Molekuly na transport modulárnych antigénov (MAT-molekuly) na moduláciu imunitných reakcií, príslušné konštrukty, spôsoby a použitia

Číslo patentu: E 1866

Dátum: 11.10.2002

Autori: Flückiger Sabine, Lamping Norbert, Crameri Reto, Daigle Isabelle

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa zaoberá stimuláciou a inhibovaním imunitného systému za účelom profylaxie,terapie alebo diagnostiky ochorení, ktoré sú spojené s nedostatočne silne stímulovaným alebo s nadmeme stímulovaným imunitným systémom. K týmto ochoreniam patria okrem iného infekčné choroby, nádorové ochorenia, alergie, autoimunimé choroby, obranné reakcie odmietnutia transplantátu atď. Jadro vynálezu je novodobý spôsob, pri ktorom sa imunitný systém ovplwňuje podaním MAT-molekuly, ktorá pozostáva z minimálne troch nasledujúcich zložiek1. translokačný modul, ktorý spôsobuje, že MAT-molekula môže preniknúť zvonku do bunky, 2. intracelulárny usmerňovací modul, ktorý spôsobuje, že MAT-molekula môže byť vnútri bunky spracovaná takým spôsobom, že dôjde k zmenenej imunitnej odpovedi prípadne k zmenenej prezentácii antigénu a3. antigénový modul, ktorý určuje špecifickosť modulovanej imunitnej odpovede.Kombinácia týchto troch prvkov V jednej MAT-molekule, ako je definovaná podľa vynálezu, umožňuje cíelenú, špecifickú moduláciu imunitného systému ošetrovaného jedinca,prípadne umožňuje zmenenú prezentáciu antigénu bunkou prezentujúcou antigén.Stav techniky Spracovanie antigénov bunkami prezentujúcimi antigénSpracovanie antigénov bunkami prezentujúcimi antigén (APC) sa uskutočňuje dvomi rôznymi cestami. Intraceluláme prichádzajúce antigény sú prezentované molekularní MHC I (Major Histocompatibility Complex class I, MHC class I) na povrchu bunky, zatiaľ čo extracelulárne antigény sú na povrchu bunky prezentované molekulami MHC I (Major Histocompatibility Complex class II, MHC class II). Obidva mechanizmy iniciujú imunitnú reakciu hostiteľa na antigén. Cesta, ktorou prechádza antigén od vstupu do bunky až po prezentáciu na povrchu bunky vo forme komplexu MHC II - antigén, prechádza cez rôzne bunkově organely, okrem iného cez endoplazmatícké retikulum, cez Golgiho aparát, cez trans-Golgiho systém, lyzozómy, endozómy a cez MHC class II compartments (MIIC). U prezentácie antigénu sprostredkovanej cez MHC II majú dôležitú úlohu MIICs. V týchto organelách bunky sa obsadzujú molekuly MHC II s nízko molekulovými antigénmi alebo s proteolytickýmí fragmentmi proteínov. Pri tomto procese budú proteolyticky odbúrané Invariant Chain (nazývané aj MHC II gama-reťazce alebo li) naviazané na počiatku na molekulu MHC II a za regulácie rôznych proteínov, ktoré priamo alebo nepriamo viažu na MHC Il, bude antigén naviazaný na molekulu MHC II 1. K týmto regulačným molekulám patria okrem iného HLA-DM, HLA-DO, LAMP-l, LAMP-2, CD 63, CD 83 atď. Presná funkcia týchto proteínov je doteraz čiastočne nejasná, ale mnohé z nich vykazujú sígnálne sekvencie, ktoré podporujú ich transport k lyzozómom, k endozómom, k trans-Golgiho systému, k MIICs atď. 2-4. U proteolytických reakcií, ktoré sú nevyhnutné na to, aby mohol byť antigén prezentovaný na molekulách MHC II, hrá dôležitú úlohu široký rad proteáz. K proteázam, ktoré sú prítomné V MIIC,patria okrem iného zástupcovia skupiny katepsínov, ako napríklad katepsín S a katepsín L 1.Aminokyselinové sekvencie, ktoré majú vlastnosť cielene sa hromadiť vo vnútri alebo zvonka bunky na určitom mieste alebo V určitej bunkovej organele, sa často označujú ako usmerňovacie sekvencie. Pritom