Polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Sú opísané polypeptidy všeobecného vzorca (I), kde A znamená H alebo Phe, B znamená Phe alebo Trp a C znamená Ile, Leu alebo Ser, ktoré sú účinné ako prirodzené pľúcne surfaktanty. Uvedené polypeptidy možno produkovať vo veľkých množstvách, vo vysokej čistote a použiť pri výrobe farmaceutického prípravku na liečbu syndrómu respiračnej choroby u predčasne narodených detí a u dospelých.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa zaoberá polypeptidmi s aktivitou pľúcneho surfaktantu, spôsobmi ich prípravy a terapeutickými prípravkami sich obsahom.Pľúca všetkých stavovcov obsahujú zmes látok, ktoré sú označené ako pľúcny surfaktant. Má povrchovo aktívne vlastnosti, znižuje povrchové napätie v alveolárnej oblasti pľúc do takej miery, že sa zabráni kolapsu koncových oblastí dýchacích ciest pri výdychu. Táto zmes látok reguluje povrchové napätie dynamickým spôsobom, takže kolapsu, ktorý sa očakáva podľa Laplaceovej teórie, pri malých alveolách v prospech väčších alveol, sa zabráni vhodnou úpravou povrchového napätia. Výsledkom je dobre vyvážená, histologicky a fyziologicky stabilná štruktúra pľúc.Pľúcny surfaktant je vylučovaný alveolámymi pneumocytmi typu ll vo forme lamelových útvarov. Tieto sú kompaktnými jednotkami fosfolipidových dvojvrstíev s vysokým obsahom dipalmitoylfosfatidylcholínu (DPPC) a fosfatidylglycerolu (PG). Ďalšie esenciálne zložky v pľúcnom surfaktante predstavujú proteiny, označené ako SP-A,SP-B a SP-C. SP-A je glykoproteín s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktorý v regulácii sekrécie zohráva kľúčovú úlohu.Pri proteinoch SP-C a v menšej miere pri proteinoch SP-B sa uvažuje, že majú úlohu termodynamického katalyzátora pri tvorbe monomolekulového povrchového filmu(surfaktant v užšom zmysle). Prítomnosť týchto proteínov veľmi urýchľuje kinetiku napätia Iba toto umožňuje bez oneskorenía upraviť zloženie surfaktantu na zvláštne požiadavky povrchového napätia Tieto vlastnosti zodpovedajú extrémne hydrofóbnej povahe proteínov, najmä SP-C.Je možné pomocou extrakcie pľúcneho tkaniva alebo irigáciou pľúc zvieraťa získať surfaktantové prípravky, ktoré rovnako pri fyzikálno-chemických meraniach, ako aj v modeloch na zvieratách a klinickom použití, majú schopnosť kompenzovať deñcienciu surfaktanu, a teda sú vhodné napríklad na liečbu syndrómu respiračného zlyhania u detí(IRDS). Tieto Zvieracie preparáty však majú závažné nedostatkyPrípravok fosfolipidov veľmi závisí od zvieracieho druhu, zdravotného a nutričného stavu zvieraťa a môže byť kompenzovaný iba v ohraničenej miere pridaním definovaných komponentov. Obsah surfaktantových proteínov a pomer SP-B/SP-C je ovplyvnený tými istými nedostatkami. Dalším faktorom je, že zmes použitá v terapii tiež obsahuje možne proteolyticke rozpadové produkty proteínov alebo modifikované deriváty (napríklad oxidácíou pri metionine). Z hľadiska dlhodobého používania alebo podávania velkých množstiev surfaktantu v prípade nevyhnutnosti, napr. v prípadoch syndrómu respiračného zlyhania u dospelých(pľúcny šok, ARDS) alebo v iných oblastiach použitia, ako napríklad využitie surfaktantu ako