Spôsob prípravy stabilného koncentrátu komplexu faktor VIII – von Willebrandov faktor s vysokou špecifickou aktivitou

Číslo patentu: 279367

Dátum: 07.10.1998

Autori: Burnouf Thierry, Burnouf-radosevich Miryana

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Koncentrát krvno-koagulačného komplexu faktor VIII - von Willebrandov faktor s vysokou špecifickou aktivitou sa pripravuje z celkovej nekryoprecipitovanej plazmy. Spôsob zahŕňa predčistenie zrážaním chloridom bárnatým, adsorpciu na hydroxide hlinitom a chromatografické čistenie na anexovej živici typu DEAE-Fractogel. Spôsob tiež zahŕňa inaktiváciu vírusov technikou rozpúšťadlo-detergent a umožňuje izolovať z tej istej plazmy fibrinogén, albumín, imunoglobulíny, antitrombín III, fibronektín a protrombínový komplex. Jednotlivé získané koncentráty sú vhodné na terapeutické použitie.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa týka spôsobu prípravy koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor s vysokou špecifickou aktivitou z celkovej krvnej plazmy.Bežne praktizované liečenie hemoñlie A injekciou faktora VIII vyžaduje použitie preparátov s vysokou čistotou. Vysoká čistota je nevyhnutná jednak preto, aby bolo pokiaľ možno redukované riziko kontaminácie vírusmi, lebo tieto injekcie sa často opakujú, a jednak preto, že reziduálne kontaminujúce látky by mohli vyvolať nežiaducu imunologickú odozvu nebezpečnú pre pacienta.V strediskách na spracovanie ľudskej plazmy bolo na čistenie faktora VIII už použitých niekoľko metód. Základom týchto metód je vyzrážanie kontaminujúcich proteínov s použitím rôznych chemických činidiel, gélová permeačná Chromatografia, imunoatinitná Chromatografia, ionexová chromatografia a rôzne kombinácie týchto metód.Ak je však V plazme prítomné len male množstvo faktora VIII, potom je hlavným problémom výťažok čistiaceho procesu. Okrem toho je faktor VIII nestabilným proteínom, ktorý môže byť aktivovaný ostatnými krvnými faktom 1 i, predsa však faktor VIII v aktivovanej forme stráca svoju terapeutickú hodnotu. Čistiaci proces a finálne dávkovanie musia byť teda prispôsobené tiež vyriešeniu tohto problému.Čistiaci proces, ktorý využíva na čistenie faktora VIII ionexovú Chromatografia, je opísaný vo francúzskej prihláške vynálezu 88 07530. Tento čistiaci proces umožňuje získanie faktom VIII s vysokou čistotou.Ale pri tomto čistiacom procese sa ako východiskový materiál, rovnako ako pri procesoch používaných inými producentmi, používa kryoprecipitovaná frakcia plazmy. Tento kryoprecipitačný stupeň má za následok stratu 30 až 40 faktora VlIl, ktorý zostáva v supematante.Bolo by teda veľmi výhodne vyvinúť spôsob prípravy koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor z celkovej nekryoprecipitovanej plazmy, čím by sa znížili straty faktora VIII, ku ktorým inak pri čistiacom procese dochádza. Tento spôsob by ďalej mal byť dosť jednoduchý, aby bolo umožnené jeho použitie aj V strediskách na spracovanie ľudskej plazmy, ktore nie sú adekvátne vybavené na spracovanie plazmy kryoprecipitácíou.Vzhľadom na uvedené požiadavky bol vyvinutý jednoduchý spôsob čistenia faktora VIII z celkovej plazmy, ktorý umožňuje získať veľmi stabilný koncentrát faktora VIII s vysokou čistotou a s veľmi dobrým výťažkom.Predmetom vynálezu je spôsob prípravy stabilného koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willbrandov faktor s vysokou špecifickou aktivitou z celkovej plazmy, ktorého podstata spočíva v tom, že sa celková plazma predčistí pôsobením chloridu bámatćho a hydroxidu hlinitého, a potom sa čistí na anexovom géle umožňujúcom retenciu veľmi veľkých molekúl.