Způsob výroby opticky aktivních.alfa. -aminokyselin z racemických směsí

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Vynález se týká způsobu výroby opticky aktivnichtkraminokyselin z racemických směsi pomocí enzymu aminoacylasy imobilisovàného na makroporesním kopolymeru 2 ~hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem.Při chemické syntéze M-aminokyselín se ziskávají-opticky ínaktivní racemáty L- a D-isomerů.L-konfigurace àminokyselín představují základni stavební jednotky přírodních bilkovin a tím důležité meziprodukty metabo 1 ismú.všech organismů.D-aminokyseliny jsou významné na pŕíklad jako součást mo lekul některých antibiotik.Proteinogennii neproteinogenníopticky aktivní aminokyseliny vyvolávají stále větší zájem farmaceutického průmyslu,potravinářství,biochemického výzkumu a biotechnologíe. uL-aminokyseliny se připravují několika způsoby.Vedle výroby z biologíckého materiálu a stereospecifickéłsýntéžy některými mikroorganismy je chemická syntéza racemických směsi aminokyselín a jejich následné rozdělení hospodářsky velmi významné.Ke štěpení racemátů může být použito řady fysikálně chemických,chemických a biochemických metod (J.PeGHeenstein and N.WinitzChemistry of the aminoacids,J.Wiley Sons nc.New York/London,l 96 l,Voll-III).Význam biochemickýchmetod využivajicích vysoké stereospecificity enzymů stáleroste,příčemž se využívá enzymů V rozpustné nebo v imobili-V sované formě.Enžymý (na př.trypsin,chymotrypsin,karboxypeptidasa,pepsin,leúcinaminopeptidasa,oxydasa L-aminokyselín) kaüüysují stereospecificky pouze reakci jednoho enantiomeŕu vhodných derivátů D,L-aminokyselín a ponechávají druhý beze změny.Aminoacylasa se vyznačuje vysokou stereospecificitou,širokou specífičnosti vůči substrátům a vysokým výtěžkem katalysy,takže se jedná o velmi vhodný enzym pro štěpeni racemätů Nwacylovaných D,L-aminokyselín. Protože však je aminoacylasa V roztoku poměrně málo stálá a rychle se desaktivuje,. je stabilisace tohoto enzymu imobilisací na pevném nosiči velmi výhodná.Vazbaaminoacylasy na nosiči podstatné zvyšuje jeho stabilitu,umožňuje snadné oddělení aktivnĺho enzymatickéhokatalysátoru vázaného na nosiči od reakčních produktů a jeho opakované použití.Amínoacylasa může být imobilisována adsorpcí na iontoměničích hospodárným postupem (T.Tosa,T.Mori,N.Fuse,I.Chibata,Enzymologia 3 l(1966)2 l 4 T.Tosa,T.Mori,N.Fuse,I.Chibata,Biotechnol.Bioeng.,9(1967)603 T.Tosa,T.Mori,I.Chibata,Agr.Biol. Chem.,33(l 969)l 053.). Nevýhodou nekovalentní vazby aminoacylasy na iontoměniče je skutečnost,že se enzym při eluci pufry a roztoky substrátů z nosiče uvolňuje a vymývá.Přitom je nutno pracovat v relativně zreděných roztocích substrátů a životnost katalysátorů je značně omezena.Při kovalentní imobilisaci enzymů na pevném nosiči se vytvářejí stabilní chemické vazby,takže je možno pracovat s poměrně koncentrovanými roztoky substrátů.Je známa řada speciálních postupů pro kovalentní imobilisaci aminoacylasy nebo její zabudování do polymerní sítě (T.SATO,T.Mori,T.Tosa,I.Chibata,Arch.Biochem.Biophys.,l 47(l 97 l)788 I.Chibata,T.Tosa,T.Sàto,T.Mori,Y.Matsuo,Proc.IV.IFS,Ferment.Techno 1.Today,383(1972)383 M.Mašková,T.Barth,B.Jirovský,I.Rychlík,Co 1 l. CzechosLChemQCommun. ,3 a(1973 943 ,H.N.VIeeta 11,C.C.Detar,Biotechnol.Bioeng.,16(1974)1537 B.Szajani,K.Ivoný,L.Roross,Acta Biochim.et Bíophys.Acad.Sci.Hung.,l 5(l 960)295 I.Willhardt,P. Hermann,DDR Pat.Anm.DD WP 123 l 88(l 98 l).Nevýhoda známých a citovanýbh kovalentně vázaných preparátů amínoacylasy spočívá především V tom,že se z části používá imobilisace na biopoLymery,jejichž životnost je omezena na př. mikrobiálním odbouráváním.Jinou nevýhodou je pracnost,případně vysoké nákiady na provedení aktivačni reakce (některé aktivační procesy jsou zdravotně škod 1 ivé),které slouží k umožnění vzniku kovalentní vazby mezi nosičem a enzymem.To se týká na př. aktivace polysacharidových nosičů rozpustnými garbodiimidy nebo bromkyanem.Vyná 1 ezje určen k přípravě opticky aktivních àminokyselin štěpenímracemátů pomocí imobilisované aminoacylasy s použitím vysoce hospodárného postupu,který lze provádět v laboratorním mčřítku v mikromolovém nebo v milimolovém objemu. Zpracovávat lze směsi racemátů aminokyselín značených stabilnimi ísotopy nebo racemické směsi