nosiča pre iné látky na pľúcne podávanie, ostáva otázka dodávania látky otvorená.Je preto obvyklé riešiť tieto problémy prípravou proteínov pomocou genetického inžiníerstva. Keďže rekombinantnć proteiny možno, najmä v prípadoch bakteriálnych systémov expresie, pripraviť v skutočne neohraničenom množstve a s použitím modemých analytických a kvalitných kontrolných metód, je možné s použítím syntetických fosfolipidov pripraviť surfaktant presne detinovaného zloženia. Toto môže byť optimálne upravené podľa terapeutiekých požiadaviek.Humánny proteín SP-C (pozri vzorec (l) s A H alebo Phe, B Cys a C Met), ktorý je zvlášť dôležitý pre kinetiku napätia, pozostáva vo svojej strednej časti výlučne z alifatických, veľmi hydrofóbnych aminokyselín, ako sú valin, leucin a izoleucin. Dĺžka tejto strednej časti (aminokyseliny 12 až 34) umožňuje, aby bol peptid integrovaný do monomolekulového fosfolipidového filmu. V Pro-Cys-CysPro sekvencii (pozícia 3 až 6) sú dva Cys zvyšky tioesterifrkovanć kyselinou palmitovou na SH skupinách. Kyselina palmitová ďalej zvyšuje hydrofobicitu kompletného proteínu a súčasne blokuje tieto dve SH skupiny cystelnov a ochraňuje ich pred oxidáciou a tvorbou disultidových mostíkov. V strednej časti (aminokyseliny 12 až 34) vytvára transmembránový helix. Táto oblasť je primknutá na N-konci polámou sekvenciou, ktorá obsahuje pozitivne nabité aminokyseliny (Lyz, 10 Arg, 11).W 0 91/ 18015 opisuje prípravu rekombinantného SP-C a mutantov SP-C. Medzi iným sa tu navrhuje, aby sa nahradili obidva cysteiny v pozícii 4 a 5 dvoma serinmi. Toto je výhodné z hľadiska prípravy, technicky komplikovaná palmitoylácia oboch cysteínov po izolácii veľmi hydrofóbneho proteínu nie je potrebná.Teraz sa prekvapujúco zistilo, že pri SP-C mutantoch,ktoré sa od humánneho SP-C odlišujú nahradenim oboch cysteínov v pozíciách 4 a 5 fenylalanínom alebo tryptofánom a nahradenim metionínu v pozícii 32 izoleucinom, leucínom alebo serínom nedochádza k žiadnym stIatám funkcie pri akomkoľvek porovnaní s prirodzeným SP-C a v skutočnosti ho predstihujú vzhľadom na stabilitu. Prípravok pripravený genetickým inžinierstvom je výrazne jednoduchší a poskytuje vyššie výťažky. Nové polypeptidy s aktivitou pľúcneho surfaktantu možno pripraviť vo vysokej čistote.Vynález sa preto týka polypeptidov s aktivitou pľúcneho surfaktantu a so sekvenciou aminokyselín v súlade so vzorcom (l)(A) Gly Ile Pro B B Pm Val Hls Lou Lyz1112131( 1516171819 20 Am Leu Leu llo Val Val Val Val Val Val (I)212223 24 25 28 27 28 29 30 Leu Ile Vel Val Val Ile Val Gly Al LouA znamená H alebo Phe, B znamená Phe alebo Trp, C znamená Ile, ben alebo Ser.Vynález sa týka nzýmä. polypeptidov všeobecného vzorca (I), kde A H alebo Phe, B Phe a C lle, pričom špeciñkácia, že A l-l, B Phe a C Ile je zvlášť výhodna.Vynález sa ďalej týka farmaceutických prípravkov, ktoré zahrnujújeden alebo viac polypeptidov podľa vynálezu a v pripade, že sa to požaduje, môžu obsahovať jeden alebo viac polypeptidov s aktivitou pľúcneho surfaktantu zo skupiny SP-A a SP-B, výhodne SP-B.Polypeptidy podľa vynálezu možno pripraviť alebo spôsobmi známymi pri syntéze peptidov v tuhej fáze, alebo pomocou primeraných