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa ako celková plazma použije čerstvá alebo zrnrazená plazma.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa k plazme pridá stabilizujúca zmes, obsahujúca 0,2 až 2 U/ml heparínu, l až 5 mM EDTA a l až 10 mM chloridu vápenatého.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že stabilizačná zmes ďalej obsahuje glukózu v koncentrácii 5 až 60 g/l.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že stabilizačná zmes ďalej obsahuje glukózu v koncentrácii 5 až 60 g/l.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že predčistenie zahŕňaa) zrážanie chloridom bárnatým, odstredenie vyzrážanej zmesi a izoláciu supematantu, b) adsorpciu na géle za chladu a izoláciu supematantu aSpôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že zrážanie chloridom bárnatým sa uskutočňuje pridaním za miešania l M roztoku chloridu bámatého pri hodnote pH 6,5, na čo sa vyzrážaná zmes odsnedí pri teplote 5 až 10 °C a supematant sa oddelí.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa adsorpcia na góle hydroxidu hlinitého uskutočňuje s použitím 3 gélu hydroxidu hlinitého pri hodnote 6,5, potom sa získaná zmes rýchlo ochladí na teplotu 5 C, odstredí sa pri teplote 5 °C a supematant sa oddelí.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa odsolenie uskutočňuje ultrañltráciou v prítomnosti nosného tlmivého roztoku pre nasledujúci chromatogratický stupeň, ku ktorému bol pridaný heparín.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že odsoleníe sa uskutočňuje chromatograficky na stĺpci Sephadexu G 25 s použitím nosného tlmivćho roztoku pre nasledujúci chromatograñcký stupeň, ku ktorému bol pridaný heparin.Spôsob je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že supematant plazmy, ktorý bol predčistený, sa injikuje na chromatografický stlpec, obsahujúci anexovú živicu, ktorá má schopnosť retencie veľmi veľkých molekúl a ktorá umožňuje prechod fibinogénu, albumínu, imunoglobulínov,antitrombínu lIl a fibronektínu do filtrátu.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa ako chromatogratická živica použije živica vinylového typu (vinylový polymér), na ktorej sú fixované skupiny typu DEAE, T-MAE alebo D-MAE.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa ako polymémy gél použije Fractogel.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa ako nosný tlmivý roztok pre Chromatografický stlpec použije tlmivý roztok na báze citranu sodného a chloridu vápenatého, obsahujúci glycin a lyzin, ku ktorému bol pridaný 0,1 l M chlorid sodný a ktorý bol nastavený na hodnotu pH 7.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že tlmivý roztok obsahuje 8 až l l g/l glycínu a 2 až 4 g/l lyzinu.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že iónová sila tlmivého roztoku sa s cieľom desorpcie komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor zchromatografickćho stĺpca zvýši na 0,27 M chloridu sodného.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že iónová sila tlmivćho roztoku, zvýši na 0,13 M chloridu sodného, čim sa dosiahne eliminácia ňbronektinu,a potom sa iónová sila zvýši s cieľom desorpcie komplexu faktor VII-von Willebrandov faktor z chromatografického stĺpca na 0,27 M chloridu sodného.