Fúzne polypeptidy a ich využitie pri antivaskulárnej liečbe nádorových ochorení

Číslo patentu: E 13285

Dátum: 20.08.2004

Autori: Berdel Wolfgang, Mesters Rolf

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Fúzne polypeptidy a ich využitie pri antivaskulárnej liečbe nádorových ochorení.Opis 0001 Predkladaný vynález sa týka fúznych polypeptidov, ktoré sa skladajú z minimálnedvoch peptidov. Prvý z peptidov pozostáva z 3 až 30 aminokyselín a umožňuje selektívne naviazaníe fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev nádorov. Druhý peptid je tvorený tkanivovým faktorom TF (Tissue Factor) alebo jeho fragmentom, pričom sa faktor aj fragment vyznačujú tým, že pri naviazaní fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev zásobujúcich nádor dokážu aktivovať proces zrážania krvi. Tieto dva peptidy môžu byť spojené bud bezprostredne alebo pomocou linkerov, skladajúcich sa až z 15 aminokyselín. Náš vynález sa ďalej týka využitia fúznych proteínov pri antivaskulámej terapii nádorových ochorení ako aj ichvyužitia pri výrobe liečiv na terapiu nádorových ochorení. Doterajší stav techniky0002 Predpokladom pre progresívny rast nádoru je jeho adekvátna neovaskularizácia. Neoangiogenéza je potrebná predovšetkým na udržanie expanzívneho rastu nádoru, pretože len tak môže byť zabezpečené dostatočné okysličovanie, zásobovanie nádoru živinami aodstraňovanie odpadových produktov nádoru.0003 Na boj s nádormi boli s rozvojom technológie popri antiangiogéznych stratégiách terapie, ktoré zasahujú do komplexných procesov rastu a diferencíácie ciev, vyvinuté aj antivaskulárne stratégie, ktoré sa zameriavajú na rozrušenie ciev zásobujúcich nádor, čim sa0004 Predpokladom tohto postupu je identifikácia cieľových štruktúr v cíevnom endoteli nádoru, ktoré sa nevyskytujú v zdravých endotelových bunkách normálneho tkaniva. Tieto špecifické štruktúry môžeme použiť, ak chceme pôsobiť cytostatikami alebo určitými toxínmi na bunky endotelu ciev zásobujúcich nádor a menej na nádor samotný. Cieľovými štruktúrami,ktoré je možné využiť na tento účel, sú bFGF (basic fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) a VEGF receptor 2 (VEGFR-2), endoglín, endosialín, izoforrna ñbronektínu (ED-B doména), integríny (IVB 3, (M 35, mB a (1152, aminopeptidáza N, NG 2 proteoglykán a matrixové metaloproteinázy 2 a 9 (MMP 2 a 9) (2-13). Arap et al. (8) napríkladspojili peptidy špecificky sa viažuce na alpha -integrín s účinnou látkou, ktorá bola v zavedenejtechnológii využívaná na chemoterapiu (doxorubicín). Modelové pokusy na zvieratách ukázali, že antineoplastické účinky doxorubicínu sa po naviazaní na peptidy zlepšili.0005 Antivaskuláma terapia môže byť využitá aj na selektívnu aktiváciu zrážania krvi v cievach zásobujúcích nádor, čo má za úlohu vyvolať nekrózu tumoru. Napríklad bol vytvorený bišpeciñcký fragment protilátky F(ab)2, ktorý je nasmerovaný proti rozpustnému tkanivovému faktora (truncated tissue factor, tTF) a antigénu MHC triedy II. Po experímentálnej indukcíi antigénu v endotelových nádorových bunkách bola uskutočnená antivaskuláma terapia podaním protilátky na modeli myšieho neuroblastómu (14 a 47). V inej štúdii