rekombinantných vektorov v hostitelských bunkách. Technológie konštrukcie vektorov,transformácie buniek, umožnenie expresie proteínu dotransformovaných buniek a izolácia a purifikácia exprimovaných proteínov sú odbomíkom v oblasti techniky dobre známe (napríklad W 0 86/03408, W 0 87/065238 a W 0 91/ l 8015). Príprava vektorov na expresiu SP-C V bakteriálnych systémoch sa opiera o bežné metódy technológie s rekombinantnou DNA.Je možné exprimovať hydrofóbny SP-C proteín v baktériách vo veľkom množstve a bez poškodenia hostiteľskej bunky iba vo forme vhodnej fúzie proteínov, ako napríklad spolu s chloramfenikol acetyltransferázou (CAT). Napríklad vektor pTrpAmpCATl 52 kóduje oblasť N-zakončenia CAT a poskytuje (5)EcoRl a (3)Pstl miesto štiepenia v rámci klonovania DNA fragmentov, ktoré kódujú SP-C. CAT a SP-C sú v tomto prípade vzájomne spojené na úrovni proteínov prostredníctvom hydroxylamín-senzitivneho bodu íúzie (AsN Gly). Vektory tohto typu,ako napríklad pTrpAmpCATl 52 SPC dovoľujú kontrolovanú expresiu zodpovedajúcích fúznych proteínov až po štádium produkcie (fermentácia). Expresia fúznych proteínov spôsobuje tvorbu inklúznych častí v hostiteľskcj bunke. Ďalej je možné meniť dĺžku CAT časti vo tiíznom proteíne,takže sa získajú veľké výťažky inklúznych častí s vysokým obsahom SP-C.Expresia sa nevyskytuje iba pri baktériách, ale aj vo veľkom množstve systémov, ako napríklad v bunkách cicavcov, kvasiniek a insektov. DNA zostavy vhodne pre rôzne hostiteľské bunky sa syntetizujú známymi spôsobmi a sú ínkorporovane do genómu hostiteľských buniek s prímeranými kontrolnými sekvenciami bežným spôsobom.Dva DNA oligonukleotidy môžu byť zosyntctizované bežnou fosfoamiditovou metódou v MilliGen/Bioresearch Cyclone DNA syntetizátore.Prvý DNA oligonukleotid vytvára sense reťazec DNA s dĺžkou 118 nukleotidov. Tento kóduje (v 5 - 3 smere) Eco Rl-špecifickć 5 zakončenie pre následné subklonovanie, miesto štiepenia Asn/Gly hydroxylamínu a humánny SP-C začínajúci Gly-25 a končiaci Leu 58 SP-C prekurzorovej sekvencie, zodpovedajúci Gly-l a Leu-34 vo vzorci (I). Toto má za následok mamu sekvenciu arninokyselín humánneho SP-C proteínu translatovaného do DNA v súlade s pravidlami genetického kódu, Ale, sekvencia je modifikované., takže obidva cysteíny v pozícii 28 a 29 SP-C prekurzorovej sekvencie sú nahradené fenylalanínmi alebo tryptofárnni a metionín v pozícii 56 prekurzorovej proteínovej sekvencie je nahradený izoleucinom, leucínom alebo serínom. Ie ďalej možné takto vziať do úvahy frekvencie používania kodónu hostiteľských buniek. Modifikovaná SP-C sekvencie, ktorá obsahuje fenylalanín v pozíciách 4 a 5 a izoleucín v pozícii 32 (číslovanie podľa vzorca (I) sa spomína v súlade bežným jednopísmeným kódom pre tieto dve aminokyseliny ako SPC 34(FF/I). Na doplnenie, sense vlákno DNA obsahuje TAA stop kodón na ukončenie ribozomúlnej translacie a Pst l-špeciñcké 3 zakončenie. Druhý DNA oligonukleotid predstavuje komplementámy,nekódujúci reťazec pozostávajúci zo 110 nukleotidov.synteticky pripravený SP-C DNA fragment je klonovaný do vhodného vektora expresie, ako napríklad pTrpAmpCATl 52. Tento vektor sa skladá z pKK 233(Pharmacia), ktorý