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že komplex faktor Vlll-von Willebrandov faktor, ktorý bol desorbovaný z chromatografického stĺpca, sa podrobí dodatočnému čistiacemu a koncentračnému stupňu, ktorý sa uskutočňuje chromatograficky.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa dodatočný chromatografický čistiaci a koncentračný stupeň uskutočňuje na ionexovej živici zvolenej zo skupiny zahŕňajúcej DEAE- alebo T/D-MAE-Fractogel, imobílizovaný aminohexyl, imobílizovaný heparín, dextransulfát, sulfopropyl, añnitnú alebo ímunoafrnitnú živicu.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa dodatočný chromatografický čistiaci a koncentračný stupeň realizuje s použitím tlmivćho roztoku nastaveného na 0,1 l M chloridu sodného a že zahŕňa dve následné zvýšenia iónovej síly na 0,13 M, a potom na 0,27 M chloridu sodného.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že dodatočný chromatografický čistiaci a koncentračný stupeň sa realizuje s použitím tlmivého roztoku nastaveného na 0,17 M chloridu sodného a že zahŕňa jediné zvýšenie iónovej sily na 0,27 M chloridu sodného.Spôsob podľa vynálezu je ďalej výhodne charakterizovaný tým, že sa pred ľubovoľným z chromatograiických stupňov vykoná konvenčná inaktivácia vírusov s použitím techniky rozpúšťadlo-detergent.Predmetom vynálezu je tiež koncentrát komplexu faktor Vlll-von Willebrandov faktor, ktorého podstata spočíva v tom, že bol získaný uvedeným spôsobom podľa vynálezu.Predmetom vynálezu je tiež uvedený koncentrát, ktorý je forrnulovaný na terapeuticke použitie.Vzhľadom na uvedene sa vynález týka spôsobu prípravy koncentrám faktora Vlll z celkovej plazmy. Tento spôsob zahŕňa predčistenie, uskutočňované s cieľom odstránenia zložiek protrombínového komplexu (faktory II, VII,IX, X), a čistenie anexovou chromatogrñou, pri ktorej sa voľbou ionexového gélu a elučnćho tlmivého roztoku dosiahne získanie komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor vysokej čistoty.Tento spôsob môže byť tiež použitý, po zaradení ďalšieho čistíaceho stupňa, na získanie vyčistených roztokov aj ostatných plazmových proteínov, akými sú najmä ñbrinogén, tibronektín, albumin, imunoglobulíny a antítrombín III.Spôsob podľa vynálezu bol vyvinutý pre ľudský plazmu, ale môže byť tiež použitý pri plazme zvieracieho pôvodu.Spôsob podľa vynálezu teda umožňuje použiť pri čistiacom procese ako východiskový materiál celkovú plazmu, tzn. plazmu, ktorá je bud čerstvá, alebo ktorá bola s cieľom konzervácie zmrazená, a nie kryoprecipitovanú plazmu. Výhodne bola táto plazma izolovaná v prítomnosti antikoagulačného alebo stabilizačného roztoku. Obvykle sa na tento účel používa eitráto-dextrozo-fosfátová zmes jevšak možné výhodne pridať k uvedenej zmesi ešte ľubovoľný iný vhodný stabilizátor faktom Vlll alebo týmto stabilizátorom uvedenú zmes nahradiť.Ako stablizačný roztok pre východiskový materiál môže byť výhodne použitá zmes 0,2 až 2 U/ml heparínu, l až 5 mM EDTA a 1 až 10 mM chloridu vápenatého táto zmes môže pripadne obsahovať glukózu v koncentrácii od 5 do 60 g/l.Spôsob podľa vynálezu obsahuje prvý predčistiací stupeň, pri ktorom je zrážanie chloridom vápenatým kombinované s adsorpciou na géle hydroxidu hlinitého.Uvedené spracovanie chloridom bámatým sa výhodne vykonáva s plazmou, ktorej hodnota pH bola nastavená na 6,5 tak, že sa k nej pridá roztok chloridu bámatého až po dosiahnutie konečnej koncentrácie chloridu bámatého 0,08 M. Tento prídavok chloridu bámatého sa realizuje za miešania Vyzrážaná plazma sa potom odstredí pri teplote 5 až 10 °C s cieľom oddelenia vyzrážaných