Inhibítory apoptózy a ich použitie

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložená patentová prihláška si nárokuje prioritu z medzinárodnej patentovej prihlášky čPCT/lB 2010/003158, podanej 18. novembra 2010, ktorá je tu kompletne zahrnutá jej citáciou.Oblasť vynálezu 0002 Vynález sa týka inhibltorov apoptózy a ich použití, najmä na medicínske terapie. Doterajšl stav techniky0003 Koronárne srdcové ochorenie je hlavnou príčinou smrti na celom svete, pričom každoročne spôsobuje 3,8 milióna úmrtí mužov a 3,4 milióna úmrtí žien. Keďže populácie starnú a majú stále viac sprievodných ochorení (napr. obezítu a metabolický syndróm), ischemická srdcová choroba predstavuje v dnešnej dobe enormnú záťaž pre verejné zdravotníctvo a pravdepodobne sa táto záťaž bude ešte zvyšovať (zhrnutie v Yellon et al, N Engl J Med, 2007 357 1121-1135).0004 Ako koronáma srdcová choroba sa označuje zlyhanie koronárnej cirkulácie zabezpečujúcej adekvátne zásobovanie srdcového svalu a okolitého tkaniva krvou. Najbežnejšou príčinou koronámej srdcovej choroby je akumulácia ateromatóznych plakov (tzn. tukových depozítov) v cievach koronámych artéril. Oklúzia koronárnej artérie obmedzuje prietok krvi srdcom, čo vedie k ischémii myokardových buniek (tzn. bunky hladujú v dôsledku nedostatku kysllka) a môže viesť k myokardovej bunkovej smrti, ktorá sa nazýva infarkt myokardu (IM), alebo k akútnemu infarktu myokardu (AIM),ktoré sa spoločne nazývajú srdcový atak. AIM je hlavnou príčinou úmrtí aj v Európe, aj v USA, a je častou (viac ako 1,5 miliónov nových prípadov ročne v USA) a hendikepujúcou chorobou (vedie k zlyhaniu srdca). Rozsah infarktu je hlavnou determinantou funkčného zotavovania myokardu a mortality po AIM. V súčasnosti je najefektlvnejšlm spôsobom na limitovanie rozsahu infarktu reperfúzia ohrozeného myokardu hneď ako je to možné, s použítím koronámej angioplastiky alebo trombolýzy, a na prevenciu opätovne oklúzie koronárnej artérie sa používa antitrombotická terapia. Reperfúzia alebo obnovenie prúdenia krvi do ischemického myokardu sa dosahuje trombolytickou terapiou, ktora rozpúšťa trombus, alebo prostredníctvom dilatácie priškrtenej artérie perkutánnou koronámou angioplastikou. Reperfúzia je nutná na záchranu myokardových buniek a obnovenie funkcie srdca vo všeobecnosti. Reperfúzia však iniciuje kaskádu dejov, ktoré vedú k reperfúznemu poškodeniu. K tomu dochádza aj po zotaveni z kardioplegickej zástavy srdca počas bypassového chirurgického zákroku. Reperfúzne poškodenie sa vyznačuje arytmiami, endoteliálnou dysfunkciou vedúcou k fenoménu neobnovania prietoku a omráčenim myokardu (reverzibilnú stratu kontraktility myokardu).0005 Reperfúzne poškodenie v konečnom dôsledku vedie k apoptickej smrti srdcových buniek, ktoré boli tesne pred reperfúziou myokardu životaschopné. Implementácia vysoko regulovanej formy bunkovej smrti na ischémíi/reperfúzii myokardu môže viesť k novým terapeutickým intervenciám v reperfúznej fáze. Apoptózové signalizačné dráhy, ktoré sa podieľajú na ischémíi/reperfúzii myokardu,však ešte nie sú úplne definované in vivo.0006 Nájdenie nových terapií na inhiblciu apoptózy (tzn. programovanej bunkovej smrti) a najmä na liečenie infarktu myokardu a reperfúzneho poškodenia myokardu teda predstavuje skutočnú výzvu na ochranu srdcových funkcil a na záchranu životov.0007 Vynález je založený na zistení, že je možné redukovať apoptózu srdcových buniek po