je potrebné zdôrazniť, že rôzne typy cielenej distribúcie(targetingu) môžu byť rôzne. Odlišné sú najmä intracelulámy a extracelulámy targeting. Na extracelulámy targeting sa používajú napríklad protilátky, ktoré viažu zvonku na priamo prístupné štruktúry na povrchu bunky, napriklad na extracelulámy podiel membránových proteínov. Protilátka, ktorá viaže proteín na povrchu nádorovej bunky, môže byt spojená napríklad cytoxínom. Táto protilátka spôsobuje potom extracelulárny targeting cytoxínu do nádorovej bunky, čím je2 možné túto cielene zničiť. Tento typ targetingu je principiálne odlišný od intracelulámeho targetingu, pri ktorom je často potrebne prekonať intraceluláme membrány alebo pri ktorom je usmerňovacia sekvencia viazaná intracelulámymi receptorrni a takto napriklad vniká do určitých bunkových organel alebo pri ktorom preniká usmerňovacia sekvencia cez špeciálny kanál vytvorený špeciálnymi proteínmi do bunkovej organely, pre ktorú je usmerňovacia sekvencia špecifická. Ak sa bude v nasledujúcom texte predloženej patentovej prihlášky hovoriť o usmerňovacej sekvencii alebo o usmerňovacom module, potom sa tým principiálne vždy myslí intracelulárny targeting a nie extracelulámy targeting. Okrem toho sa v predloženej patentovej prihláške pod pojmom targeting nemyslí akýkoľvek typ intracelulárneho targetingu, ale len taký intracelulámy targeting, ktorý slúži na prenos molekuly k organele alebo do intracelulámych oblastí, ktoré sa podieľajú na spracovaní,ďalšom spracovaní a/alebo naviazaní antigénov na molekulách MHC. Takéto organely alebo intraceluláme oblasti sú napríklad endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, trans-Golgiho systém, endozómy, lyzozómy a MlICs. Zodpovedajúce intraccluláme usmerňovacie sekvencie sú pre rôzne proteíny opísané v literatúre 1-5.V US 5,633,234 je napriklad opísaný DNA-konštrukt, ktorý obsahuje lyzozomálnu usmerňovaciu sekvenciu, transmembránovú sekvenciu a antigénovú doménu.Ďalej sú z literatúry známe početné aminokyselinové sekvencie, najmä pochádzajúce z vírusov, napriklad HlV-tat alebo protein VP 22 pochádzajúci z vírusu Herpes Simplex, ktoré podporujú transport proteínov, peptidov a iných tried látok, ako sú napríklad nukleové kyseliny alebo farmaceutický účinné látky, do vnútra buniek. Na tento účel sa tieto takzvané translokačné sekvencie naviažu na transportované molekuly (nazývané aj cargo-molekuly) bud cez kovalentné alebo cez nekovalentné väzby. Výsledné zlúčeniny zložené z translokačnej sekvencie a cargomolekuly môžu byť potom extraceluláme premiestnené k bunkám. Translokačná sekvencia potom spôsobi, že sa cargo-molekula dostane do vnútra bunky. Tento princíp je popísaný v mnohých prácach, najmä pre sekvenciu HIV-Tat 6-8.Aj keď už bolo možne a navrhované použiť ako cargo-molekulu antigén, nebolo pomocou samotných známych translokačných prostriedkov ešte možne cielené a dávkované vytvorenie imunitnej odpovede jedinca, ako by to bolo žiaduce pre určité úlohy - napríklad pre alergiologickú desenzibilizáciu. Z tohto dôvodu existuje potreba iného spôsobu cielenej imunitnej modulácie.Rodriguez F. a ďalší, J. Virol., 2001, 75 (21), strany 10421-10430, opisuje DNA-vektory na transfekciu buniek. Tieto DNA-vektory obsahujú konštrukty, ktoré obsahujú lyzozomálnu usmerňovaciu sekvenciu (Limp 2). Ďalej boli použité LCMV-epitopy, ktoré sú známe ako molekuly MHC triedy II.Van Bergen J. a ďalší, imunool. Rev., 1999, 172, strany 87 až 96, zhŕňa vedomosti z oblasti targetingu antigénov do roku 1999. Podľa tohto sa na targeting antigénov k molekulám MHC Il používajú dve rozdielne stratégie, použitie DNA-konštruktov a cielený príjem antigénov do APC sprostredkovaný receptormi, ktoré exprimujú zodpovedajúce receptory.Sheldon K. a ďalší, Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., 1995, 92 (6), strany 2056 až 2060, sa týka použitia loligomérov. Tam opísané molekuly umožňujú import určitých sekvencií z extracelulámej oblasti do bunkového jadra.