Imunoglobulínové rámce, ktoré vykazujú zvýšenú stabilitu v intracelulárnom prostredí a spôsoby ich identifikácie

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka chémie proteínov, molekulárnej biológie a imunológie.Protilátky môžu rozpoznávať a zacieľovať takmer akúkoľvek molekulu s vysokou špecifickosťou a añnitou. Táto charakteristika sa využila na zmenu týchto prírodných proteínov na silne nástroje na diagnostické a terapeutické aplikácie. Pokroky v technológii rekombínantnej DNA uľahčili manipuláciu, klonovanie a expresiu génov protilátok v širokej škále nelymfoidných buniek (Skerra, 1988 Martineau, 1998 Verma, 1998). Množstvo rôznych fragmentov protilátok sa vytvorilo, aby najlepšie vyhovovalo rôznym aplikáciám. Najmenší objekt, ktorý si udržiava úplnú antigén víažucu kapacitu celého rodičovského imunoglobínu je jednoreťazcový fragment Fv (scFv) (Bird, 1988). Tento fragment protilátky zahŕňa variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca spojené flexibilným peptidovým línkerom, ktorý umožňujeexpresiu proteínu zjediného génu.Fragmenty protilátok majú niekoľko dôležitých výhod v porovnaní s celou molekulou imunoglobínu. Kvôli ich menšej veľkostí, expresia je uľahčená a výťažok je zvýšený pri množstve hostiteľských buniek expresie, ako sú bunky E. coli (Flückthun, 1996). Navyše,fragmenty protilátok umožňujú zlepšenú penetráciu nádorov pri in vivo aplikácíách (Yokota, 1992) a môžu sa pripojit kovalentne k rôznym efektorovým molekulám na terapeutické účely.Prirodzene sa vyskytujúce protilátky, ktoré sú vylučované bunkami plazmy, sa vyvinuli na ñąnkciu V extracelulámom, oxidujúcom prostredí. Aby sa získala ich funkčná, zložená štruktúra, tieto všeobecne vyžadujú vytvorenie disulfidových mostíkov V oddelených doménach,ktoré sú rozhodujúce pre stabilitu imunoglobulínového zloženia. V kontraste k protilátkam s plnou dĺžkou, fragmenty protilátok scFv alebo Fab môžu, V princípe, byť funkcionálne exprimované v redukujúcom prostredí vnútri akejkoľvek bunky a nasmerované do akéhokoľvek oddelenia aby zacielili intraceluláme proteíny a tak vyvolali špecifické biologické účinky(Biocca, 1991). Skutočne, niektoré intraceluláme jednoreťazcové fragmenty protilátok, ktoré sa volajú vnútomé telieska intrabodies, sa úspešne aplikovali pri modulácii funkcie intracelulámych cieľových proteínov v rôznych biologických systémoch. Teda, rezístencia proti vírusovým infekciám sa demonštrovala v biotechnológii rastlín (Tavladoraki, 1993 Benvenuto, 1995), ukázalo sa viazanie vnútorných teliesok intrabodies na HIV proteíny (Rondon, 1997) aopísalo sa viazanie na produkty onkogénov (Biocca, 1993 Cochet, 1998 Lener, 2000). Navyše,intraceluláme protilátky sľubujú, že budú cenným nástrojom pri charakterizácii funkcie obrovského množstva génov, ktoré sú teraz ídentifikované prostredníctvom sekvenovania ľudského genómu (Richardson, 1995 Marasco, 1997). Napríldad, tieto sa môžu použiť vo funkčnom genomickom prístupe na blokovanie alebo modulovanie aktivity novo identifikovaných proteínov, takto prispievajú k porozumenia ich funkciám. Nakoniec, vnútorne telieska intrabodíes majú potenciálne diagnostické a terapeuticke aplikácie, naprüçlad vNapriek týmto skvelým vyhliadkam, vytváranie funkčných vnútomých teliesok intrabodies je stále obmedzené ich nestabilitou a nerozpustnosťou alebo sklonom k agregácii. Redukujúce prostredie cytoplazmy bráni vytváraniu konzervovaných vnútroreťazcových disulfidových mostíkov, teda robí vysoké percento fragmentov protilátok nestabilných a ako dôsledok, nefunkčných vnútri bunky (Biocca, 1995 Proba, 