obsahuje gén rezistencie na ampicilín a je derivátom pBR 322. Trc promótor môže byť nahradený tip promótorom, ako pri pTrpAmpCATl 52. Podobne možno použiť iné indukovateľné promótory.Na subklonovanie SP-C fragmentu sa najprv spolu hybridizujú komplementáme DNA oligonukleotidy. Dvojvlákno DNA, ktoré z toho vzniká má vysunuté jednovláknové zakončcnia (Eco Rl/Pst l).Inkorporàcia do vektora DNA sa koná bežným spôsobom po Eco Rl/Pst di gescii vektorovej DNA, po purifrkácii požadovaného vektorového DNA fragmentu elektroforézou na agarózových géloch a hybridizáciou SP-C DNA a vektorovćho fragmentu prostredníctvom kohezívnych zakončení. Následne sa oba fragmenty na seba kovalenme nadviažu ligáciou známymi metódami.Na ampliñkáciu DNA a izoláciu plazmidu sa používajú bežné protokoly, napriklad na transformáciu do MM 294 buniek CaClz-kompetenmej E. coli a na selekciu buniek nesúcich plazmidy, na nanášanie ampicillnu na LB agarové platne. Plazmidová DNA je izolovaná z výsledných Amp-rezistentýeh kolónií a analyzuje sa vhodnou kombináciou restrikčných enzýmov. Selektujú sa klony očakávanej DNA restrikčnej fragmentovej vzorky. Kompletné sekventovanie plazrnidovej sekvencie potvrdzuje správnu inzerciu SPC 34(FF/í) sekvencie.Plazmidové vektory získané týmto spôsobom umožňujú expresiu fúzneho proteínu CATSPC pod kontrolou Trp promótora (alebo iných promótorov). Rekombinantný fúzny proteín je produkovaný vo forme inklúznych častíc v bunkách hostiteľa po indukcii.Fúzny proteín CATl 52 SPC 34 (FF/I) má nasledovnú sekvenciu aminokyselín, označenú bežným jednopísmeno vým kódom. 10 ao o 40 MEKKI ram VDISO WHRKE I-EAFF OSVAO cmu TVDLD ITAFL KWIO( eo ro so no 100 NKHKF vm HILAR mum PEFRM AMKDG ELVIW DSVHP CYTVFHEOTE 11 a 120 ua 14 a 15 a TFSSL WSEYH DDFRO FLH|Y snow cvcen mm KGFIE MIIFFVSANPE 160 110 so we FNGIP FFPVH umu. rww wuv wwe ALLIG L 1 10 zo so u34 aminokyselín SP-C(FF/I) v pozíciách 153 až 186 fúzneho proteínu je identifikovaných pomocou podčiarknutia a označenia pozícií l až 34.Následne šticpenie hydroxylamínom na jednotlivé CAT A SP-C sa uskutočňuje medzi Asn-l 52 a Gly-l 53 (zodpoveda l. aminokyseline v SP-C peptide). SP-C peptid sa odstráni a purifikuje spôsobmi používanými v chémii proteí 110 V. Polypeptídy podľa vynálezu môžu byť vyrobené jednotlivo alebo v kombinácii vo farmaceutíckých prípravkoch, ktore sú upravené podľa požiadaviek liečby dýchacích ciest. Prípravky sú vhodné nielen na liečbu syndrómu respiračného zlyhania u predčasne narodených detí a u dospelých, ale aj na liečbu mpalu pľúc a bronchitídy. Polypeptidy podľa vynálezu sú tiež vhodné ako nosiče na liečivá podávané inhalačne.Okrem polypeptidov prípravky obsahujú fosfolipidy,prednostne tie, ktoré sú prítomné v prirodzených pľúcnych surfaktantových prípravkoch, ako sú najmä dipalmitoylfosfatidylcholín (DPPC), palmitoyloleylfosfatidylglycerol(POPG) a/alebo fosfatidylglycerol 0 °C). Prípravky obsahujú vápnikové alebo horčíkové ióny a chlorid sodný na dosiahnutie vhodnej viskozity. Skúsený praktik stanoví typ a množstvo jednotlivých súčastí na jednej strane na základe známeho zloženia prirodzeného pľúcneho surfaktantu a na druhej strane podľa množstva