proteínov, načo sa oddelí supematant.Vyzrážanć proteíny môžu byť výhodne použité na pripravu protrombínového komplexu alebo jeho zložiek.Uvedeným spôsobom získaný supematant sa potom uvedie do styku s 3 -ným gélom hydroxidu hlinitého pri hodnote pH 6,5. Gel hydroxidu hlinitého adsorbuje reziduálne kontaminujúce proteíny. Výsledná zmes sa potom ochladí v kryostate a odstredí pri teplote 5 °C. supematant sa oddelí a uchováva pri teplote 5 až 8 °C.Uvedený supematant sa potom odsoll, čo sa môže uskutočniť bud ultrafiltráciou v prítomnosti nosného tlmivého roztoku pre nasledujúci chromatogrfický stupeň, ku ktorému bolo pridané 0,5 až 2 U/ml heparínu, alebo chromatograficky na Sephadexe G 25 s použitím toho istého nosného tlmivěho roztoku.Spôsob podľa vynálezu potom zahŕňa separáciu anexovou chromatogrliou, opísanú vo francúzskej patentovej prihláške 88 07530, kde sú opísané výhody zistené na tento účel pri určitom type živice s nízkou ionexovou účinnosťou a veľkými pórrni a umožňujúcou tak retenciu veľmi veľkých molekúl. Taká prolongovaná retencia umožňuje vytvorenie slabých hydrofóbnych väzieb so živicou a špecifická voľba iónovej sily tlmivého roztoku zasa umožní selektívnu desorpciu fixovaných molekúl.Živice tohto typu sú komerčne dostupné pod všeobecným označením Fractogel. Na daný účel môžu byť použité DEAE-Fractogel 650 a T- alebo D-MAE-Fractogel vyrábaný formou komerčne dostupných produktov firmou Merck. Tieto živice sú obvykle dodávané vo forme, ktorá je dodávateľom označená ako žívica tykadlového typu(tentacular type resins). Štruktúra týchto živíc je modifikovaná tak, aby bolo dosiahnuté zväčšenie povrchu na fixovanie pozitívnych nábojov, čo môže priaznivo ovplyvniť zvýšenú kapacitu gélu.Nosným tlmívým roztokom pre chromatografický stlpec je tlmivý roztok na báze citranu sodného a chloridu sodného nastavený na hodnotu pH 7. Tento nosný tlmivý roztok výhodne obsahuje chlorid vápenatý v koncentrácii 0,5 až 6 mM, lyzín v koncentrácii asi 2 až 4 g/l a glycín v koncentrácii 8 až ll g/l. Koncentrácia chloridu sodného bude zvyšovaná vopred stanoveným spôsobom.Pri spôsobe podľa vynálezu sa teda uvedeným spôsobom predčistený preparát injikuje na chromatograñcký stĺpec. Za definovaných podmienok (0,11 M chlorid sodný) fixuje uvedený chromatografický stĺpec veľmi veľké molekuly, akými sú molekuly komplexu faktor VIII-von Wil SK 279367 B 6lebrandov faktor, a umožní, aby ñbrinogén, albumín, imunoglobulíny, antitrombín III a fibronektín opúšťali chromatografický stĺpec vo filtráte.Pri výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu,ktoré je zamerané na dosiahnutie optimálnej účinnosti izolácie faktora VIII, sa iónová sila tlmívého roztoku použitého na elúciu chromatografického stĺpca zvyšuje iba raz, a to na koncentráciu 0,27 M chloridu sodného. Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu sa tento eluačný stupeň uskutočňuje až po predbežnom zvýšení iónovej sily na 0,13 M chloridu sodného. Týmto opatrením sa dosiahne predbežné odvedenie fibronektínu z chromatograíickeho stĺpca.Komplex faktor VIII-von Willebrandov faktor, ktorý bol desorbovaný a eluovaný za týchto podmienok, má špecifickú aktivitu aspoň rovnú 5 až 10 U/mg. Celkový výťažok čistiaceho procesu je aspoň rovný 350 U/liter východiskovej plazmy a môže byť rovný aspoň 500 U/liter v prípade, ked sa k východiskovej plazme pridá opísaná stabilizačná zmes.V závislosti od predpokladaného použitia roztoku komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor môže