Úlohou predloženého vynálezu bolo pripravenie prostriedkov umožňujúcich cielené privedenie najrozličnejšich a ľubovoľných alergénov na miesto ich pôsobenia, aby bolo toto možné využiť ešte lepšie terapeuticky a diagnosticky. Podstata vynálezuVynález poskytuje molekuly a spôsob, ktoré umožňujú veľmi cielené privedenie antigénov k bunkám za účelom dosiahnutia efektívnej, špecifickej imunitnej reakcie. Spôsob ako prvé-3 umožňuje efektívne premíestnenie antigénov z extracelulárneho priestoru do intracelulámeho bunkového priestoru a za ďalšie umožňuje, aby sa antigény, keď sú vo vnútri bunky, efektívne dostali k bunkovým organelám, v ktorých sú ďalej spracovávane pre prezentáciu antigénu. Tento dvojstupňový proces môže byť celkom sám využitý na cielenú, efektívnu moduláciu imunitnej reakcie určitého jedinca.Ako nástroj na docielenie týchto účinkov boli vyvinuté špeciálne molekuly, ktore sa v nasledujúcom texte tejto patentovej prihlášky označujú ako molekuly na transport modulámych antigénov alebo MAT-molekuly. Tieto MAT-molekuly, príslušné nukleové kyseliny, vektory,bunky, bunkové línie, vezíkuly, imunoglobulíny ako aj použitia a spôsoby prislúchajúce k vynálezu,ktoré sa vzťahujú k týmto zložkám alebo s nimi pracujú, sú bližšie vyznačené v nárokoch.Na vyriešenie úlohy je navrhovaná doteraz ešte nikdy neopísovaná kombinácia minimálne troch modulov tvoriaca novodobú kategóriu molekúl, ktoré sa označujú aj ako MAT-molekuly(molekuly na transport modulámych antigénov). Tieto tri moduly zahŕňajú minimálne jeden translokačný modul, minimálne jeden usmerňovací modul a minimálne jeden antigénový modul,ako sú definované v nárokoch. Tieto tri rôzne moduly môžu byť vzájomne spojené pomocou kovalentnej väzby. Takto vytvorená MAT-molekula môže byť priamo podaná jedincovi, ktorého imunitná reakcia má byť ovplyvnená proti antigénu obsiahnutému v MAT-molekule. Altemativne je možné pomocou MAT-molekúl ošetrenie aj bunky in vitro a týmto spôsobom ošetrené bunky môžu byť následne podané jedincovi. U tohto spôsobu spôsobujú translokačné moduly, že MAT-molekula môže preniknút do bunky, usmerňovacie moduly spôsobujú, že MAT-molekula je intracelulárne tak spracovaná, že nastane imunitná odpoveď a je zistená identita antigénov v antigénových moduloch,proti antigénom ktorých je smerovaná imunitná reakcia. Podstatnou výhodou tohto nového spôsobu modulácie imunitnej odpovede jedinca je predovšetkým jeho univerzálna použiteľnosť, t.j. je možné pracovať pomocou najrôznejších antigénov, rôznych translokačných modulov a rôznych usmerňovacích modulov. Okrem toho má použitie translokačného modulu za následok, že spôsob nie je tkanivovo alebo bunkovo špecifický, ale že je univerzálny pre účely imunitnej modulácie takmer všetkých typov buniek. Ďalšou výhodou je modulová konštrukcia MAT-molekuly. Modulová konštrukcia umožňuje rýchle prispôsobenie MAT-molekuly na príslušné medicínske požiadavky. Presné usporiadanie troch zložiek MAT-molekuly a spôsob ich vzájomného pospájania sa môže meniť dovtedy, pokiaľ je v MAT-molekule obsiahnutý vždy