predchádzajúcich návrhov,ako napríklad podľa EP-A 0119056 a EP-A 0406732.Výhodné prípravky podľa vynálezu obsahujú 80 až 95 hmotnostných fosfolipidov, 0,5 až 3,0 hmotnostných polypeptidov, 4 až 7 hmotnostných mastných kyselín,výhodne kyseliny palmitovej a 1 až 3 hmotnostných chloridu vápenatého.Produkujúci kmeň E. coli, lctorý bol použitý, je odvodený od E. co Kl 2 kmeňa MM 294, ktorý sa predáva pod číslom 5208 z Deusche Sammlung von Míkroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Braunschweig).Vektor expresíe pTrpAmpCATl 52 SPC 34 (FF/l), obsahujúci gén na proteínovú fúziu CATl 52 SPC 34 (FF/l) bol odvodený od DNA sekvencie pBR 322, derivátu ColEl(E. Weber (ed.) (1988), Biologická bezpečnosť, Spolková ministerstvo pre vedu a technológiu, Bonn). Trc promótor bol odstrihnutý z plazmidu pKK 233-2, ktorý možno získať od Pharmacia s Eco R 1/Hind 3 a bol nahradený Trp promotorom (pTrp 233). Tento pozostáva z oblasti promótora(vàzbové miesto na RNA polymerázu), oblasti operátora(väzbovć miesto na Trp represor, Shine/Dalgamo (SúD) sekvencie a restrikčných miest na klonovanie. Gén(CAT 152) kódujúci S 2 aminokyselín časti 5 bakteriálnej chloramfenikol acetyliransferázy bol inzertovaný za Trp promótorom. syntetický génový fragment, ktorý kóduje 34 aminokyselín SP-C(FF/I) podobného ľudskćmu bol fúzovaný do CAT 152 DNA parciálnej sekvencie. Funkčné CATSPC(FF/I) transkripčná jednotka je kompletizovaná bakteriálnou rmB transkripčnou koncovou sekvenciou T 1 T 2. Výsledný produkt konštrukcie sa označuje ako pTrpAmpCATl 52 SPC 34(FF/I).Vektor pTrpAmpCATl 52 SPC 34(FF/I) má nasledovné funkčné elementy- CATl 52 SPC 34(FF/I) gén kontrolovaný promótorom Trp a transkripčným terminátorom TlT 2- ori oblasť a príľahlé oblasti, prostredníctvom ktorých sa kontroluje číslo kópie plazmiduPotom, ked sa plazmid zavedie do bunky hostitcľa, má táto vysoké číslo Trp génu kontrolovaného promótorom CATSPC(FF/I). Trp represor poskytuje samotná hostiteľská bunka.Získanie rCATSPC fermentáciou je kontrolované prostredníctvom koncentrácie tryptofánu v médiu alebo prostredníctvom adície B-IAA (kyseliny B-indolylakrylovcj).Kultivačné médium (pozri zloženie uvedené ďalej) v miešacej nádobe je inokulované (l l prekultúry alebo východiskovej kultúry) so vzorkou pracujúcej banky buniek(glycerolová kultúra) a inkubuje sa za silného selekčného tlaku ampicillnu pri 37 °C s miešanim. Rast sa monitoruje prostredníctvom optickej hustoty pri 578 nm. Ked východisková kultúra E. coli 199 dosiahne optickú hustotu viac ako 3, kultúra sa použije na inokuláciu 10 l fermcntátora a rast baktérií pokračuje za zníženého selekčnćho tlaku ampicilínu. Hneď ako optická hustota dosiahne hodnotu medzi 5 a 6, prenesie sa 10 1 kultúry do 100 1 fermentátora a inkubuje sa ďalej za tých istých podmienok. Po dostatočnom raste sa transkripčná jednotka kontrolovaná Trp promótorom CATSPC(FF/I) indukuje pridaním napríklad 40 mg/1 B-IAA. Po indukcii pokračuje fermentácia 4 až 5 hodín, až kým sa bunky nezozbierajú.Počas fermentácie sa meria parciálny tlak kyslíka(pOZ), pH a teplota fermentačného bujónu a sú regulované on-line. pH sa udržiava na konštantnej hodnote pomocou roztoku