1997). Stabilita a rozpustnosť fragmentov protilátok teda predstavuje veľkú prekážku pre aplikáciu vnútorných teliesok intrabodies ako potenciálnych modulátorov funkcie proteínu in vivo. Až doposiaľ sa nemôžu urobiť žiadne predpovede o požiadavkách sekvencie, ktoré urobia fragment protilátky funkčnýmTeda existuje potreba pre fragmenty protilátok, ktoré dobre pracujú v širokom rozsahu rôznych bunkových typov a môžu sa teda použiť ako rámce pre rôzne väzbové špecifiká. Takéto rámce sa môžu použiť na konštruovanie knižníc pre intracelulámy skríning alebo môžu slúžiťako akceptory pre viažuce časti existujúcej protilátky.Okrem toho, že sú jednoznačne vhodné na intracelulárne aplikácie, takéto fragmenty protilátok alebo celé protilátky založené na veľmi stabilných rámcoch variabilných domén, majú tiež výraznú výhodu oproti iným protilátkam V početných intracelulárnych a in vitro aplikáciách. Keď sa takéto rámce vytvárajú V oxidujúcom prostredí, môžu sa vytvoriť ich disulíidové mostíky, ktoré ďalej zvyšujú ich stabilitu a robia ich vysoko rezistentnými voči agregácii a degradácíi proteázy. In vivo polčas života (a teda rezistencia voči agregácii a degradácíi prostredníctvom sérových proteáz) je, okrem afmity a špecifickosti, jediným najdôležitejším faktorom úspechu protilátok v terapeutických alebo diagnostických aplikáciách (Willuda, 1999). Polčas života fragmentov protilátok sa môže ďalej zvýšiť pomocou kovalentného pripojeniapolymérových molekúl ako je polyetylénglykol (PEG) (Weir, 2002). Stabilné molekuly tohtotypu reprezentujú podstatnú výhodu pri použití protilátok, osobitne, ale nie výlučne, keďfunkčnosť Fc nie je žiaduca.Veľký praktický význam knižníc fragmentov protilátok motivoval výskum V tejto oblasti. Winter (EP 0368684) poskytol počiatočné klonovanie a expresiu génov variabilných oblastí protilátok. Začínajúc od týchto génov boli vytvorené veľké knižnice protilátok, ktoré majú vysokú diverzitu v doplnkových určujúcich oblastiach (CDRs) ako aj oblastiach rámcov. Avšak, Winter neopísal užítočnosť rôznych rámcov na zostrojenie knižníc.Učenie Plückthuna (EP 0859841) sa na druhej strane pokúsilo zlepšiť návrh knižníc obmedzením rámcov na definovaný počet syntetických zhodných sekvencii. Úsilie proteínového inžinierstva zahŕňajúce zavedenie veľkého množstva racionálne navrhnutých mutácií už skôr navrhlo mutácie smerom k príslušným zhodným sekvenciám ako vhodné prostriedky na zlepšenie stability izolovaných variabilných domén imunoglobulínu (Ohage 1999 Ohage 1999 a US 5,854,027).Plückthun (EP 0859841) opisuje spôsoby na ďalšiu optimalizáciu väzbových afinít založených na týchto zhodných sekvenciách. Patent Plückthuna tiež berie na vedomie pokračujúce zvyšovanie znalostí týkajúcich sa protilátok a preto sa zameriava na zahrnutie takýchto budúcich objavov do návrhu knižnice. Avšak nie sú navrhnuté žiadne možné ďalšiezlepšenia syntetických zhodných rámcov.Učenie Wintera, Plückthuna a iných (napr. Soderlind, W 0 0175091) sa teda pokúsilo vytvoriť veľké knižnice protilátok so zameraním sa na vysokú diverzitu V CDRs na výber a aplikáciu vybratých scFvs za oxidujúcich podmienok. Avšak všetky tieto knižnice nie sú optimalizované pre intracelulárne aplikácie a teda nie sú vhodné na výber a aplikáciu v redukujúcom prostredí alebo iných podmienkach, ktoré stanovujú špeciálne požiadavky nastabilitu a rozpustnosť exprimovaného fragmentu protilátky.Nie sú jasné kvality požadované pre fragmenty protilátok, aby dobre pracovali v redukujúcom prostredí, napr. v cytoplazme prokaryotických a eukaryotických buniek. Aplikácia