minimálne jeden modul všetkých troch typov molekúl. Ďalej môžu byť prítomné príslušné moduly v MAT-molekule Nterminálne, C-terminálne alebo inteme. Ohľadom antigénov neexistuje z dôvodu spôsobu žiadne obmedzenie. Spôsob môže byť použitý napríklad na aktiváciu imunitného systému určitého jedinca proti pôvodcom ochorenia, ako napríklad proti vírusom, baktériám, parazitom atď., t.j. úplne všeobecne ako Očkovacia látka. Okrem toho môže byť spôsob použitý na aktiváciu imunitného systému proti degenerovaným bunkám, ako sú napríklad nádorové bunky atď. Na druhej strane je možné ho ale aj použiť na zníženie senzibility imunitného systému určitého jedinca proti alergénom ako sú napríklad pele, Zvieracie chlpy, domáce roztoče, jedy hmyzu atď. alebo na cielené potlačenie imunitného systému napríklad pri existencii autoimunitnej reakcie ako sú napríklad artritída, reuma,diabetes, SLE (systemic lupus erythematosus) atď. a na potlačenie obranných reakcií odvrhnutía transplantátu. Taktiež je možné pomocou MAT-molekúl podľa vynálezu liečiť choroby, ktoré nie sú výslovne uvedené, ktoré sú spojené s príliš silnou alebo príliš slabou imunitnou reakciou.V stave techniky bolo doteraz za veľmi nevýhodné pokladané to, že translokačné sekvencie nie sú špecifické pre určité typy buniek, ale sú rovnako účinné proti všetkým typom buniek. 9. Univerzálna funkčnosť translokačných modulov je ale v predloženom vynáleze veľkou výhodou,ktorý doterajší stav techniky nerozpoznal. V doterajšom stave techniky existovalo často úsilie chránit cargo-molekuly vnesené pomocou translokačných sekvencií do buniek pred proteolytickým odbúravaním v bunke 9. V predloženom vynáleze je toto naopak vyslovene žiaduce a výhodné pre spôsob fungovania vynálezu. Proteolytické odbúranie antigénových modulov v bunke je pre fungovanie vynálezu, t.j. pre účinnú prezentáciu antigénu, výhodné. Preto sa používajú v rámci predloženého vynálezu usmerňovacie moduly, ktore cielene podporujú transport antigénových modulov do bunkových kompartimentov, kde sú proteolytícky odbúrané.Známe amínokyselinové sekvencie, ktoré je možné v zmysle vynálezu použiť ako translokačný modul, sú sekvencie HIV-Tat a VP 22. Pre tieto sekvencie bolo uvedené, že podporujúaj translokáciu cez bunkovú membránu aj transport do bunkového jadra 7. Tento transport do bunkového jadra je V súvislosti s predloženým vynálezom nežiaduci, pretože V bunkovom jadre sa nemôže uskutočniť žiadne ďalšie spracovanie antigénov a z tohto dôvodu nemôže nastať efektívna prezentácia antigénu. Tento doteraz nevyriešený problém bol v rámci predloženého vynálezu vyriešený pomocou usmerňovacieho modulu, ktorý spôsobuje to, že MAT-molekula nie je intraceluláme transportovaná do bunkového jadra, ale cielene je transportovaná do organel, v ktorých sa môže uskutočniť ďalšie spracovanie antigénov alebo naplnenie molekúl MHC antigénom. Intracelulámy translokačný modul MAT-molekuly podľa vynálezu takto odstraňuje podstatnú nevýhodu, ktorú vykazovali fúzne proteíny s antigénom Tat známe zo stavu techniky.V doterajšom stave techniky sú známe aj fúzne proteíny pozostávajúce z jednej usmerňovacej sekvencie, napríklad z invariantného reťazca molekuly MHC II, a jedného antigénu. Tieto fúzne proteíny nie sú ale schopné efektívne preniknúť do buniek prezentujúcich antigén. Na tento účel sú pri ich použití na imunizáciu určitého jedinca potrebné dodatočné adjuvans, ktoré podporujú absorpciu fúzneho proteínu v bunke. Tieto adjuvans, ako napríklad minerálne oleje,mykobakteriàlne extrakty