hydroxidu sodného a parciálny tlak kyslíka (pOz) sa reguluje prostrednictvom zavedenia kyslíka a rýchlosti miešača Stanovenie optickej hustoty pri 578 nm a koncenIrácie uhlíkovćho zdroja v médiu sa uskutočňuje off-line.Tvorba peny je detegovaná pomocou senzora peny, cez ktorý možno zavádzať protipenivý agens, ak je vhodné penu regulovať.Podíely kultivačnćho bujónu sa odoberajú v rôznych časových úsekoch. Po lýze baktérií sa expresia preskúma pomocou frakcionácie a farbenia proteínov E. coli na polyakrylamidových gćloch. Percentuálny podiel (prevládajúcieh) proteínov v celkovom proteíne E. coli sa stanoví denzitometricky. Krátko po indukcii rekombinantného gćnu sa objaví nová prevládajúca proteínová väzba (rCATSPC).Zloženie kultivačnćho média je nasledovné sójový peptón 27,0 g/l, kvasinkový autolyzát KAV 14,0 g/l,NaCl 5,0 g/l, K 2 HPO 4 x 3 Hzo 6,0 g/l, KHZPO. 3,0 g/I,MgSO 4 x 7 HzO, glycerol (99,5 Vw-ná Čistota) 30,0 g/l, antipena J 673 (Struktol Comp.) 0,2 ml/l, L-tryptofán 80,0 mg/l a ampicilín 20 mg/l pre l. prekultúru a 5 mg/l pre 2. prekultúru a 100 1 ferrnentátora.Pred autoklávovaním a sterilizáciou kompexného nutričného média sa pH upraví na 6,8 pomocou 2 N NaOH. Pre prekultúm v 10 l fennentátora sa použije miešacia rýchlosť 750 rpm a prívod vzduchu 10 Vmin. pri 37 °C a pre hlavnú kultúru V 100 l fermentátora je miešacia rýchlosť 400 rpm prívod vzduchu 70 l/min. pri 37 °C. Antipena sa pridáva podľa požiadaviek pomocou použitia striekačky cez septum.Asi 4 hodiny po indukcii sa bunky z kultivačného bujónu odstránia íiltráciou a/alebo centrifugáciou. Vlhká biomasa sa zozbiera v kontajnerí z čistej ocele a mieša sa s 10 l prierazového pufra (pH 8,0) v chladnej miestnosti cez noc(4 °C, 16 hodín). Miešané. bunkovú suspenzia sa rozdrví(pri izbovej teplote) vo vysokotlakovom homogenizátore (z 7 . 104 kPa (700 barr a opäť sa zozbiera do kontajnera z čistej ocele. Inklúzne časti sa následne okamžite zozbierajú filtráeiou a/alebo centrifugáciou (Sorvall RC 2-B centrifúga,27 000 g) pri 4 °C, sú resuspendované v pufri (asi 1 l) a napríklad po častiach asi 350 ml prenesené do l l fliaš s okrúhlou spodnou časťou a nechajú sa lyotilizovať asi 96 hodín. Asi 200 g suchých inklúznych súčastí obsahujúcich viac ako 20 hmotnostných fúzneho proteínu sa získa zo 100 fexrnentovanćho podielu. Lyofilizovanć hlavné súčastí možno uchovávať pri -20 C niekoľko mesiacov.3. Štiepenie fúzneho proteínu puriñkácia Iipofilnćho peptidu SP-C(FF/1)100 g suchých inklúznych častí sa rozpustí v 1,6 l 8 molámeho roztoku hydrochloridu guanidínu (9 l 7,l g), za miemeho zohríatia. Nerozpustené rezíduá sa odstránia filtráciou cez žliabkovaný filter. Kvôli štiepeniu fúzneho proteínu v bode spájania Asn-Gly sa pridá k roztoku 167 g chloridu hydroxylamónia a pH roztoku sa upraví na 9,6 pomocou 2 N NaOH. Potom sa štiepiaci roztok nechá stáť za miešania pri izbovej teplote 3 až 4 dni. Na konci reakčného času sa SP-C(FF/I) nechá precipítovať pridaním 6,4 l tris pufra (pH 8,0) a sedimentuje s použítím centrifúgy(Sorvall RC 2-B centtifúga). Supematant sa oddekantuje a SPC peleta je resuspendovaná v 400 až S 00 ml tris pufia a opäť je centrifugovaná za