intracelulámych protilátok alebo vnútomých teliesok intrabodies je teda v súčasnosti obmedzená ich nepredpovedateľným správaním za redukujúcich podmienok, ktoré môžu ovplyvniť ich vlastnosti stability a rozpustnosti (Biocca, 1995 Worn, 2000). Predložené patentové aplikácie (EPl 040201,EP 1 l 66 l 2 l a W 00200729) a publikácie (Visintin, 1999)týkajúce sa intracelulárneho skríningu na vnútorných telieskach intrabodies sa zameriavajú natechnológiu skríningu ale neopisujú špecifické sekvencie protilátok, ktoré sú funkčné V eukaryotických bunkách, osobitne v kvasinkách a teda vhodne na zostrojenie knižnice V tomtoVisintin a Tse nezávisle opísali izoláciu takzvanej intracelulárnej zhodnej sekvencie(ICS) (Visintin, 2002 Tse, 2002). Táto sekvencia sa odvodila od množstva sekvencií, ktoré sa izolovali zo skríningu interakcie antigén-protilátka V kvasinkách. Avšak, vstup do intracelulámeho skríningu bol silne neobjektívny kvôli predchádzajúcemu výberu zobrazenia fágu. Teda, všetky vstupné sekvencie okrem jednej patrili do podskupiny VH 3 v prípade Visintina a kol. Publikovaná zhodná sekvencia ICS je úplne identická so zhodnou sekvenciou pre ľudskú podskupinu VH 3 opísanou Knappikom (2000) a EP 085984 l. 60 zo 62 aminokyselín ICS je tiež identických so všeobecnou zhodnou sekvenciou ľudskej VH domény, ktorá bola navrhnutá Steipom ako základ pre konštrukciu variabílných domén so zvýšenou stabilitou(United States Patent No. 6,262,238). Tieto práce boli, založené na skorších zbierkach sekvencií(t.j., Kabat, 1991 a deñníciách variabílných podskupín domén a štrukturálnych determinantoch(Tomlinson, 1992 Williams, 1996 Chothia, 1989 and Chothia, 1987). Avšak, pretože vstup do výberu vnútomých teliesok intrabodies bol tak silne neobjektívny (t.j., v prípade Visintina a kol. všetky domény VH okrem jednej boli VH 3), izolácia sekvencií VH 3 z intracelulámeho skríningu nie je osobitne prekvapujúca. Kvôli silnej neobjektivite ich vstupnej knižnice, práca Tseho a kol. a Visintina a kol. neposkytuje dôkladné vyhodnotenie súboru ľudských variabílných domén ako by bolo poskytnuté objektívnym výskumom a ako je požadované na identifikáciuvhodných rámcov vnútomých teliesok intrabodies prítomných v ľudskom repertoári.Predtým bol opísaný systém, ktorý umožňuje výber stabilných a rozpustných vnútomých teliesok intrabodies v kvasinkách, nezávisle od ich antigén viažucej špecifickosti (Auf der Maur (2001), WO 01480 l 7). Tento prístup umožňuje efektívny skríning knižníc scFv a izoláciu špecifických rámcov, ktoré sú stabilné a rozpustné v redukujúcom prostredí kvasinkových buniek. Cieľom ostáva skutočne izolovať rámcové sekvencie a použiť vzory v prvom kroku na predpovedanie ktoré typy sekvencií by boli najstabilnejšie v redukujúcom prostredí a v druhom kroku identifikovať optimálnu sekvenciu analýzou, rekombináciou aďalšími in vivo a in vitro experimentmi.Predložený vynález vypĺňa chýbajúci článok V oblasti vytvárania protilátok. Poskytujerámcové sekvencie variabílných domén protilátok s vynikajúcimi charakteristikami týkajúcimi sa

MPK / Značky

MPK: A61K 48/00, C12N 15/09, C07K 16/18

Značky: intracelulárnom, spôsoby, rámce, prostředí, imunoglobulínové, identifikácie, stabilitu, zvýšenú, vykazujú

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/60-e18538-imunoglobulinove-ramce-ktore-vykazuju-zvysenu-stabilitu-v-intracelularnom-prostredi-a-sposoby-ich-identifikacie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Imunoglobulínové rámce, ktoré vykazujú zvýšenú stabilitu v intracelulárnom prostredí a spôsoby ich identifikácie</a>

Podobne patenty