Imunoglobulínové rámce, ktoré vykazujú zvýšenú stabilitu v intracelulárnom prostredí a spôsoby ich identifikácie

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka chémie proteínov, molekulámej biológie a imunológie.Protilátky môžu rozpoznávať a zacieľovať takmer akúkoľvek molekulu s vysokou špecifickosťou a afinitou. Táto charakteristika sa využila na zmenu týchto prírodných proteínov na silné nástroje na diagnostické a terapeutické aplikácie. Pokroky v technológii rekombínantnej DNA uľahčili manipuláciu, klonovanie a expresíu génov protilátok v širokej škále nelymfoidných buniek (Skerra, 1988 Martineau, 1998 Verma, 1998). Množstvo rôznych fragmentov protilátok sa vytvorilo, aby najlepšie vyhovovalo rôznym aplikáciám. Najmenší objekt, ktorý si udržiava úplnú antigén viažucu kapacitu celého rodičovského imunoglobínu je jednoreťazcový fragment Fv (scFv) (Bird, 1988). Tento fragment protilátky zahŕňa variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca spojené flexibilným peptidovým linkerom, ktorý umožňujeFragrnenty protilátok majú niekoľko dôležitých výhod v porovnaní s celou molekulou imunoglobínu. V dôsledku ich menšej veľkosti, pri množstve hostiteľských buniek expresie, ako sú bunky E. coli, je uľahčená expresia a je zvýšený výťažok (Plückthun, 1996). Navyše,fragmenty protilátok umožňujú zlepšenú penetráciu nádorov pri in vivo aplikáciách (Yokota, 1992) a môžu sa pripojiť kovalentne k rôznym efektorovým molekulám na terapeutické účely.Prirodzene sa vyskytujúce protilátky, ktore sú vylučované bunkami plazmy, sa vyvinuli na limkcíu v extracelulárnom, oxidujúcom prostredí. Aby sa získala ich funkčná, zložená štruktúra,tieto všeobecne vyžadujú vytvorenie disulfidových mostíkov v oddelených doménach, ktoré sú rozhodujúce pre stabilitu imunoglobulínového zloženia. V kontraste k protilátkam s plnou dĺžkou, fragrnenty protilátok scFv alebo Fab môžu, v princípe, byť funkcionálne exprímované v redukujúcom prostredí vnútri akejkoľvek bunky a nasmerované do akéhokoľvek oddelenia aby zacielili intraceluláme proteiny a tak vyvolali špecifické biologické účinky (Bíocca, 1991). Skutočne, niektoré intracelulárne jednoreťazcovć fragmenty protilátok, ktoré sa volajú vnútomé telieska intrabodies, sa úspešne aplikovali pri modulácii funkcie intracelulárnych cieľových proteínov v rôznych biologických systémoch. Teda, rezistencia proti vírusovým infekciám sa demonštrovala v biotechnológii rastlín (Tavladoraki, 1993 Benvenuto, 1995), ukázalo saviazanie vnútomých teliesok intrabodies na HIV proteíny (Rondon, 1997) a opísalo sa viazaniena produkty onkogénov (Bíocca, 1993 Cochet, 1998 Lener, 2000). Navyše, intraceluláme protilátky sľubujú, že budú cenným nástrojom pri charakterizácíí funkcie obrovského množstva génov, ktoré sú teraz identiñkované prostredníctvom sekvenovania ľudského genómu(Richardson, 1995 Marasco, 1997). Napríklad, tieto sa môžu použiť vo funkčnom genomickom prístupe na blokovanie alebo modulovanie aktivity novo identifikovaných proteínov, takto prispievajú k porozumeniu ich funkciám. Nakoniec, vnútorné telieska intrabodies majúNapriek týmto skvelým vyhliadkam, vytváranie ñinkčných vnútomých teliesok intrabodies je stále obmedzené ich nestabilitou a nerozpustnosťou alebo sklonom k agregácii. Redukujúce prostredie cytoplazmy bráni vytváraniu konzervovaných vnútroreťazcových disulñdových mostíkov, teda robí vysoké percento fragmentov protilátok nestabilných a ako dôsledok, nefunkčných vnútri bunky (Bíocca, 1995 Proba, 1997). Stabilita a rozpusmosť fragmentov protilátok teda predstavuje veľkú prekážku pre aplikáciu vnútorných teliesok