahuje nagativní náboj, není rovněž dostatečně speciŕický.Předložený vynález odstraňuje tyto nedostatky. vynález řeší úlohu odstranění cirkulujících ímunokomplexů eelaktivně e šetrně z tělních tekutín za použití sterílizovatol 2 CS 270 558 81ných nosičů. Nosiče je možno jednoduše, rychle a reprodukovetelne odstranit za účelem dalšího použití. Řešení tohoto úkolu. ktoré je podstatou vynelezu, spočívá V tom, že protein Cl ~ podjednotka první komponenty komplemantárnihu systemu - ja vázán spojovacími můstky na povlaćená nosiče, například ne mskrnporezní efericke kopolymery 2-hydroxyathylmethakrylátu s ethylendimethekrylátam nebo na kopolymery stejne chemické struktury v planární formě nebo na materiály obsahující celulózu, například perlovou celulčzu nebo na celulőzove nosiče v planárni formě. nebo je vázán pomocí eilanového spojovaciho činidla kovalentně na nosiče obsahující oxid křemíku, například na porázní sklo, skleněná vlákna nebo planární filtry zo sklenených vláken, nebo je vázán na jiné nosiče, a takto na nosič vázený protein Clq jappouživán k vézáni a odstraňovaní cirkulujicích imunokomplexü přičemž imunokomplaxy vázané na protein Clq jsou ndstreňovány z tělnich tekutín oddělením pevná fáze a pevná fáze je reganerována působenim nedenaturujících medií. Podstata vynálazu spočívá dále v tom, že protein Clq, ktorý se vyskytuje v lidskéi zviřecí krvi a který je zodpovědný za vázáni imunokomplexů a jejich fyziologické vylučovúni. je vázán na ahora jmenovane nosiče, které maji dostatečně velký povrch e porozitu, a jejichž povrch jo podrobován chemické nodifikaci známým způsobem apichlorhydrinem,estery kyseliny chlormrevenčí. CNBr, kyanurchloridem, kerbodiimidem (přehled M. 0. Lilly Hethode in Enzvmology ii, 1978, 46) nebo silanovými adhéznimi činidly, nabo případně hetero- nebo homobifunkčními reegenciemi, a takto na nosič vázaný protein Clq je použit pro in vivo a pro in vitro provádšné odstranění cirkulujicich imunokomplexů z krevních tekutin, načež takto vázané imunokomplexy jsou odštěpovány nadenaturujícími médií, takže použitý nosič - jehož povrch je obsazen proteinam clq - može být znovu použit.Nosič sloužicí jako pevná fáza má rozličné geometrické tvary, přičemž kulovitý, vláknitý nebo planárni zesitěni nosiče jsou zvláště vhodné. Myslitelné jsou však 1 filmy, laky e jiné tenké vrstvy jmenovaných kopolymerů na jiných inartních biologicky snášenli vých materiáloch.Materiál obsahující polyĺhydroxyethylmethakrylát) má v podstatě eŕérickou strukturu,přičemž jeho velikost částic, složení a porozite mohou být různé. Zvláště vhodne jsou velikosti čáetic mezi 100 až 400 /um a průměry pőrů větší než 50 nm. Maximální průměr pőrů je cca 100 um, přičemž při zvětšujícím se průměru párů se plocha, která je k dispozici, a tim i kapacita, stálo zmenšuje. Materiál obsahující celulčzu je v podstatě perlová celulőza, přičemž její velikost částic, složení, struktura e porozita mohou být rozdílné. Zvláště výhodne jsou velikosti částic mezi 100 až 400 /um a průměr pěrů větší než S 0 nm. Maximální průměr pőrů je cca 100 /um, přičemž se stoupajícím průměrem porů se plocha, která ja k dispozici, a tim i kapacita nosiče, analogickým způsobem zmenšuje.Protein Clq je vázán na povrchy nosičů obsahujících celulózu, jež byly modifikovany známým chemickým způsobem, například pomocí esterů kyseliny chlormravenčí. CNBr, kvanurchloridem, karbodiimidam nebo silanovými adhézními činidly.Nosič obsahující oxid křemíku má rovněž rozličné geometrické formy, přičemž kulovité nebo vláknitá nosiče 3 editivy nebo bez nich, ktoré mohou být pomocí obsahu. eintrováni, nebo použitím adheziva uspořádány do nadřazených etruktur (filtrů, frit apod.) e definovanou propustnoetí, Jsou zvláště výhodné. Materiály obsahující oxid křemíku jsou v podstatě porézni skla (viz F. Janowski, W. Heyer Poräsa Glěser, Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie. Leipzig 1982), ktoré jak známu je možno bez problému sterilizovet a udržovot