Multivalentné imunoglobulíny modifikované v oblasti štrukturálnej slučky

Číslo patentu: E 18858

Dátum: 26.06.2007

Autori: Himmler Gottfried, Wozniak-knopp Gordana, Rüker Florian

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka multivalentného imunoglobulínu, alebo jeho časti, ktorý sa špecificky viaže na aspoň dve povrchové molekuly jednej bunky, s aspoň jednou modifikáciou V aspoň jednej oblasti štrukturálnej slučky uvedeného imunoglobulínu určujúcou viazanie na epitop uvedených povrchových molekúl bunky, pričom nemodiñkovaný imunoglobulin sa neviaže významne na uvedený epitop.Monoklonálne protilátky sa považujú za užitočné na mnohé terapeutické, diagnostické a analytické použitia.Bude tu vysvetlená základná štruktúra protilátky, pričom ako príklad bude použitý intaktný IgGl imunoglobulín. Dva rovnako ťažké (heavy, H) a dva rovnako ľahké (light, L) reťazce sa spájajú za vzniku molekuly protilátky V tvare Y. Každý z ťažkých reťazcov má štyri domény. Aminoterminálne variabilné domény (VH) sú na hrotoch Y. Po nich nasledujú tri konštantné domény CHl, CH 2 a karboxy-terminálna CH 3, na päte Y-ovej stopky. Krátke rozpätie (stretch), spojka(switch), spája ťažké reťazce variabilných a konštantných oblastí. Kĺb (hinge) pripája CH 2 a CH 3 (Fc fragment) k zvyšku protilátky (Fab fragmenty). Jeden Fc a dva rovnake Fab fragmenty sa môžu vytvárať proteolytickým štíepením kĺbu v intaktnej molekule protilátky. Ľahké reťazce sú vytvorené z dvoch domén, variabilnej (VL) a konštantnej (CL), oddelených spojkou. Disulfidové väzby v kĺbovej oblasti spájajú dva ťažké reťazce. Ľahké reťazce sú spriahnuté s ťažkými reťazcami s prídavnými disulñdovými väzbami. Asn-spojené sacharidové časti sú pripojené v rozličných polohách V konštantných doménach V závislosti od triedy imunoglobulínu. Pre IgGl dve disulñdové väzby V klbovej oblasti, medzi Cys 235 a Cys 238 pármi,spájajú dva ťažké reťazce. Ľahké reťazce sú spriahnuté s ťažkými reťazcamí dvomi prídavnými disulfidovými väzbami, medzi Cys 229 s V CHl doménach a Cys 2 l 4 s V CL doménach. Sacharidové častí sú pripojené k Asn 306 každej CH 2, pričom vytvárajú výrazné vyklenutie V stopke Y.Tieto vlastnosti majú vážne funkčné dôsledky. Variabilné oblasti ako ťažkých, tak ľahkých reťazcov (VH) a (VL) ležia na hrotoch, kde sú umiestnené tak, aby reagovali s antigénom. Tento hrot molekuly je miestom, na ktorom je umiestnený V-koniec aminokyselinovej sekvencie. Stopka Y vyčnieva spôsobom, aby sa účinne sprostredkovali funkcie efektora, ako je aktivácia komplementu a interakcie s Fc receptormi, alebo ADCC a ADCP. Jej CH 2 a CH 3 domény sa vydúvajú, aby uľahčili interakcie s proteinmi efektora. C-Koniec amíno-kyselinovejsekvencie je umiestnený na protiľahlej strane hrotu, ktorá môže byť označená výrazom dno Y.V protilátkach sa nachádzajú dva typy ľahkých reťazcov, označené ako lambda (l) a kappa (K). Daný imunoglobulín má bud K reťazce alebo Ä reťazce, nikdy jeden z každého. Medzi protilátkamí obsahujúcimi /1 alebo K ľahké reťazce sa nezistil žiadny funkčný rozdiel.Každá doména V molekule protilátky má podobnú štruktúru dvoch beta skladaných listov navzájom tesne zbalených proti sebe a stlačených antiparalelne k beta-plášťu. Táto zachovaná štruktúra sa označuje ako imunoglobulínové zbalenie (immunoglobulin fold). Imunoglobulínový fold konštantných domén obsahuje B-vláknovú štruktúru zbalenú oproti 4 vláknovej štruktúre. Fold je stabilizovaný vodíkovými väzbami medzi beta vláknamí každého skladaného listu, hydrofóbnymi interakciami medzi zvyškami opačných štruktúr vo vnútri a disulñdovou väzbou medzi skladanými listami. 