Stabilná a selektívna tvorba triplexov a duplexov hoogsteenovho typu s použitím zvinutých interkalačných nukleových kyselín (TINA) a proces prípravy TINA

Číslo patentu: E 15480

Dátum: 24.05.2006

Autori: Pedersen Erik Bjerregaard, Filichev Vyachelsav

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Vynález sa týka oblasti oligonukleotidov a modifikovaných oligonukleotidov so zlepšenými vlastnosťami, ako je schopnosť tvoriť trojité vlákna (triplexy) a vhodnosť na detekciu, diagnózu a/alebo liečbu.0002 Predložený vynález poskytuje hlavne nový flexibilný monomér na stohovanie s bázami, ktorý možno zabudovat do oligonukleotidu za vzniku oligonukleotidov tvoriacich triplexy (TFO). Tieto triplexy sú schopné špecificky viazat sekvenciu v cieľových dvojvláknových alebo jednovláknových nukleových kyselinách sdvojitým vláknom za tvorby trojitých závitníc sveľmi vysokou termálnou stabilitou. Ďalšie aspekty vynálezu sú spôsoby syntézy TFO a tiež ich použitie pri detekcii, diagnóze a liečbe.0003 Dokument WO 2005083084 opisuje interkalačné pseudonukleotidy,ktoré možno zabudovať do hlavného reťazca oligonukleotidu alebo analógu oligonukleotidu. Oligonukleotidy obsahujúce interkalačné pseudonukleotidy majú zníženú schopnosť tvoriť triplex, ale sú schopné odlišovať DNA od RNA,t.j. tvoria stabilnejšie komplexy s DNA než s RNA.0004 V článku Malakhov a kol, 2004, Eur. J. Org. Chem. 2004, 1298-1307,je opísaný monomér určený na zabudovanie do oligonukleotidu alebo analógu oligonukleotidu. Cieľom štúdie bolo poskytnúť prirodnú bázu, t.j. promiskuitnú bázu, ktorá môže správne zapadnúť do Watson-Crickovej závitnice do polohy protiľahlej voči akejkolvek báze vyskytujúcej sa v prirode. Neboli hlásené žiadne štúdie o tvorbe triplexov.0005 Sekvenčne špecifické rozpoznávanie dvojvláknovej DNA (dsDNA) je hlavnou témou vývoja oligonukleotidových nástrojov používaných v molekulárnej biológii, výskumu terapeutík a bionanotechnológii. Trojité závitnice sa tvoria, keď sa jednovláknový oligonukleotld tvoriaci triplex (TFO)viaže na dsDNA prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej štrbine. Tento proces bol hlavným predmetom intenzívneho výskumu genetického zameriavania. Tento prístup umožňuje transkripčnú kontrolu, génový knokaut a sekvenčne selektívne pôsobenie na genómovú DNA so zameraním na mutované alebo rekombinované gény.0006 Añnita tretieho vlákna oligonukieotidov TFO k zodpovedajúcim cieľom je všeobecne problematická, pretože je nutné, aby rozpoznávali homopurlnové sekvencie dsDNA, a tiež vzhľadom nato, že pH-senzitívna tvorba triplexov Hoogsteenovho typu (C-G-C) pri fyziologických podmienkach vparaielnom(pyrimidínovom) väzbovom motíve nie je preferovaná. Vminulom desaťročí bolo vynaloženého mnoho úsilia na výskum modifikácií TFO, ktorá by viedla k zlepšeniu väzbovej atinity kzodpovedajúcim cieľom, a súčasne dizajnu triplexových nukleobáz, ktoré by mohli mierniť reštrikciu sekvencie dsDNA. Oligonukleotidy nesúce modiñkované nukleové kyseliny, ako napr. peptidové nukleové kyseliny (PNA), uzamknuté nukleové kyseliny (LNA), 2-aminoetyloligoribonukleotidy (2-AE-RNA) a fosforamidáty N 3 - P 5 indukujúce zvýšenú väzbovú atinitu, patria medzi najúspešnejšie chemicky modifikované TFO. Stabilizácia triplexových štruktúr bola pozorovaná tiež po prídavku heterocyklických zlúčenín (interkalátorov), ktoré niekedy nesú kladne nabitý vedľajší reťazec, do vodného roztoku všetkých troch oligonukleotidových sekvencií. Bolo tiež ukázané, že kovalentné pripojenie interkalátora k 3-koncu alebo 5-koncu molekuly TFO viedlo k termálnej stabilizácii paralelných triplexov v rozmedzí teplôt 3,0 až 16,1 °C, pričom stabilita bola závislá od dĺžky spojky a typu interkalátora. Bolo však venované málo pozornosti kovalentne pripojeným interkalátorom, ktoré boli zabudované vydutou inzerciou do stredu molekuly TFO.0007 Tento dizajn by mohol mať niekoľko výhod. Prvou výhodou je fakt, že je treba syntetizovať len jeden fosforamidit interkalačných pseudonukleotidov,na rozdiel od syntézy aspoň štyroch nukleotidových monomérov potrebných na prípravu nukleových kyselín modifikovaných cukrami. Druhou výhodou by mohlo byť, že niekolko vydutých inzercií monoméru interkalátora do sekvencie by mohlo významne zvýšiť stabilitu duplexov a triplexov v porovnaní sostabilitou po jednej inzercii. Štruktúrny rozdiel medzi Watson-Crickovým a Hoogsteenovým väzbovým systémom a súčasne