radioaktívních či neproteinogennich aminokyselín stejně jako proteinogenních aminokyselín V měřitku preparativním a výrobnim.Přítom lze odstranit shora uvedené nedostatky známých postupů využivaných k imobilisaci amínoacylasy zejména při použití biopolymerů jako nosičů. Podle vynálezu se dosahuje podstatného zvýšení mechanickéa ziskávají se výhodné hydrodynamické vlastnosti imobilísovaného enzymu.Da 1 ší výhodou je odstranění některých aktivačnich kroků,které představují,které představují technologickou komplikaci.Předmětem vynálezu je způsob vazby amínoacylasy,která je určena ke štěpení racemických směsi na povrchové epoxidovaný makroporesní sférícký kopolymer Zehydroxymethakrylátu s ethylendimethakrylátem s vysokým výtěžkem enzymatické aktvíty,prodloužením životnosti a stability vázaného enzymu. Přitom odpadá pro kovalentni vazbu aminoacylasy obvykle nutná aktívace nosiče na př. sloučeninami obsahujícímí aminoskupiny nebo aktivace sloučeninamí jako rozpustný karbodiimid,bromkyan nebo glutaraldehyd.Podle vynálezu probíhá ímobilísace aminoacylasy jednoduchým procesem,přičemž se enzym rozpustí v tlumivém roztoku(pH 7,o-8,5 oo 5 - 0,2 mol/1),přidá se nosič (stupeň epoxi-j dace 0,7-2,0 mmol/g velikost častíc 100-200/umvylučovaci limit molekulové hmotnosti 2 OO OOO - 5.106) a směs se za obösného protřepáni ponechá reagovat 5-40 hodín při teplotě O ~ lO°C.Pro dosažený stupeň enzymatické aktivity imobílisované aminoacylasy je přítomnost vyšší koncentrace soli jako na př. síranu amonného nebo fosforečnanu amonného (1,0 - 1,7 mol/1) V reakčni směsi nutnou podminkou.Obsah soli V tlumívém roztoku při vazebné reakci stabilísuje aminoacylasu a má za následok získání vysoce aktivního preparátu imobilisovaného enzymu.Takto imobilisovaná acylasa se ponechá reagovat s N-cx-acyl-D 7 L amínokyselinou známým způsobem v kontinuálním procesu V koloně nebo vsádkovým způsobem.Oddě 1 eni aktivní imobilisované aktivní aminoacylasy Z reakční směsi na př.fil~of . A 240 m trací nebo odstředěním jenás 1 edováno íaolací L-aminokyso líny známým posxupem.N-ĺacýlD~aninokyseliny,které nebyly vaminoacylasou transfornovány je možno následně chemickyhydrolysovat a tak získat D~aminokyse 1 iny.Je možno též N 1 °Facy 1-D-aminokyselíny-opět racemisovat a znova rącemíckou směs podrobit štěpení.. Imobilĺsace aminoacylasy na povrchu eýoxiskupínàmi modíê fikovanéäo kopolyméru 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem dovoluje podstatnou úsporučasu při příh pravěíúázanáho enzymu.Jednostupňová vazebná reakce je jednoduchä,zdravotně nezávadné a ýelmi hospodárná.Díky dooažené vysoké àtabílitě a životnosti (na př. aktivita po Ä týdnech představujé 85 výchbzí aktívity,po 12 týdnech 57,5 apo 5 měsících 33,25 počáteční aktivity)může být vúząný enzym použit ke štěpení racemické směsi mnohonásobnš a v delším časovém období.V náslédujícim je předmět vynálezu vysvětlen na příkladech,které jej však nikterak neomezují..Jako zdroje amínoacylasy bylo použito vepřových ledvin,z nichž byl enzym získán známým postupom (S.M.Birnbaum,L. A Levintow,R.PKings 1 ey,J.B.Grienstain,J.Bío 1 Chém.194(1952) 455).Po lyofilísaci byl enzym jako suchý prášok uchováŕán V 1 ednici,aníž byla pozorována při skladování změna jeho aktivity. ąčástečně znečištěná ąminoacylasa připravena shora uvedeným postupem byla rozpuštěna v 0,1 mol/l fosfátovém pufru pH 7,0-8,5,byl přidán diamonium hydrogenfosfát v množství které bylo menší než odpovídá koncentraci,pří níž se začíná bílkovína srážet 2 roztoku a dále byl přidán makroporesni kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem (vylučovací limit 2 OO OOO - 700 0 O 0 velikost částic 100 až 200/um.epoxidační stupeň 1,5-2,0 mmol/g) a směs byla udržována při teplotě .o - 10 °C při občasném protřepáni po dobu 20 hodin. Po uplynutí reakční doby byl nosič odfíltrován a promyt roztokom Nacl 1,0 mol/l,roztokem substrátu a fosfá

MPK / Značky

MPK: C12P 13/04

Značky: opticky, způsob, výroby, aminokyselin, aktivních.alfa, směsi, racemických

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/7-240818-zpusob-vyroby-opticky-aktivnichalfa-aminokyselin-z-racemickych-smesi.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob výroby opticky aktivních.alfa. -aminokyselin z racemických směsí</a>

Podobne patenty