3-Vláknový skladaný list obsahuje vlákna C, F a G a 4-vláknový skladaný list má vlákna A, B, E a D. Písmená A až G označujú sekvenčné polohy beta-vlákien pozdĺž aminokyselinovej sekvencie imunoglobulínového foldu.Fold varíabilných domén má 9 beta-vlákien usporiadaných V dvoch skladaných listoch zo 4 a 5 vlákien. 5-Vláknový skladaný list je štruktúme homológny s 3-vláknovým skladaným listom konštantných domén, ale obsahuje prídavné vlákna C 1 a C. Zvyšné vlákna (A, B, C, D, E, F ,G) majú rovnakú topológiu a podobnú štruktúru ako ich protipóly v konštantných doménových ímunoglobulínových foldoch. Disulfídová väzba spája vlákna B a F v protiľahlých skladaných listoch, ako v konštantných doménach.Variabílné domény ako ľahkých tak ťažkých ímunoglobulínových reťazcov obsahujú tri hypervariabílné slučky alebo oblasti určujúce komplementaritu (complementarity-determining regions, CDRs). Tri CDRs z V domény (CDR 1, CDR 2, CDR 3) sú zoskupené na jednom konci beta-plášťa. CDRs sú slučky, ktore spájajú beta-vlákna B-C, C-C a F-G imunoglobulínového foldu. Zvyšky v CDRs sa líšia od jednej imunoglobulínovej molekuly po ďalšiu, pričom každej protilátke prepožičiavajú antigénovú špeciñckosť.VL a VH domény na hrotoch molekúl protilátky sú tesne zbalené tak, že 6 CDRs (3 na každej doméne) spolupôsobía pri skonštruovaní povrchu (alebo kavity) pre antigén-špeciñckú väzbu. Prirodzené antigénové miesto protilátky teda pozostáva zo slučiek, ktoré spájajú vlákna B-C, CC a F-G ľahkého reťazca variabilnej domény a vlákna B-C, C-C a F-G ťažkého reťazca varíabilnej domény.Slučky, ktoré nie sú CDR-slučkami v natívnom imunoglobulíne, alebo nie sú súčasťou antigén viažuceho žliabku ako je určené CDR slučkami, nemajú antigénovú väzbu alebo epitop viažucu špeciñckosť, ale prispievajú k správnemu zbaleniu celej molekuly imunoglobulínu a/alebo jej efektora alebo k ďalším funkciám, a sú preto nazvané štrukturálnymi slučkami na účely tohtovynálezu. Dokumenty z doterajšieho stavu techniky ukazujú, že imunoglobulín sa ako skeletpoužil na účely manipulácie existujúceho Väzbového miesta antigénu, čím sa zaviedli nové väzbové vlastnosti. Avšak doteraz boli skonštruované len CDR oblasti pre viazanie antigénu,inými slovami, V prípade imunoglobulínového zbaľovania, bolo modifikované len prirodzené väzbove miesto antigénu, aby sa zmenila jeho väzbová afmita alebo špecifickosť. Existuje Veľké množstvo literatúry, ktoré opisuje rozličné formy takto manipulovaných imunoglobulínov, často exprimovaných vo forme jednodielneho reťazca FV fragmentov (single-chain FV, scFv) alebo Fab fragmentov, bud exprimovaných na povrchu čiastočiek fágov alebo rozpustne exprimovaných V rozličných prokaryotických alebo eukaryotických expresných systémoch. PCT/EP 2006/050059 opisuje spôsob konštruovania imunoglobulínu, ktorý zahŕňa modifikáciu V oblasti štrukturálnej slučky, aby sa získalo nové väzbové miesto antigénu. Tento spôsob je široko použiteľný na imunoglobulíny a môže byť použitý na vytvorenie série imunoglobulinov cielených na rôzne antigény. Multivalentné spojivá cieľov na povrchu bunky nie sú explicitne opísané.US 2005/266000 Al opisuje polypeptidy obsahujúce premenlivý ťažký reťazec variabilnej kostrovej domény (variable framework domain VFR). VFR je súčasťou antigén viažucej dutiny alebo žliabku, ktoré môžu kontaktovať antigén. VFRs sú súčasťou CDR slučkovej oblasti a sú lokalizované na variabilnej doméne na boku CDR slučiek na podporeníe viazania antigénu cez CDR slučkovú oblasť. Štrukturálne slučky iné ako VFR neboli mutované na účely konštrukcie antigén viažuceho miesta.Proteíny povrchových buniek spriahnute s humánnou rakovinou môžu byť účinnými cieľmi monoklonálnej terapie. Protilátky môžu vyvolať protinádorovú