byť tento roztok ďalej podrobený dodatočnému čistiacemu a najmä koncentračnému stupňu ďalším chromatograñckým spracovaním. Toto chromatografickć spracovanie môže byť rovnako ako predchádzajúce chromatografické spracovanie uskutočnené s použitím živíc typov DEAE- alebo T/D-MAE-Fractogel alebo iných živíc v tomto prípade môžu byť použité í iné separačné nosiče, akými sú napríklad dextransulfát, imobilizovaný aminohexyl, imobilízovaný heparín alebo sulfopropylové živice a afinitně alebo imunoafmitné živice.Uvedený dodatočný chromatografický stupeň sa realizuje s použitím rovnakého bázickeho tlmívého roztoku, aký už bol opísaný v predchádzajúcom prípade. Pri výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu, ktore je zarnerané na získanie pokiaľ možno čo najkoncentrovanejšieho faktora VIII, sa tento dodatočný chromatogratický stupeň uskutočňuje za už vedených podmienok, tzn., že sa pri ňom uskutočňuje iba jediný desorpčný stupeň zvýšenia iónvej sily tlmívého roztoku na 0,27 M chloridu sodného. Podľa iného výhodného uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu sa iónová sila tlmívého roztoku najprv zvýši na 0,13 M chloridu sodného, čím sa dosiahne desorpcia rezíduálnych kontaminujúcich proteínov, potom sa iónová sila tlmívého roztoku zvýši na 0,27 M chloridu sodneho, čím sa izoluje koncentrát komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor vysokej čistoty, ktorý má špecifickú aktivitu rovnú aspoň 10 až 20 U/mg.Ostatné proteíny nachádzajúce sa v uvedenom prvom ñltráte, akými sú najmä imunoglobulíny, albumín, antitrombín a ñbronektín, môžu byť tiež vyčistené a koncentrované s použítím konvenčných chromatograñckých metód, Spôsob podľa vynálezu tiež zahŕňa ínaktíváciu vírusov,ktorá sa realizuje známymi technikami. V prípade, že sa na tento účel použije chemické činidlo, ako napríklad v prípade techniky rozpúšťadlo-detergent, potom je výhodné takú inaktiváciu vírusov uskutočniť pred niektorým z Chromatografických stupňov. V tomto prípade sa totiž dosiahne to,že použité inaktivačné chemické činidlo sa odstráni spoločne s chromatografickým ñltrátom.Predmetom vynálezu sú tiež koncentráty tak komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor, ako aj ostatnýchplazmových proteínov, ktoré boli získané spôsobom podľa vynálezu.Tieto koncentráty sa potom formulujú v súlade so štandardmi delinovanými v liekopisoch a môžu byť takto použite na terapeutické účely.V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený formou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia. Tieto príklady majú iba ilustrativny charakter a vlastný rozsah vynálezu nijako neobmedzuj ú.Použije sa 250 ml čerstvej plazmy alebo zmrazenej plazmy, ktorá bol následne rozmrazená pri teplote 22 až 25 °C. Táto plazma bola odobratá v prítonmosti antikoagulačného (stabilizačného činidla), napríklad tvoreného citráto-dextrozo-fosfátovou zmesou, a jej hodnota pH bola nastavená na 6,5 kyselinou octovou.K plazme sa pridá 20 ml 1 M roztoku chloridu bámatěho pri hodnote pH 6,5 až k dosiahnutiu konečnej koncentrácie chloridu bámatého 0,08 M. Roztok chloridu bámatěho sa pridáva pomocou peristaltickej pumpy rýchlosťou 4 až 8 ml za minútu, a zmes sa potom mieša pri izbovej teplote l 5 minút.