alebo Freundove adjuvans majú ale neželané vedľajšie účinky, ako sú napríklad lokálne zápalové reakcie. Altematívne bolo rozmýšľané nad stratégiou DNA-vakcinácie,ako je to napríklad uverejnené v US 5,633,234. Tiež pri tomto použití musí DNA-konštrukt byť do buniek vnesený pomocou pomocných prostriedkov, ako je Vektor alebo transfekcia. MAT-molekuly použité teraz v predloženom vynáleze majú oproti bežným očkovacím látkam tú výhodu, že sú priamo spojene s fyziologicky vysoko prijateľným translokačným modulom, ktorý veľmi účinne podporuje absorpciu v bunkách. Vďaka tomuto je možné za určitých okolností sa úplne alebo čiastočne vzdať použitia dodatočných adjuvans. Toto má za následok, že sa pri imunizácii pomocou MAT-molekúl vyskytuje podstatne menej neželaných vedľajších účinkov. Už dlho je známe, že antigény prezentované extraceluláme alebo intracelulárne MHC l vedú k cytotoxickej imunítnej odpovedi, nie ale k silnej protektívnej humorálnej imunítnej odpovedi. Použitím MAT-molekúl môžu byť ale antigény obsiahnuté v antigénovom module pridávané extraceluláme, ale pôsobia ako intraceluláme antigény, pretože translokačný modul prenesie antigén do intracelulámeho priestoru a translokačný modul ovplyvňuje intracelulámy transport antigénu takým spôsobom, že dochádza k humorálnej imunítnej odpovedi. Týmto novodobým spôsobom je možné pomocou extraceluláme pridaných antigénov (MAT-molekúl) dosiahnut silnú indukciu humorálnej imunítnej odpovedi, o ktorú sa už roky usilovalo.Podrobný opis vynálezu Translokačné sekvencie / translokačné modulyPojmy translokačná sekvencia a translokačný modul budú v texte predloženého vynálezu používané rovnocenné a s rovnakým významom súčasne. Pojem translokačný modul bol zavedený na vysvetlenie, že translokačné moduly sú len jednou časťou MAT-molekuly v zmysle podľa vynálezu. Okrem toho nepredstavujú translokačné moduly len translokačnú peptidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode, ako je napríklad HIV-tat, ale aj napriklad peptidomimetiká alebo ine štruktúry, ktoré môžu prevziať rovnakú funkciu ako translokačné peptidové sekvencie vyskytujúce sa v prírode.Vynález zahŕňa aj použitie rôznych translokačných modulov, ako sú definované v nároku l,na výrobu MAT-molekúl, ktoré pozostávajú z minimálne jedného translokačného modulu, z minimálne jedného usmerňovacieho modulu a z minimálne jedného antigénového modulu. Všeobecne sú na použitie v zmysle predloženého vynálezu vhodné všetky v súčasnosti známe a v budúcnosti objavené translokačné sekvencie. V literatúre je opísané množstvo vhodných translokačných sekvencií. K týmto translokačným sekvenciám patria vírusové sekvencie,homeoproteínove sekvencie, sekvencie Leucine Zipper, sekvencie bohaté na arginín a lyzín ako aj rôzne iné sekvencie z proteínov, ktore napriek chýbajúcej sekrečnej signálnej sekvencii môžu byť secemované atď.Vírusové peptidové sekvencie, ktoré sú vhodné ako translokačné moduly

MPK / Značky

MPK: A61K 39/00, C12N 15/62

Značky: imunitných, použitia, konštrukty, příslušné, molekuly, transport, antigénov, mat-molekuly, spôsoby, modulárnych, moduláciu, reakcií

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/65-e1866-molekuly-na-transport-modularnych-antigenov-mat-molekuly-na-modulaciu-imunitnych-reakcii-prislusne-konstrukty-sposoby-a-pouzitia.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Molekuly na transport modulárnych antigénov (MAT-molekuly) na moduláciu imunitných reakcií, príslušné konštrukty, spôsoby a použitia</a>

Podobne patenty