absencia alebo prítomnosť 2 OH v DNA a RNA navyše vedie k vzniku rôznych závitnic s rozdielnymi vlastnosťami. Predpokladá sa teda, že výsledkom vydutých inzercií spojky a rozlomenia závitnice interkalátormi by mohli byť špecifické vlastnosti vhodne vybraných závitníc. To viedlo k vzniku chemicky modifikovaných oligonukleotidov, ktoré by mohli rozlišovať rôzne typy jednovláknových nukleových kyselín.0008 Článok Christensen a kol., Nucleic Acids Research, sv. 30, č. 22, 15. november 2002, strany 4918-25, a dokument WO 03/051901 opisujú interkalačný pseudonukleotid (IPN), fosforamidit (S)-1-O-(4,4-dimetoxytrifenylmetyl)-3-O-(1-pyrenylmetyl)glycerolu, ktorý je inzertovaný do oligonukleotidov za vzniku interkalačných nukleových kyselín (INA).0009 Článok Christensen a kol., Nucleic Acids Research, sv. 30, č. 22, 15. november 2002, strany 4918-25, opisuje spôsob prípravy týchto IPN a dokument WO 03/051901 uvádza, že tieto zlúčeniny možno použiť ako modulátory transkripcie.0010 Výsledkom vydutej inzercie (R)-1-O-4-(1-pyrenyl-etinyI)fenyImetyIglycerolu do stredu molekúl homopyrimidínových oligodeoxynukleotidov(zvinuté interkalačné nukleové kyseliny, TINA), ktorá bola uskutočnená postsyntetickou Sonogashirovou kaplingovou reakciou, viedla k vzniku triplexov a duplexov Hoogsteenovho typu s výnimočne vysokou termálnou stabilitou,zatial čo duplexy Watson-Crickovho typu s rovnakým nukleotidovým obsahom sú destabilizované.0011 V prvom aspekte predložený vynález poskytuje flexibilný monomér na stohovanie s bázami so všeobecnou štruktúrouX-L-h-C-Iz, kde časť X je monomérna jednotka, ktorú možno zabudovať hlavného reťazcaoligonukleotidu alebo analógu oligonukleotidu, alebo PNA alebo analógov PNA,časť L je spojka, časť I 1 je prvý interkalátor obsahujúci aspoň jeden esenciálne planárny konjugovaný systém, ktorý je schopný interagovať s nukleobázami DNA, RNA alebo ich analógmi tzv. stohovaním (stacking), časť C je konjugátor a časť | 2 je druhý interkalátor obsahujúci aspoň jeden esenciálne planárny konjugovaný systém, ktorý je schopný interagovať s nukleobázami DNA, RNA alebo ich analógmi tzv. stohovaním.0012 Flexibilný monomér na stohovanie s bázami sa skladá z aspoň dvoch interkalačných systémov l. a ĺz, ktoré sú spojené konjugátorom C, ktorý zaisťuje nevyhnutnú štruktúrnu rigiditu a flexibilitu pri otáčaní. Predpokladá sa, že táto flexibilita je dôležitá, pretože uľahčuje interkalátorom zaujať vhodnú polohu vo vnútri závitnice nukleovej kyseliny.0013 Vo výhodnom uskutočnení je možné časť X zabudovať do oligonukleotidu DNA, RNA, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2 NH)-TNA, (3-NH)-TNA, a-L-ribo-LNA, a-L-xyIo-LNA, B-D-ribo-LNA, B-D-xyloLNA, 3.2.1-LNA, bicykIo-DNA, B-amino-bicyklo-DNA, 5-epi-bicyklo-DNA, dbicyklo-DNA, tricyklo-DNA, bicykIo 4.3.0-DNA, bicykIo 3.2.1-DNA, bicyklo 4.3.0 amid-DNA, B-D-ribopyranozyI-NA, a-L-IyxopyranozyI-NA, 2-R-RNA, 2 OR-RNA, 2-AE-RNA, a-L-RNA, B-D-RNA a kombinácii a moditikácii týchto látok.0014 Nukleové kyseliny a ich analógy poskytujú oligonukleotid, ktorý môže viazať komplementárne nukleové kyseliny prostredníctvom Watson-Crickovho alebo Hoogsteenovho alebo reverzného Hoogsteenovho párovania báz. Časť X možno pripojit na 3-koniec a/alebo 5-koniec a/alebo zabudovať do stredu sekvencil. Za ďalšie modifikácie nukleových kyselín možno považovať modifikované nukleobázy, karbohydráty a peptidové reťazce. Nukleové kyseliny možno tiež viazať na magnetické guľôčky, agarózové guIôčky, sefarózové gulôčky, sklo, plastové povrchy, ťažké kovy a povrchy čipov.0015 Vinom uskutočnení monomerna jednotka X vhlavnom reťazci obsahuje alkyléndiol, ako napr. etylénglykol alebo 1-0-metylénglyceroI, pričom alkyléndiolová časť môže byť prípadne súčasťou kruhového systému, napr.

MPK / Značky

MPK: C07H 21/00, C12N 15/11

Značky: selektívna, interkalačných, duplexov, nukleových, triplexov, hoogsteenovho, tvorba, zvinutých, tina, kyselin, přípravy, stabilná, proces, použitím

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/69-e15480-stabilna-a-selektivna-tvorba-triplexov-a-duplexov-hoogsteenovho-typu-s-pouzitim-zvinutych-interkalacnych-nukleovych-kyselin-tina-a-proces-pripravy-tina.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Stabilná a selektívna tvorba triplexov a duplexov hoogsteenovho typu s použitím zvinutých interkalačných nukleových kyselín (TINA) a proces prípravy TINA</a>

Podobne patenty