Ďalej sa zmes odstredí pri 2700 otáčkach za minútu a teplote 8 °C 20 minút, potom sa supematant oddelí od sedimentu.Takto získaný supematant sa potom uvedie do styku s gélom hydroxidu hlinitého (Alhydrogel Eurobio a 3 hydroxídu hlinitého), pričom sa na liter plazmy použije 2,3 g gélu hydroxidu hlinitého. pH sa nastaví na hodnotu 6,5 a teplota zmesi sa zníži V kryostate na 5 °C. Výsledná zmes sa potom odstredí pri 2700 otáčkach za minútu a teplote 5 °C počas 20 minút, načo sa supematant od sedimentu oddeli a uchováva sa pri teplote 5 °C.Toto spracovanie umožní elimináciu zložiek protrombínového komplexu (faktory II, VII, lX a X), ktoré môžu byť izolovane a prečistené známymi technikami.Obzvlášť dobré výsledky sa môžu dosiahnuť kombináciou obidvoch uvedených spracovaní (zrážanie chloridom bárnatým a adsorpcia na géle hydroxidu hlinitého). Samotná adsorpcia na gćle hydroxidu hlinitého totiž neumožňuje úplnú elimináciu protrombínu a ostatných zložiek PPSB. Naopak zas len zrážanie chloridom bárnatým ponecháva v supematante určité mnoütvo faktora X, protrombínu a predovšetkým faktora VII.Takto ízolovaný supematant sa potom odsolí bud ultrañltráciou v prítomnosti nosného tlmívého roztoku pre nasledujúci chromatografický stupeň (pozri nižšie), ku ktorému bolo pridané l U/ml heparínu, alebo chromatograñcky na Sephadexe G 25 s použitím toho istého tlmívého roztoku.Potom sa uskutoční konvenčná inaktivácía vírusov technikou rozpúšťadlo-detergent počas 6 hodín pri teplote 24 °C. Spracovanie technikou rozpúšťadlo-detergent je opísané v európskej patentovej prihláške 0 l 3 l 740.Predčistený dialyzovaný supematant sa podrobí chromatografickćmu čistiacemu stupňu. Na tento chromatografický čistiaci stupeň sa použije kolóna k 26/30 (Pharmacia-Upsala Sweden), s priemerom 2,6 cm a užitočnou výškou 30 cm, pričom táto kolóna je do výšky 10 cm naplnená živicou DEAE-Fractogel-TSK 650 (komerčne dostupná vo firme Merck).Nosný tlmivý roztok pre chromatografickú kolóniu a tlmivý roztok na rozpustenie vzorky majú nasledujúce zloženieK tomuto tlmivému roztoku sa pridá chlorid sodný na dosiahnutie jeho finálnej koncentrácie 0,11 M a pH 7.Vzorka sa potom injikuje na chromatografický stĺpec rýchlosťou 100 ml/h. Chromatografický stĺpec sa potom eluuje nosným tlmivým roztokom, čím sa dosiahne odstránenie fibrinogćnu albumínu, imunoglobulínov, antitrombínu lII a fibronektínu, ako aj činidiel použitých na inaktíváciu vírusov.Komplex faktor VIII-von Willebrandov faktor sa potom desorbuje zvýšením iónovej sily tlmivého roztoku na 0,27 M chloridu sodného.Roztok faktora VIII, získaný s použitím tohto postupu má špecifickú aktivitu 5 až 10 IU/mg, pričom účinnosť čistiaceho procesu predstavuje v porovnaní s čistotou plazmy injikovanej na uvedený chromatografický stĺpec asi 60 až 80 . V uvedenom komplexe bol zistený pomer obidvoch faktorov, t. j. faktora VlII a von Wíllebrandovho faktora, rovný lU/ 1 U, kde dmhý z uvedených faktorov je vyj adrený v ristocetinových kofaktorových jednotkách.Čistota uvedeného roztoku faktora VIII môže byť ešte mieme zlepšená dodatočným chromatografickým separačným stupňom, ktorý umožní skoncentrovanie produktu. Tak je napríklad na tento účel možné použiť druhý stlpec DEAE-Fractogelu, na ktorom sa vykonáva s použitím rovnakého nosného tlmivćho roztoku. Predbežne sa uskutoční elúcía pri iónovej sile tlmivého roztoku 0,13 M chloridu sodnćho, čím sa dosiahne odstránenie reziduálnych kontaminujúcich proteínov z chromatografického stĺpca. Iónová sila tlmivého roztoku sa potom zvýši na 0,27 M chloridu sodnćho s cieľom desorpcie a elúcie vysoko čistého a koncentrovaného roztoku komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor.Uvedený druhý chromatografický koncentračný stupeň môže byť