tých istých podmienok 30 minút.SP-C peleta sa rozpustí v 3,5 l zmesi chloroform/metanol s obsahom kyseliny chlorovodíkovej (1,75 l CHClg 1,75 l CH 30 H asi 30 ml 2 N HCl). Tento surový SP-C roztok je ďalej puritikovaný pomocou preparačnej HPLC na C 8 látke v reverznej fáze. Chloroform/metanolový extrakt je pred aplikáciou na preparačnú HPLC kolónu zriedený 90 Vu-ným metanolom v pomere asi l 2. Týmto roztokom možno naplniť napriklad kolónu(priemer 5 cm) asi 400 mg SP-C(FF/I) (napríklad 2 l zriedeného surovćho extraktu. SP-C(FF/I) sa eluuje za kyslýchpodmienok (pH 2 až 3) gradientom voda/i-propanol (pozri separačné podmienky). Po chromatografii asi 30 minút sa 4 až 6 frakcii 200 ml zozbiera z oblasti, v ktorej SP-C eluuje(UV detekcia pri 220 nm). Frakcie sa preskúšajú analyticky pomocou HPLC a vhodne sa rozdelia. Kvôli skladovaniu sa zmrazia v tekutom dusíku a udržiavajú sa hlboko mrazené pri -80 °C. SP-C(FF/I) sa získa v 98,5 až 99,5 čistote.eluent A HPLC voda od Millipore systemLipofilný peptid SP-C(FF/I) sa mieša v roztoku i-propanolu so zložkami fosfolipidovej matrice a precipituje v homogénnej zmesi so zložkami fosfolipidovej manice pomocou rozprašovania do niedeného roztoku NaCl(0,06 hmotnostných NaCl) pri izbovej teplote. LSF sa zo suspenzie pľúcneho surfaktantu odstráni s použitím valcovej centrifúgy a resuspenduje v roztoku elektrolytu (NaCl,CaClz) a pH sa upraví na 6,5 pomocou 0,1 N NaOI-l. Táto vodná suspenzie sa vloží do 20 ml liekoviek a je lyoñlizovaná, Hmotnosti a objemy uvedené v nasledovnom príklade prípravy sa týkajú prípravy 10 g prípravku pľúcneho surfaktantu7,00 g dípalmitoylfosfatidylcholínu (DPPC), 3,08 g amóníovej soli palmitoyloleylfosfatidylglycerolu (POPG x NH 4) a 0,25 g kyseliny palmitovej sa rozpustia pri 40 C v 200 ml 90 i-propanolu a potom sa ochladia na izbovú teplom. Výsledný fosfolipidový roztok sa zmieša s 1 l roztoku, ktorý obsahuje 200 mg puriñkovaného SP-C(FF/I) a bol získaný HPLC puriñkáciou. Výsledný rozprašovací roztok sa upraví na pH 4,5 miešaním s roztokom bikarbonatu (asi 5 ml 5 roztoku NaHCog).Rozprašovací roztok sa pri izbovej teplote cez jednozložkovú dýzu zavedie pri rozprašovaeej rýchlosti 25 ml/min. do 9,6 l zriedeného roztoku NaCl (0,065 hmotnostných) za silného miešania. Vytvorí sa opalescentný roztok a po uskladnení na 2 hodiny pri 4 °C až 8 C sa pripravok pľúcneho surfaktantu precipituje rozprašovanirn v roztoku elektrolytu (3,0 g CaClg x 2 HZO a 61,3 g NaCl v 300 ml HZO). Suspenzia pľúcneho surfaktantu (celkový objem 10,8 až 11,0 l) sa uchováva cez noc pri 4 C potom sa centrifuguje v Sorvall valcovej centriñíge (RC 2-B) pri 16 000 g 30 minút v každom prípade. Centrifugačná peleta je v každom prípade resuspendovaná v polovici objemu 0,65 roztoku NaCl a opäť sa centrifuguje, aby sa odstránili adherentné rezíduà i-propanolu. Tento postup sa opakuje celkovo 3- až 4-krát. Peleta z poslednej centrifugácie sa rozpustí v 400 ml 0,65 roztoku NaCl, upraví sa pH na6,5 pomocou 0,1 N NaOH a rozdelí sa na dávky po 6,2 g v 20 ml liekovkách. Obsah liekoviek je lyoñlizovaný nasledovne mrazenie pri -45 C počas 6 hodín za atmosférického tlaku, vysušenie zmrazením pri -20 C pri 