intrabodies ako potenciálnych modulátorov funkcie proteínu in vivo. Až doposial sa nemôžu urobiť žiadne predpovede o požiadavkách sekvencie, ktoré urobia fragment protilátky ñąnkčnýmTeda sú potrebné fragmenty protilátok, ktoré dobre pracujú v širokom rozsahu rôznych bunkových typov a môžu sa teda použiť ako rámce pre rôzne väzbové špecifiká. Takéto rámce sa môžu použiť na konštruovanie knižníc pre intracelulárny skríning alebo môžu slúžiť akoakceptory pre viažuce časti existujúcej protilátky.Okrem toho, že sú jednoznačne vhodné na intraceluláme aplikácie, takéto ňagmenty protilátok alebo celé protilátky založené na veľmi stabilných rámcoch variabilných domén, majú tiež výraznú výhodu oproti iným protilátkam v početných intracelulámych a in vitro aplikáciách. Keď sa takéto rámce vytvárajú v oxidujúcom prostredí, môžu sa vytvoriť ich disulñdové mostíky, ktoré ďalej zvyšujú ich stabilitu a robia ich vysoko rezistentnými voči agregácii a degradácii proteázy. In vivo polčas života (a teda rezistencía voči agregácii a degradácii prostredníctvom sérových proteáz) je, okrem afinity a špecifickosti, jediným najdôležitejším faktorom úspechu protilátok v terapeutických alebo diagnostických aplikáciách (Willuda, 1999). Polčas života fragmentov protilátok sa môže ďalej zvýšiť pomocou kovalentného pripojenia polymérnych molekúl ako je polyetylénglykol (PEG) (Weir, 2002). Stabilné molekuly tohto typu reprezentujú podstatnú výhodu pri použití protilátok, osobitne, ale nie výlučne, keď funkčnosťVeľký praktický význam knižníc fragmentov protilátok motivoval výskum v tejto oblasti. Winter (EP 0368684) poskytol počiatočné klonovanie a expresiu génov variabílných oblastí protilátok. Začinajúc od týchto génov boli vytvorené veľké knižnice protilátok, ktoré majú vysokú diverzitu v doplnkových určujúcich oblastiach (CDRs) ako aj oblastiach rámcov. Avšak, Winter neopísal užitočnosť rôznych rámcov na zostrojenie knižníc.Učenie Plückthuna (EP 0859841) sa na druhej strane pokúsilo zlepšiť návrh knižníc obmedzením rámcov na definovaný počet syntetických konsenzus sekvencií. Úsilie proteínového inžinierstva zahŕňajúce zavedenie veľkého množstva racionálne navrhnutých mutácií už skôr navrhlo mutácie smerom k príslušným konsenzus sekvenciám ako vhodné prostriedky na zlepšenie stability ízolovaných variabilných domén imunoglobulinu (Ohage 1999 Ohage 1999 a US 5,854,027, tu zahmuté odkazom).Plückthun (EP 0859841) zverejňuje spôsoby ďalšej optimalizácie väzbových afinít založených na týchto konsenzus sekvenciách. Patent Plückthuna tiež berie na vedomie pokračujúce zvyšovanie znalostí týkajúcich sa protilátok a preto sa zameriava na zahrnutie takýchto budúcich objavov do návrhu knižnice. Avšak nie sú navrhnuté žiadne možné ďalšiezlepšenia syntetických konsenzusových rámcov.Učenie Wintera, Plückthuna a iných (napr. Soderlind, W 0 0175091) sa teda pokúsilo vytvoriť veľké knižnice protilátok so zameraním sa na vysokú diverzitu v CDRs na výber a aplikáciu vybratých scFvs za oxidujúcich podmienok. Avšak všetky tieto knižnice nie sú optimalizované pre intraceluláme aplikácie a teda nie sú vhodné na výber a aplikáciu v redukujúeom prostredí alebo iných podmienkach, ktoré stanovujú špeciálne požiadavky na stabilitu a rozpustnosť exprímovaného fragmentu protilátky.Nie sú jasné kvality požadované pre fragmenty protilátok, aby dobre pracovali v redukujúcom prostredí, napr. v cytoplazme prokaryotických a eukaryotických buniek. Aplikácia intracelulámych protilátok alebo vnútomých teliesok intrabodíes je teda v súčasnosti obmedzená ich nepredpovedateľným správaním za redukujúcich podmienok, ktoré