infarkte myokardu prostredníctvom inhibovania Fas signalizačnej dráhy. Fas receptor vytvára po naviazani na FasL (Fas Iigand) trimér a indukuje apoptózu prostredníctvom cytoplazmatickej domény nazývanej DD(Death Domain - smrtiaca doména), ktorá interaguje so signalizačnými adaptom-Ii, ako napríklad s FAF-1 (Fas-Associated Factor-1 - faktor-1 asocíovaný s Fas), FADD Fas-Associated Death Domain - smrtiaca doména asociovaná s Fas), DAXX (proteín asocíovaný so smrtiacou doménou),FAP-1, FLASH (proteín asocíovaný s FLlCE) a RIP (proteín interagujúci s receptorom). DAXX a FADD sa nezávisle viažu na Fas a aktivujú odlišné apoptické dráhy. DAXX môže zosilniť Fas sprostredkovanú apoptózu aktiváciou JNK kinázovej kaskády, ktorá v konečnom dôsledku vedie k-2 íosforylácii a aktivácii transkripčných faktorov, ako napríklad c-Jun. Na rozdiel od toho, FADD spúšťa cey kaskádu signalizačných kaspáz, uvoľňovanie mitochondriálnych pro-apoptických faktorov, ako sú CytoC (cytochróm-C) a SMAC (druhý aktivátor kaspáz izolovaný z mytochondrii), ktorý sa nazýva aj Diablo.0008 Pôvodcovia vynálezu dokázali, že inhibovanie interakcie Fas receptora s DAXX (SEQ ID N 0 1) alebo s FADD (SEQ ID NO 8) vedie k silnému poklesu apoptózy v srdcových bunkách po infarkte myokardu. Okrem toho pôvodcovia predloženého vynálezu neočakávane zistili, že malé fragmenty DAXX a FADD si zachovávajú anti-apoptickú schopnosť kompletného DAXX, respektíve FADD proteínu.0009 V súlade s tým sa predložený vynález týka peptidu, ktorý pozostáva z- fragmentu 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 alebo 24 po sebe idúcich aminokyselinových zvyškov DAXX proteínu so SEQ ID NO 1, pričom uvedený fragment zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO 5, pričom je tento peptid schopný inhibovat bunkovú apoptózu. Opísanýje aj- fragment z 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 alebo 17 po sebe idúcich aminokyselinových zvyškov FADD proteínu so SEQ ID NO 8, pričom uvedený fragment zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO 12, pričom je tento peptid schopný inhibovať bunkovú apoptózu.0010 V určitých uskutočneniach je anti-apoptickým peptidom podľa vynálezu DAXX proteínový fragment pozostávajúci z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako SEQ ID NO 5. V ďalších uskutočneniach je anti-apoptickým peptidom DAXX fragment, ktorý pozostáva z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako ktorékoľvek zo SEQ ID Nos 21-44.0011 Ďalším tu oplsaným anti-apoptickým peptidom je FADD proteínový fragment pozostávajúci z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako SEQ ID NO 12 alebo SEQ ID NO 9. Opisaný je aj antiapoptický peptid, ktorým je FADD fragment pozostávajúci z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako ktorékoľvek zo SEQ lD NOs 45-57.0012 Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka peptidomimetika anti-apoptického peptidu podľa vynálezu.0013 Ešte ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje konjugát zahŕňajúci anti-apoptický peptid alebo peptidomimetikum podľa vynálezu, spojené s bunkovým penetračným peptidom. Bunkovým penetračným peptidom môže byť Tat, RXR, Bpep alebo Pip 2 b.0014 V určitých uskutočneniach je bunkový penetračný peptid spojený s peptidom alebo peptidomimetikom prostredníctvom spojovníka.0015 V určitých uskutočneniach je bunkový penetračný peptid vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje Tat, RXR, Bpep a Pip 2 b.0016 Konkrétne, v určitých výhodných uskutočneniach konjugát pozostáva z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60 alebo SEQ lD NO 61.0017 Ešte ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka farmaceutickej kompozlcie, ktorá zahŕňa najmenej jeden farmaceutický prijateľný nosič alebo pomocnú látku a účinné množstvo najmenej jedného peptidu alebo najmenej jedného peptidomimetika alebo najmenej jedného konjugátu podľa vynálezu.0018 V určitých uskutočneniach farmaceutická kompozícia podľa vynálezu zahŕňa aj najmenej jedno ďalšie biologicky aktívne činidlo. Konkrétne, biologicky aktívne činidlo sa môže vybrať zo skupiny,ktorá obsahuje cyklosporin A, BH 4 a ich kombinácie.0019 Ešte ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje peptidy, peptidomimetika, konjugáty a farmaceutické kompozície podľa vynálezu na použitie v spôsobe na liečenie ľudského alebo zvieracieho tela, najmä na použitie v spôsobe na inhibíciu bunkovej apoptózy v ľudskom alebo zvieracom tele.3 0020 V určitých uskutočneniach sa peptidy, peptidomimetika, konjugáty a farmaceutické kompozície podľa vynálezu používajú v spôsobe na liečenie akútneho infarktu myokardu (AIM), mozgového infarktu, orgánových transplantácii, srdcových intervencií (mimotelový obeh a dočasná okiúzia cievy) alebo akútnych perturbácií obehu (šokový stav) v ľudskom alebo zvieracom tele.0021 V ďalších uskutočneniach sa peptidy, peptidomimetika, konjugáty a farmaceutické kompozície podľa vynálezu používajú v spôsobe na liečenie ischémie, najmä srdcovej ischémie, ischémie obličiek,ischemickej kolitídy, mezenterickej ischémie, mozgovej ischémie, ischémie končatín alebo kožnej ischémie v ľudskom alebo zvieracom tele.0022 V ešte ďalších uskutočneniach sa peptidy, peptidomimetika, konjugáty a farmaceutické kompozície podľa vynálezu používajú v spôsobe liečby reperfúzneho poškodenia ľudského alebo zvieracieho tela.0023 Príbuzný aspekt predloženého vynálezu poskytuje aj spôsob na liečenie ochorenia alebo stavu, ktoré sa spájajú s apoptózou, u subjektu, pričom tento spôsob zahŕňa krok podávania účinného množstva najmenej jedného peptidu alebo najmenej jedného peptidomimetika alebo najmenej jedného konjugátu alebo najmenej jednej farmaceutickej kompozície podľa vynálezu subjektu.0024 V určitých uskutočneniach tento spôsob zahŕňa aj krok podávania najmenej jedného ďalšieho biologicky aktívneho činidla vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje cyklosporín A, BH 4 a ich kombinácie, uvedenému subjektu.0025 Ako bolo uvedené vyššie, pri týchto spôsoboch liečenia sa ochorenie alebo stav asociovaný s apoptózou môže vybrať zo skupiny, ktorá obsahuje akútny infarkt myokardu (AIM), mozgový infarkt,Orgánové transplantácie, srdcové intervencie, akútne perturbácie obehu, reperfúzne poškodenie a ischémiu.0026 Tieto a iné predmety, výhody a znaky predloženého vynálezu budú priemernému odbomíkovi v oblasti zrejmé po prečítaní nasledujúceho podrobného opisu výhodných uskutočnení.Stručný opis výkresov 0027Obrázok 1 Stanovenie DAXX epitopu prostredníctvom SPOT syntézy. (A) Aminokyselinová sekvencia DAXX sa rozdelila na prekrývajúce sa peptidové rady (pepscanç 15-mérne peptidy s posunom o 3 aminokyseliny) a analyzovali sa blotom spojeným s enzýmom. Čieme obdĺžniky znázorňujú štyri najsvetlejšie spoty so zodpovedajúcou epitopovou sekvencíou. Inkubačné podmienky intraceluláma oblast