16 Pa (0,16 mbar) počas 54 hodín a potom ďalšie intenzívne sušenie pri 2 Pa (0,02 mbar) a -20 C počas 5 hodin.Vzorky suchého pľúcneho surfaktantu sa uchovávajú v chladničke pri 4 °C a pred použitím musia byť resuspendovane vodou alebo tyziologickým roztokom NaCl (koncentràcia suspenzie 25 myml).2,9 mg chloridu vápenatćho (bezvodčho)Boli testované dva surfaktantové prípravky s tým istým fospolipidovým zložením, obsahujúce rekombinantný protcín-C surfaktantu (rSP-C surfaktant) a surfaktant bez proteínu SP-C (PL-surfaktant). rSP-C je analógom ľudského SP-C. Obsahuje fenylalanín namiesto dvoch cysteínov v polohách 4 a 5 sekvencie ľudského SP-C, a izoleucín namiesto metionínu v polohe 32. rSP-C bol v pomere 70 30 zmiešaný sfosfolipidom, obsahujúcím dipalmitoylfosfatidylcholín (DPPC) a palmitoyloleoylfosfatidylglycerol a 5 hmotn. kyseliny palrnitovej.Účinok rSP-C surfaktantu bol taktiež porovnávaný s hovädzími siufaktantovými pripravkami Alveofact, bLES a Infasurf. Účinnosť jednotlivých surfaktantov bola stanovenà na základe histopatologických zmien (napr. tvorba hyalínových membrán) a na základe zlepšenia oxygenácie,pričom zmeny boli porovnávané s kontrolnými skupinami,ktorým neboli podané žiadne prípravky. Pokusy boli uskutočnené prostredníctvom tzv. modelu akútneho pľúcneho ochorenia výplachom pľúc u samcov Sprague-Dawley potkanov s hmotnosťou 230 až 270 g, pričom boli podávané rôzne dávky 25, 50 a 100 mg fosfolipidovćho prípravku na kilogram hmotnosti. Bol stanovený arteriálny PaO plyn vkrvi prostrednictvom analyzátora krvných plynov. Ukázalo sa, že len surfaktanty obsahujúce proteín vykazovali štatisticky signifikantné zvýšenie mvislosti od dávky vzhľadom na zlepšenie oxygenáeie. Hodnoty boli 318 il 20 mm Hg, 443 i 58 mm Hg a 480 i 43 mm Hg (priemer iSD) pre 3 dávky rSP-C surfaktantu a 105 i 81 mm Hg,100 i 69 mm Hg a 131 i 108 mm Hg pre 3 dávky PL surfaktantu. Zodpovedajúce hodnoty pre Alveofact boli 104 i 81 mm Hg, 105 i 93 mm Hg a 260 i 143 mm Hg pre bLES 373 il 38 mm Hg 441 i 88 mm Hg a 467 i 43 mm Hg, a pre Infasurf 146 i 96 mm Hg, 284 il 78 mm Hg, a 436 i 70 mm Hg. Hodnoty kyslíka kontrolných skupín ostala nízka 74 i 46 mm Hg. Všetky dávky rSP-C surfaktantu spôsobili výrame vyššiu hodnotu PaOZ ako zodpovedajúce dávky PL surfaktantu. Medzi rSP-C surfaktantom a bLES neboli žiadne štatisticky výrazné rozdiely pri akejkoľvek dávke, ale napríklad pri dávke 25 mg boli výrazné vyššie hodnoty PaOz po podaní rSP-C surfaktantu ako po podani prípravku Alveofact alebo Infasurf. Pri dávke 50 mg boli výrazné rozdiely medzi rSP-C surfaktantom a prípravkom Alveofact, a taktiež hodnota PaO 2 po podaní prípravku Infasurf bola nižšia ako po rSP-C surfaktante.Pri sledovaní histopatologických zmien bolo zistené, že surfaktanty s obsahom proteínu inhibovali vzávislosti od

MPK / Značky

MPK: A61K 38/17, C07K 14/785

Značky: surfaktantu, obsahom, farmaceutický, polypeptid, pľúcneho, prostriedok, aktivitou

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/6-282441-polypeptid-s-aktivitou-plucneho-surfaktantu-a-farmaceuticky-prostriedok-s-jeho-obsahom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom</a>

Podobne patenty