sterilní a jejichž velikost čáatic, struktura a porozite jsou přesně definovány. Zvleště vhodné jsou dokonale sfćrické ćästice (00-WP C 038 259 5548, DD-WP Bol 3 269 4382, 00-WP Bol 3 26 94390) s velikostni částic mezi 1 a 1000 /um a s průměry pôrů 0,05 až 100 /um, přičemž jsou průměry porů a plocha, ktoré je k dispozici e ktorá rozhodujícím způsobem ovlivňuje kapacitu nosiče, navzájom nepřimo úměrné. Ideálně aférická forma metrice má rozhodujicí význam pro šetrná podmínky procesu, protože podstatné redu cs 270 eso B 1 3kuja otřihové sily, které působí na proteiny. Ňevíc se vyznečují ideálne aférické skloněné částečky odolnosti proti otěru. výhodnými hydrodynemickými vlostnostmi, širokým rozmezím textur, a tím 1 prdtokových vlastností, jekož i nepřítomností toxickchh přímésí. Zvláště z hlediska technologických procesů jsou výhodné nosiče v planární formě nebo patrony se zrnitým materiálem. nebo membrány z porézního skle e nadřazenou strukturou, ktoré Jsou používány Jako filtry v odpovídajících filtračních eyetémech. Zde se oevědčuji zvláště dobře filtrační materiály obsahující ekleněne vlákna vzhledem k Jejich mechanické pevnosti.Nedenaturugící média pro odštěpení vázaných imunokomplexů Jsou pufrované roztoky o vysoké iontové sile, přičemž jsou zvláště výhodné 0,5 až 3 M roztoky chloridu sodného,avšak rovněž chaotropické reagencie, kyseliny a louhy. Modifikace povrchů poly(hydroxyethylmethakrylátů) za účelom vytvoření podmínek pro tvorbu kovelantní vazby s proteinem Clq probíhá známým způsobem, s výhodou působoním epichlorhydrínu, může být však prováděna i jinými modifikačními postupy, jeko půeoboním cNBr, karbodiimidů a jiných heteronebo homobifunkčních reagencíí. Modifikace povrchu celulězy probíhá rovněž známým způsobem, výhodné působením eaterů kyseliny chloromravenčí, může však probíhat i jinými modifikaěními postupy, Jako působením CNEr, kyenurchloridu, karbodiimidu nebo glutaraldehydu.Modifikace povrchu nosiča obsahujících oxid křamíku probíhá působením tzv. eilanových adhezních činidel Jakokde R jsou alkyly a x Jsou např. amino-, epo×y~, díazo-. sulfhydryl- nebo nitroskupiny a reakcí zbylých funkčních skupin známým způsobem s homo- nebo heterofunkčními reegenciemi nebo prímou raakcí s reaktivními skupinami proteinů.Clq-nosiče, ktoré jsou předmětam vynálezu, Jsou chemicky staybilní. značné odolné působení mikroorganismů, sterilizovatelné a biokompetibilní. Tím je umožněna Jejich regenerace. Nosič so zakotveným proteinem se potom používá k vázání a odstraňování cirkulujících imunokomplexů, přičemž je možno Jej použít obvyklým způsobem v průtokovám systému (hemoperfuze, plazmaperfuzo). Jekož 1 va vsádkovém procesu (při izolací imunokomplexů pro výzkumy in vitro). Po proběhnutí reakce a oddělení nosiče od tělních tekutin,se kterými byl vo styku. se ímunokomplaxy odštěpí působením nedonaturujících čínidel,např. ZM roztokom Nacl, takže kovalantně vázený protein Clq je k dispozici k novému použití. Postup, který je předmětem vynálezu, používá fyziologickou funkci proteínu Clq pro seloktivni a šetrné vázání imunokomplexů e Jegich nasledovné odstranění z tělnich tekutín.Níže uvedené příklady slouží k bližšímu osvětlení vynolezu5 g makroporézniho sféríckého kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu e ethylend 1 methakrylátem e vylučovaci mezi 2 x 105 D a povrchem cca 70 ma/g a reaktivními expoekupinami (l,020 m mol/g nosiče) (separon Hama 1000 ER) se emísí s proteinem Clq (1 mg/ml) v PES-pufru obsahujícím 10 mM EDTA o pH 7,4 a po dobu 48 hodin inkubuje při A °C za mírného třepání. Určsní vázaného proteínu Clq probíhá diferenční analýzou roztoku po provedení reakce, resp. stanovením zbylého proteínu při 280 nm (EÍBĚ 0,5) nebo pomocí jednoduché radiální imunodifúze za užití spocifického antisere. Potom se smísí nosič s IM roztokom etanoleminu v PBS-pufru o pH 7,4, aby byly ještě případně volné re akční skupiny zablokovány. Dále se nosič vymyje 0,01 M fosfétovým puŕrem o pH 7,4, kte 