Fas receptora s His-tagom 10 g/mI protilátky anti-His-(myšacia) (Sigma H 1029 16000)/anti-myšacia-HRP (Calbiochem 401207 12 000), expozičný čas 1 minúta. (B) Zosúladenie humánnej DAXX sekvencie zahŕňajúcej 16-mér - KKSRKEKKQTGSGPLG (DAXXp SEQ lD N 0 5) s DAXX sekvenciami iných druhov (myš, potkan, pes (CANFA) aafrická opicaObrázok 2 Stanovenie optimálnej dĺžky DAXX epitopu (DAXXp) prostrednictvom SPOT syntézy. (A) DAXXp-211 a DAXXp-209 peptidy (SEQ ID NO 2, respektíve SEQ ID NO 3) sa postupne skracovali o jeden aminokyselinový zvyšok na N-konci, na C-konci a aj na N-konci, aj na Ckonci, a analyzovali sa s použitím bíotu spojeného s enzýmom. Spoty označené šlpkou vykazovali najvyššie intenzity signálu (BLU). Inkubačné podmienky intraceluláma oblasť Fas receptora s Histagom 10 ug/mlj protilátky anti-His-(myšacia) (Sigma H 1029 16000)/anti-myšacia-HRP(Calbiochem 401207 12 000), expozičný čas 1 minúta. (B) Zosúladenie peptidových sekvencií DAXXp-211 a DAXXp-209 zodpovedajúcich najsvetlejším spotom, aby sa stanovila optimálna sekvencia DAXX peptidu.Obrázok 3 vyhodnocovanie proteázových schopností Tat-DAXXp a Pip 2 b-DAXXp. (A) Merania stability Tat-DAXXp a Pip 2 b-DAXXp konjugátov vo fetálnom bovinnom sére (FBS, BioWest) a (B) v čerstvo pripravenom myšacom sére (MS). Peptidy sa inkubovaíi s 20 sérom pri 37 °C 0 hodín, 1 hodinu, 2 hodiny, 4 hodiny, 8 hodin, 24 hodín a 48 hodin, a 50 | inkubačná zmes sa precipitovala v 100 l 10 kyseline dichlóroctovej (DCA) v H 20/CH 3 CN (50150). Vzorky sa zmiešali a udržíavali sa pri-20 °C. Precipitované sérové proteíny sa odseparovali centrifugáciou (14 000 rpm, 10 minút) a supernatant sa analyzoval prostredníctvom HPLC s reverznou fázou (meranie plochy pod vrcholom v4 mVsec). n 22 pre každý stav. Po 2 hodinách inkubovania v myšacom sére bolo viac ako 70 peptidov stále neporušených, zatiaľ čo po 24 hodinách sa degradovali všetky peptidy.Obrázok 4 Bunková distribúcia závisí od inkubačného času. Primárne kardíomyocyty sa inkubovali s 1 M roztokom CF-značených Tat-DAXXp konjugátov (zelená fluorescencia) 1 hodinu, 4 hodiny alebo 6 hodín. Bunkové jadrá sa farbili s Hoechst-farbičkou (modrou). Biele stĺpce predstavujú 10 m. Vnútrobunková distribúcia CF-Tat-DAXXp po 1-hodinovej inkubácii odhalila bodkovaný obrazec v cytoplazme (ktorý je charakteristicky pre endozomálne zachytenie peptidov po internalizácii prostrednictvom endocytózy) a nedetegovala sa žiadna lokalizácia do jadra. Zdá sa, že po 4 hodinách inkubovania je CF-Tat-DAXXp schopný uniknúť z endozomálnych vezikúl, čim vzniká difúznejší obrazec značiacej látky. Okrem toho sa pozorovala akumulácia v jadre. Po dlhšom inkubačnom čase (6 hodin) sa CF-značený peptid enkapsuloval do veľkých vezikúl (biele šípky) a eliminoval sa z buniek.Obrázok 5 In vitro vyhodnocovanie anti-apoptickej aktivity CPPs a CPP-konjugátov. Proces a kvantifikácia DNA fragmentácie v (A) C 2 C 12 bunkách, (B) primárnych kardiomyocytoch, (C) H 9 c 2 bunkách a (D) NG 108-15 bunkách. Údaje sa normalizovali na 100 STS. Údaje sa uvádzajú ako priemer t SEM, s n 25. Bunky sa vysiali na 24-jamkové platne a nechali sa rásť cez noc. Na nasledujúci deň sa bunky inkubovali len s STS alebo s STS 1 M peptidu (v OptiMEM)(koncentrácia STS a inkubačný čas pre každý typ buniek sú uvedené na obrázku). Následne sa roztoky odstránili, nahradili sa kompletným médiom a ďalej sa inkubovali 40 hodín. Po regeneračnej fáze sa bunky