toho istého tímu bol nasadený imunokonjugát, ktorý cielene viaže tTF na prirodzene sa vyskytujúci market0006 Vo veľmi podobnom experimente bol ñagment protilátky (scFv) špeciñcký pre onkofetálnu doménu ED-B spojený do fúzie s tTF. Vytvorené fúzne proteíny, scFv-tTF, viedli kúplnému a zároveň selekčnému infarktu rôznych nádorov u myší. (16).0007 Alternatívne bol tTF navíazaný na inhibítor membránového antigénu špecifického pre bunky prostaty (l 7). Tento fúzny proteín po vnútrožilovom podaní indukoval selekčnú nekrózu prostaty u myší. Aplikácia tohto proteínu viedla v kombinácii s nízkou dávkou cytotoxickej látky (doxorubicín) k masívnej regresii nádoru až k jeho úplnej eradíkácii. Iné tTF-ñizne proteíny pozostávajúce z protilátkových fragmentov proti VEGFR, endoglínu a VCAM-l boli taktiež v krátkosti opisané (18).0008 Molekuly v súčasnosti využívané na antivaskulámu nádorovú terapiu vykazujú však isté nedostatky. Predovšetkým je nutné vychádzať z faktu, že tieto molekuly sú na základe ich veľkosti imunogénne. Ich nasadenie na liečbu u cicavcov vyvolá preto imunitnú reakciu proticieľovej molekule, čím je znemožnené ich opakované podanie.0009 Veľkosť väzbového partnera, prostredníctvom ktorého má byť peptidová časť komplexu zodpovedná za aktiváciu zrážania krvi namierená na nádorové tkanivo, môže tiež brániť naviazaniu makromolekulámeho enzým-substrátového komplexu faktora VIIa/FX potrebného na zrážanie krvi. Vytvorenie komplexu môže byť obmedzené, aj pokiaľ peptid aktivujúci zrážanie krvi zmení svoju konfonnáciu pod vplyvom svojho relatívne veľkého0010 V súčasnosti (W 0 03/035688) sú ďalej známe fúzne polypeptídy, V ktorých je selektívna väzbová doména, napr. ñbronektínová doména viažuca sa na íntegriny, ako sú napr. RGD-peptidy, alebo dipeptid D-B-E, ktorý sa viaže na PSMA (membránový antigén špecifický pre prostatu), pripojená na N-terminálny koniec polypeptidu tkanívového faktora. Napriek tomu, že boli pri in vitro pokusoch zaznamenané amidolytické a proteolytické účinky,vykazovali in vivo konštrukty, aj v kombinácii s faktorom VIIa len slabé protinádorové účinky.Až v kombinácii s doxycyklínom prežívali zvieratá dlhšie.0011 Hu et al. (46) opisujú rôzne fúzne proteíny a ich využitie na vytvorenie trombózy v nádorových cievach, o.i. fúzny protein skladajúci sa z oligopeptidu tvoreného 9 aminokyselinami, ktorý obsahuje sekvenciu RGD, a skrátenej formy tkanívového faktora. Aj tu sú RGD-peptidy pripojené na N-koniec tTF, za vzniku RGD-tTF. Analýzy funkčnosti preukázali, že fúzne proteíny obsahujúce RGD nespôsobovali signiñkantné blokovanie0012 Konštrukty známe v súčasnosti sú preto vytvorené tak, že selekčná väzbová oblasť je spojená s N-koncom peptidu tkanívového faktora. Odborníci dokonca zdôrazňujú nutnosť voľby práve tohto stavebného modelu, pretože N-koniec je na základe svojej štruktúry obzvlášť vhodným miestom pre väzbu, ktorá nebráni iniciácii trombózy.0013 Vzhľadom na stav techniky vyvstáva úloha poskytnúť altematívne trombogénne účinné látky, ktoré by dokázali efektívne blokovať rast nádoru in vivo.0014 Tento problém bol v tomto prípade vyriešený pomocou fúznych polypeptidov, ktoré obsahujú jeden