nahradený ultrafiltráciou.Pri obvyklom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa prvý čistiaci chromatografický stupeň vykonáva na živice DEAE-Fractogel. Ale dobre výsledky môžu byť rovnako dosiahnuté použitím na trhu novouvedených živíc (firma Merck) TMAE-Fractogel (TMAE tri-metyl-amino-etyl) alebo DMAE-Fractogel (DMAE Di-MAE), ktore majú vlastnosti, ktoré sú ekvivalentné vlastnostiam živice DEAE-Fractogel. Tiež môžu byť použite nové živice tykadlového typu, ktoré boli vyvinuté firmou Merck a uvedené W. Müllerom v zbomíku Conference on liquid Chromatography, jún 1989, Stockholm.Ďalšie uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu tiež umožňuje prípravu koncentrátov fibrinogénu a ñbronektínu,a to pri súčasnom získaní koncentrátu faktora VIII a von Wíllebrandovho faktora vo forme komplexu, majúceho mieme zvýšenú špecifickú aktivitu na úkor nižšieho výťažku.Postupuje sa rovnako ako v príklade 1 až do elúcie komplexu faktor Vílíĺvon Willebrandov faktor z prvého chromatografického stlpca tvorenćho živicou DEAE-Fractogel.Fibrinogén, antitrombín Ill, albumín a imunoglobulíny nie sú chromatografickým stlpcom zadržané a môžu byt izolvane vo filtráte.Komplex faktor VIII-von Willebrandov faktor môže byť dočistený a koncentrovaný druhým Chromatografiakým separačným stupňom na stlpci živice DEAE-Fractogel, pričom sa použije nosný tlmivý roztok s iónovou silou 0,17 M chloridu sodného. Za týchto podmienok nedochádza k zadržaniu reziduálnych kontaminujúcich proteínov. Následným zvýšením iónovej sily tlmivćho roztoku na 0,27 M chloridu sodného sa dosiahne desorpcia a elúcía komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor. Týmto spôsobom sa dosiahne špecifická aktivita 10 až 20 IU/mg.Fibrinogén a fibronektín môžu byť potom vyčistené a koncentrované s použitím známych chromatografických procesov, pričom sa získajú roztoky s kvalitou vhodnou na terapeutické použitie (pozri francúzska patentová prihláška 88 07530). Ostatné proteíny plazmy môžu byt prečistené a koncentrované s použitím konvenčných frakcionačných postupov.Účinnosť čistiaceho procesu môže byť ešte ďalej zlepšená stabilizáciou východiskovej plazmy od okamihu jej rozrnrazenia na teplom 25 °C pridaním nasledujúcej zmesiK tejto zmesi môže byť ďalej pridaná glukóza v koncentrácii 5 až 60 g/l. Hodnota pH sa potom zníži na 6,5 pridaním kyseliny octovej. Čistiace stupne sa potom uskutočňujú rovnako ako v príklade 1 alebo 2. Za týchto podmienokje celkový výťažok čistiaceho procesu rovný aspoň 500 U FVllízC/liter východiskovej plazmy. To zodpovedá celkovej výťažnosti 55 až 65 aktivity faktora VIII pril. Spôsob prípravy stabilného koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandov faktor s vysokou špecifickou aktívitou,vyznačujúci sa tým,žesa celková plazma prečístí pôsobením chloridu bámatěho a hydroxidu hlinitého, a potom sa čistí na anexovom géle,umožňujúcom retenciu molekúl s molekulovou hmotnosťou vyššou než 1 milión daltonov.

MPK / Značky

MPK: A61K 38/00, C07K 3/28

Značky: willebrandov, faktor, aktivitou, přípravy, koncentrátů, vysokou, komplexu, spôsob, stabilného, špecifickou

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/6-279367-sposob-pripravy-stabilneho-koncentratu-komplexu-faktor-viii-von-willebrandov-faktor-s-vysokou-specifickou-aktivitou.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob prípravy stabilného koncentrátu komplexu faktor VIII &#8211; von Willebrandov faktor s vysokou špecifickou aktivitou</a>

Podobne patenty