lýzovali a DNA fragmentácia sa detegovala podľa návodu výrobcu (CeIl Death detection ELISAF S kit - Roche Diagnostics).Obrázok 6 Anti-apoptická aktivita variantov Tat-DAXXp sekvencie na primárnych kardiomyocytoch. Ako je opísané v Iegende k obrázku 5, rôzne analógy DAXXp sekvencie (pozri tabuľku 2) sa v hodnocovali z hľadiska ich anti-apoptických vlastností oproti STS (CeIl Death detection ELISA ws kit - Roche Diagnostics). Žiadny z analógov nebol schopný chrániť primárne kardíomyocyty - fakt, ktorý potvrdzuje, že 16-mér DAXXp má optimálnu dĺžku a sekvenciu na dosiahnutie najsilnejšieho kardioprotektívneho účinku.Obrázok 7 Porovnanie myšacieholpotkanieho DAXXp s humánnou DAXXp sekvenciou vo vzťahu k anti-apoptickej aktivite na C 2 C 12 bunkách, primárnych kardiomyocytoch a H 9 c 2. Myšacia DAXXp sekvencia konjugovaná s Tat (Tat-mDAXXp - SEQ ID NO 61), ktorá je identická s potkaňou DAXXp sekvenciou (pozri obrázok 1 B), sa porovnávala s humánnym konštruktom (TatDAXXp) vo vzťahu k anti-apoptickým vlastnostiam oproti STS (CeIl Death detection ELISAPLUS kit Roche Diagnostics). Použité C 2 C 12 bunky a primárne kardíomyocyty boli z myší a H 9 c 2 bunky boli z potkana. Vo všetkých bunkách sa pozorovalo zvýšenie anti-apoptického účinku s použitím myšacej Tat-mDAXXp sekvencie z myšacích alebo potkaních bunkových typov.Obrázok 8 Stanovovanie FADDp 15 a jeho anti-apoptického účinku v kardiomyocytoch. (A) protelnové sekvencie FADD sa rozdelili na prekrývajúce sa peptidové rady (pepscan 15-mérne peptidy s posunom o 3 aminokyseliny) a analyzovali sa blotom spojeným s enzýmom. Čieme obdĺžniky označujú tri najsvetlejšie spoty so zodpovedajúcimi epitopovými sekvenciami, čísla spotov a intenzity signálu (BLU) sú uvedené nižšie. (B) Peptidová sekvencia FADDp-11 ( FADDp 15 SEQ ID NO 9) sa postupne skracovala o jeden aminokyselinový zvyšok na C-konci, N-konci a aj na N-konci,aj na C-konci, a analyzovala sa s použitím blotu spojeného s enzýmom. Spoty označené šipkou vykazovali najvyššie intenzity signálu (BLU). Najkratši FADD epitop (9-mér so sekvenciou KRKLERVQS (FADDp SEQ ID NO 12 zodpovedal spotu č. 24. lnkubačné podmienky Intracelulárna oblasť Fas receptora s His-tagom 10 g/mI protilátky anti-His-(myšacia) (Sigma H 1029 16 000)lanti-myšacia-HRP (Calbiochem 401207 12 000), expozičný čas 1 minúta.Obrázok 9 Porovnanie FADDp konštruktov s Tat-DAXXp vo vzťahu k anti-apoptickej aktivite v primárnych kardiomyocytoch a v H 9 c 2 bunkách. Kvantiñkácia DNA fragmentácie v (A) primárnch kardiomyocytoch a v (B) H 9 c 2 bunkách. Údaje sa normalizovali na 100 STS. Údaje sa uvádzajú ako priemer i SEM, s n 25. Bunky sa vysiali na 24-jamkové platne a nechali sa rásť cez noc. Na nasledujúci deň sa bunky inkubovali len s STS alebo s STS 1 M peptidu (v OptiMEM)(koncentrácia STS je uvedená na obrázku a inkubačný čas je uvedený na obrázku 5). Následne sa roztoky odstránili a nahradili sa kompletným médiom a ďalej sa inkubovali 40 hodín. Po regeneračnej fáze sa bunky äzovali a DNA fragmentácia sa detegovala podľa návodu výrobcu (CeIl Death detection ELISA °Skit - Roche Diagnostics). Zistilo sa, že krátka Tat-FADDp sekvencia je menej

MPK / Značky

MPK: C07K 14/47

Značky: použitie, apoptózy, inhibitory

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/64-e19743-inhibitory-apoptozy-a-ich-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Inhibítory apoptózy a ich použitie</a>

Podobne patenty