odpoved moduláciou bunkovej aktivácie alebo zosilnením imunitného systému.Niektoré mAbs pôsobia sčasti zosieťovaním cieľa, čím môžu hromadiť ciele, čo vedie k aktivácii, inhibícii alebo ampliñkácii bunkovej signalizácie, čo nakoniec končí zadržaním bunky a/alebo apoptózou bunkového cieľaBolo preukázané, že niektoré MAbs (antí-CD 19, -CD 20, -CD 2 l, a -CD 22), ktoré majú malý alebo žiadny inherentný protirastový účinok na bunkové línie lymfómov, sa môžu zmenit na silné protirakovinové činidlá, keď sa použijú ako tetravalentné homodiméry. Tieto účinky môžu byť zväčšené in vivo zosilnením efektorových buniek a/alebo komplementu.Ďalšou stratégiou používanou pre terapeutické mAbs je pripojenie cytotoxického liečiva na mAb. Takýto imunotoxín sa môže viazať na cieľ na povrchu bunky, nasleduje intemalizácia,uvoľnenie liečiva na usmrtenie bunky. Nevyhnutnou podmienkou intemalizácie môže byt-4 Na zvýšenie sily mAbs, ktoré pôsobia cez zhlukovanie cieľových molekúl, sa navrhli rôzne úpravy multivalentných Ab. Boli navrhnuté kovalente spojene lgGs celej dĺžky, ktoré tvoria tetravalentné Abs, a prirodzene sa vyskytujúce IgM a IgG Abs, napodobňujúce polyméme IgM and IgA, použitím ich sekrečných koncoviek. Ďalší tetravalentný variant sa navrhol pridaním Fab na C-koniec každého H reťazca IgG celej dĺžky.Aby sa zlepšila penetrácia tumoru, na vytvorenie multivalentných komplexov sa navzájom spojili menšie konštrukty s použitím fragmentov jednoduchých reťazcov Fv (scFv)2 (každý Fv zahŕňa variabilnú ľahkú doménu a variabilnú ťažkú doménu, spojené peptidovými linkerrni). Takéto konštrukty môžu mať relatívne krátke polčasy rozpadu (v porovnaní s polčasmi rozpadu mAbs celej dĺžky), následne sa toto vyriešilo napojením týchto scFv multiměrov na Fc fragmenty IgG. S scFv a podobnými štruktúrami je náročné kontrolovať vznik presného multimerizačného stupňa, t.j. diměrov, trimérov, tetramérov, a väčšie komplexy sa môžu tvoriť v premenlivých pomeroch v závislosti od základného konštruktu a spôsobu expresie. W 02006/036834 A opisuje molekuly a spôsoby, ktorými sa biologicky účinné peptidy včlenia do slučkovej oblasti Fc domény.WO 01/ 83525 A zverejňuje fúziu F c domén s biologicky účinnými peptidmi, aby sa zvýšil polčas rozpadu peptídov in vivo.Adachi Masaaki a kol. (Protein Science, Cambridge University Press, Cambridge, GB roč. 12,č. 10 (2003) 2125-2131) zverejňuje modiñkáciu CL-CH 1 na kontrolu afmity antigén-protilátka pre Fv.WO 02/32925 A opisuje knižnice fragmentov fibronektínu s náhodnými slučkami podobnými CDR vo variabilných doménach.Ktorýkoľvek známy spôsob na produkciu multivalentných imunoglobulínov ma určité nevýhody, ako sú imunogenicita, in vivo polčas rozpadu alebo výrobné problémy.Predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť modulámy systém, ktorý umožní navrhnúť multivalentný imunoglobulín cielený na bunku podľa príslušných potrieb, aby sa vyriešiliproblémy doterajšieho stavu techniky. Stručný opis vynálezu Predložený vynález poskytuje imunoglobulínové domény, ktoré sa viažu na proteíny na povrchubunky cez modifikované štmkturálne slučky a poskytujú dodatočné viazanie na molekulubunkového povrchu a tak umožňujú zosieťovanie receptorov na bunkovom povrchu.

MPK / Značky

MPK: C07K 16/46, C12N 15/62, C07K 16/00, C07K 19/00, C07K 16/28

Značky: štrukturálnej, imunoglobulíny, oblastí, modifikované, slučky, multivalentné

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/60-e18858-multivalentne-imunoglobuliny-modifikovane-v-oblasti-strukturalnej-slucky.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Multivalentné imunoglobulíny modifikované v oblasti štrukturálnej slučky</a>

Podobne patenty