môžu ovplyvniť ich vlastnosti stability a rozpustnosti (Biocca, 1995 Wom, 2000). Predložené patentové aplikácie (EPl 04020 l,EP 1166121 a W 00200729) a publikácie (Visintin, 1999) týkajúce sa intracelulámeho skríningu na vnútomých telieskach intrabodies sa zameriavajú na technológiu skríningu ale neopisujú špecifické sekvencie protilátok, ktoré sú funkčné v eukaryotických bunkách, osobitne v kvasinkách a teda vhodné na zostrojenie knižnice v tomtoVisintin a Tse nezávisle opísali izoláciu takzvanej intracelulámej konsenzus sekvencíe (ICS)(Visintin, 2002 Tse, 2002). Táto sekvencia sa odvodila od množstva sekvencií, ktoré sa izolovali zo skríningu interakcie antigén-protilátka v kvasinkách. Avšak, vstup do íntracelulámeho skríníngu bol silne neobjektívny kvôli predchádzajúcemu výberu zobrazenia fágu. Teda, všetky vstupné sekvencíe okrem jednej patrili do podskupiny VH 3 v prípade Visintina a kol. Publikovaná konsenzus sekvencia ICS je úplne identická s konsenzus sekvenciou pre ľudskú podskupinu VH 3 opísanou Knappikom (2000) a EP 0859841. 60 zo 62 aminokyselín ICS je tiež identických so všeobecnou konsenzus sekvenciou ľudskej VH domény, ktorá bola navrhnutá Steipom ako základ pre konštrukciu variabilných domén so zvýšenou stabilitou (United States Patent No. 6,262,238, tu zahmutý odkazom). Tieto práce boli, založené na skorších zbierkach sekvencií (t.j., Kabat, 1991 a deñníciách variabilných podskupín domén a štrukturálnych deterrninantoch (Tomlinson, 1992 Williams, 1996 Chothia, 1989 and Chothia, 1987). Avšak,pretože vstup do výberu vnútorných teliesok intrabodies bol tak silne neobjektívny (t.j., v prípade Visintina a kol. všetky domény VH okrem jednej boli VH 3), izolácia sekvencií VH 3 z intracelulámeho skríningu nie je zvlášť prekvapujúca. Pre silnú neobjektivitu ich vstupnej knižnice, práca Tseho a kol. a Visintina a kol. neposkytuje dôkladné vyhodnotenie súboru ľudských variabilných domén ako by bolo poskytnuté objektívnym výskumom a ako je požadované na identifikáciu vhodných rámcov vnútomých teliesok intrabodies prítomných vPredtým bol opísaný systém, ktorý umožňuje výber stabilných a rozpustných vnútomých teliesok intrabodies v kvasínkách, nezávisle od ich antigén viažucej špeciñckosti (Auf der Maur (2001), WO 01480 l 7). Tento prístup umožňuje efektívny skríning knižníc scFv a izoláciu špecifických rámcov, ktoré sú stabilné a rozpustné v redukujúcom prostredí kvasinkových buniek. Cieľom ostáva skutočne izolovať rámcové sekvencíe a použiť vzory v prvom kroku na predpovedanie ktoré typy sekvencií by boli najstabilnejšie v redukujúcom prostredí a v druhom kroku identifikovať optimálnu sekvencíu analýzou, rekombináciou aďalšími in vivo a in vitro experimentmi.Predložený vynález vypĺňa chýbajúci článok v oblasti vytvárania protilátok. Poskytuje rámcové sekvencíe variabilných domén protilátok s vynikajúcimi charakteristikami týkajúcimí sa stability a rozpustnosti. Tieto vlastnosti sú rozhodujúce pre mnoho dôležitých aplikácií, ako jediagnostika, terapia alebo výskum. Tieto rámce sa môžu použiť na grafting existujúcich

MPK / Značky

MPK: C12N 15/09, C07K 16/18, A61K 48/00

Značky: prostředí, vykazujú, imunoglobulínové, stabilitu, intracelulárnom, identifikácie, zvýšenú, rámce, spôsoby

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/62-e13816-imunoglobulinove-ramce-ktore-vykazuju-zvysenu-stabilitu-v-intracelularnom-prostredi-a-sposoby-ich-identifikacie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Imunoglobulínové rámce, ktoré vykazujú zvýšenú stabilitu v intracelulárnom prostredí a spôsoby ich identifikácie</a>

Podobne patenty