peptid s veľkosťou 3 - 30 aminokyselín, ktorý umožňuje selektívne naviazanie fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev zásobujúcich nádor, a tkanivový faktor TF(tissue factor) alebo jeho fragment, pričom sa tkanivový faktor aj ůagment vyznačujú schopnosťou aktivácie zrážania krvi pri naviazaní fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev zásobujúcich nádor, pričom sú tieto peptidy spojené buď bezprostredne alebo cez linker pozostávajúci až z 15 aminokyselín. Pritom je peptid, ktorý umožňuje selektívne naviazanie fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev nádoru, naviazaný na C-koniec peptidu, ktorý aktivuje zrážanie krvi pri naviazaní fúzneho polypeptidu na endotelové bunky ciev nádoru. Daný vynález sa ďalej týka liečiv, ktoré obsahujú zodpovedajúce fúzne polypeptídy, a ichvyužitia na liečbu nádorov.Obr. l Schematické zobrazenie väzby fúznych proteínov tTF-RGD a tTF-NGR na avBg a CD 13.(aminopeptídázu N) je dosiahnutá nádorová selektívita. Tieto receptory sú selektívne a špeciñcky vysoko exprimované v endotelových nádorových bunkách, ale nie v zdravých endotelových bunkách nonnálneho tkaniva (okrem malého počtu výnimiek). Zobrazenie fúznych proteínov je veľmi schematické a nemožno z neho vyvodzovať žiadne záveryohľadom ich prímárnej sekvencie.SDS-PAGE a westem-blot analýza rekombinantného ÍTF 1.21 s a tTF fúzneho proteínu. Čistota tTF a tTF fúznych proteínov po extrakcii z E.colí (BL 21 DE 3) a refoldíngu pomocou lineámeho gradiendu močoviny (6 M - lM) bola kontrolovaná pomocou SDSPAGE a následným farbením Coomassie-blue. Identita proteínov bola overená pomocou westem blotu za využitia anti-Tissue-Factor-protilátky (klon VIC 7, American Diagnostics). Vzorky v jednotlivých dráhach ltTF 2 tTF-RGD 3 tTF-NGR 4 tTFcycloNGRl 5 tTF-cycloNGR 2 6 tTF-cycloNGR 3 7 tTF-GALNGRSHAG M štandard molekulových hmotnosti.Stanovenie Michaelisovej konštanty (Km) pre aktiváciu FX pomocou FVIIa/tTFLm príp. fúznych proteínov FVIIa/tTF 1.g.3. Parametre Michaelis-Mentenovejkinetiky boli vypočítaná pomocou Rufovej metódy (45).Väzba tTF, tTF-RGD a tTF-NGR na (1433 integrín. Väzba 0,1 M tTF, tTF-RGD a tTFNGR na imobilizovaný avĺš bola kvantifikovaná v ELISA teste pomocou polyklonálnych protilátok proti ľudskému TF (American Diagnostica). Výsledky súk znázomené ako medián a interkvartilový rozsah. Rozdiely väzby medzi tTF-RGD a tTFpríp. medzi tTF-NGR a tTF boli štatisticky signiñkantné (p 0,00 l, Mann-Whitney test).Špecificita väzby tTF-RGD na avB 3 integrín. Väzba tTF-RGD (O,1 M) na imobilizovaný avfig bola signiñkantne blokovaná prostredníctvom kompetitivnej inhibície syntetickým peptidom GRGDSP (l-10 M) (p 0,00 l, Mann-Whitney-test pre obe koncentrácie RGD peptidov).

MPK / Značky

MPK: C07K 19/00, C07K 14/745, A61K 38/36

Značky: fúzne, nádorových, ochorení, využitie, polypeptidy, antivaskulárnej, liečbe

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/65-e13285-fuzne-polypeptidy-a-ich-vyuzitie-pri-antivaskularnej-liecbe-nadorovych-ochoreni.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Fúzne polypeptidy a ich využitie pri antivaskulárnej liečbe nádorových ochorení</a>

Podobne patenty