4 CS 270 658 B 1rý obsahuje 0,05 m NaCl. Protein Clq zekotvený na nosiči se nyní použije k navázéní 1 mu~ nokomplexů. K tomu se nosič na bázi Separonu se zekotveným proteinem Clq smisí s heparinlzovanou plazmou, která obsahuje zvýšenou koncentreci cirkulujicich imunokomplexů (pacient s lupus orythematodes vlaceralia) a inkubuja se 2 h při normální teplote. Po odstranění nosiče dekantaci nebo centrifugaci se nosič promyje nejdřive 0,01 mM foaŕátovým pufrem 1 pH 7,4, obeehujicim 0,05 M NaC 1, e potom regeneruje 2 M Nacl v BS-pufruo pH 7,4. Stenoveni imunokomplexů se provede pomoci imunoeseje s použitím proteínu Clqna pevná fezl. K určení neapeciflcká vazby na nosič byla stanovena koncentrace bilkovin ve specifickém eluátu podle Lowryho při 280 nm, byla též provedena imunoelektroforéze,dvojité radiálni imunodifúze se epecifickými antiséry a elaktroforáza na polyakrylamidovém gelu. V sluátu bylo možno epecificky etanovit cirkulujici imunokomplexy. Kontaminujici průvodni proteiny nobyly přitomny. Aktivace komplementárniho systému nebyla proká~Na aktivovaný Seperon Hama ER se naváže lidský protein Clq, Jak je popsáno V přikladu 1. Tato matrice se naplní do chromatografického sloupce (Q 4 mm) a promyje se 0,01 M fosfatovým pufrem, pH - 7,4, 0,05 M Nacl. Neto se dávkuja 2 ml heparinizovaná plazmy pacienta se zvýšenou hladinou lmunokomploxů a aluuje shora uvedeným pufrem (průtok 10 ml/h). Odštěpeni specificky vázaných imunokomplexů a s tim spojená regenerace matrice se provádí jak je popsáno v přikladu l, tj. působenim 2 M roztoku Nacl v PBS pufru, pH 7,Ä. Koncentraco bilkovin byla stanovována kontinuálně pomoci průtokového UV-spaktrofotometru. Výsledky odpovídají údajům uvedeným v přikladu 1.Perlnvá celulőza aktivovaná astery kyseliny chloromravonči (aktivačni stupeň 63/umul/ml) se nojdřive převeda postupně do vodného prostředí, protože je smísana s dioxa~ nem. To se provádí vypiránim nosiče za micháni dostatečně velkým přebytkem (50 ml vypiraciho roztoku/ml nosiče) směsi dioxan-voda o tomto složení 90/10 70/30 10/eo 0/100. Celková doba vypiracího procesu nemá být delší než 10 až 15 minut, aby sezzabránllo ztrátán aktivnich skupin V důsledku hydrolýzy. Naco se nosič smial e proteinem Clq (1 mg/ml) v PES-pufru, pH 7,4, který obsahuje 10 mM EDTA a inkubuje se 4 h při pokojová teplotě za mirného třepáni. Stanoveni vázaného proteínu se provádí diferenčnim měřenin získaného roztoku, případně zbytku, po předchozí dlalýze při 280 nm (Ežeg - 6,8) nebo pomoci jednoduche radiálni imunudifúze. Dále se nosič emisi s 1 n roztokom ethanelaminu v Pes~pufru, pH 7,0, aby se zablokovaly Ještě případně volná reaktivní skupiny. Nato se nosič vypirá 0,01 a foafdtovýn pufrem, pH 7,4, který obdahuje 0,05 M NaC 1. Tento na nosiči zakotvený protein Clq se nyní použije pro vázani imunokomplexů. To se provede tak, že perlová colulěza se zakotveným pro einem Clq so emiai se eérem pacienta, které obsahuje zvý~ šenou koncentraci imunokomplexů (pacient s lupus erythematodes visceralis) a inkubuje po dobu 2 h při normální teplote. Nosič se odděli dokantaci nebo centrifugaci a vymývá 0,01 mM fosfátovým pufrem, pH 7,4, 0,05 M NaC 1 a nato se regeneruja 2 M NaC 1 v PES-pufru,pH 7,4. Stenoveni imunokomplexů se provede jako v přikladu l a 2 pomoci imunoesejo s proteinam Clq zekotveným na pevné fázl. Pro určení nospecifického navázán. na nosič se stanovuje koncentrace bilkovin ve specifickém eluátu podle Lowryho a provádí se imunoelektroforáza. Připadná aktivizaco komplementárniho systému se sleduje kvantitativnim urče nim komplementàrnich komponent proteínů Clq a C 3.Tabulka 1 ukazuje charakteristický výsledek taková procedury.

MPK / Značky

MPK: A61K 37/02

Značky: selektivní, vázání, imunokomlexů, adsorbens

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/7-270658-selektivni-adsorbens-pro-vazani-imunokomlexu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Selektivní adsorbens pro vázání imunokomlexů</a>

Podobne patenty