Spôsob stanovenia aktivity endo-1,4-ß-xylanáz

Číslo patentu: 234607

Dátum: 01.01.1987

Autori: Mislovičová Danica, Toman Rudolf, Biely Peter

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález sa týka spôsobu stanovenia aktivity endo-l,4-?-xylanáz. Podstata spôsobu stanovenia spočíva v tom, že 4-0-metyl-D-glukorono-D-xylan so 4 až 20 % kovalentne naviazaného farbiva dvojsodnou soľou 1-amino-2-sulfo-4- [3-(2-sulfátoetylsulfonylanilino)]antrachinónu sa rozpustí vo vode alebo v pufri o pH 4 až 6 a v koncentrácii 0,2 až 2 % sa použije ako substrát do inkubačných zmesí s endo-l,4-?-xylanázami, v ktorých sa enzýmová reakcia uskutočňovaná pri teplote 20 až 50 °C zastavuje pridánim dvoch objemov 96 % obj. etylalkoholu, čím sa vyzráža podiel nehydrolyzovaného substrátu, ktorý sa takto oddelí od rozpustných fragmentov uvoľnených účinkom enzýmu, ktoré sa stanovia fotometricky pri 580 až 610 nm. Vynález má použitie v biochémii.

Text

Pozerať všetko

vynález sa týka spôsobu stanovenia aktivity endoe 1.4-f 5 Xylanáz 3 92 cl 08) oVBežné metódy testovania aktivity mikrobiálnych endo-1,4 ~g-xylanáz sú založené na kvantitativnom atanoveniredukujúcich saa charidov uvoľnených z rastlinných xylanov pôsobením enzýmových preparátov. Tieto metódy neumožňujú selektivne stanovenie akti~ vity endo-iA-(L-xylanáz v prítomnosti p-xylozidáz (exo-(łą-xy- lanáz, EC 3.21.37), ktoré prispievajú k tvorbe redukujúcich eacharidov tým, že hydrolyzujú xylooligoeacharidy na xylőzu. Tieto metódy nie sú tiež vhodné na stanovenie aktivity endo-1.49-Q-xylanáz v roztokoch s vysokou koncentráciou redukujúcich sacharidov, ktoré je nutné odstraňovať dialýzou. Alternatívne postupy stanovenia aktivity endo-1.4-(5-xylanáz využívajú meranie poklesu viskozity roztokov polymérnych substrátov, ako je napr. karboxymetylxylan. Viskozimetrickú metódu možno označiť azda za najcitlivejšiu a pritom velmi špecifickú metódu etanovem nia aktivity endo-1,4-(5-xylanáz, vyznačuje sa však zdĺhavosťou meraní. preto nie je vhodná na analýzu väčších sérii vzoriek.V posledných dvoch desaťročiach sa zavádzajú na stanovenie aktin vity rôznych druhov endoglykanáz tzv. chromogénne substráty. odw povedajúce polysacharidy s kovalentne naviazaným farbivom (0. A. Stamm Helv. Chim. Acta 46. 3008 (1963) P. Hagen. E. T. Reese,0. A. Stamm Halv. Chim. Acta 49, 2273 (1966) M. Leisola, M. Linko Anal Biochem. 70, 592 (1976). Vo všetkých prípadoch sa používa ako substrát farebný polysacharid nerozpustný vo vodea v pufroch. Za mieru aktivity enzýmov sa považuje potom množstvo farbiva uvoľneného do roztoku vo forme rozpustných fragmentov polysacharidu s kovalentne viazaným farbivom. Na tomto princípe bol navrhnutý i spôsob stanovenia aktivity endo-1.4-Q-xylanáz na xylanovom géli s kovalentne naviazaným farbivom, 2 234 507ktorého nerozpustnosť vo vode sa dosiahla zosieťovanim vyfarbeného polysacharidu epichlôrhydrinom Ľčs. AO 192 202. Použitie nerozpustných polysecharidov alebo ich derivátov s kovalentne naviazaným farbivom ako substrátov na stanovenie aktivity polyeacharid hydroláz s endo-spôsobom ataku substràtu u- . možňuje sledovať enzýmovú reakciu vizuálne na základe prechodu farbiva do pôvodne bezfarebného roztoku (filtrátu alebo supernatantu). Tento spôsob sledovania enzýmovej reakcie sa dá uplatniť vtedy ak sa enzýmová reakcia uskutočňuje v objemoch väčšich ako je napúčaci objem substrátu v inkubačnej zmesi. V takomto pripade je však potrebné reakčné zmesi miešať. aby sa zaručila rovnaká pravdepodobnosť vytvárania enzým-substrátového komplexu v celom objeme. Je známe. že pri stanovení aktivity.celuláz na farbenú mikroknětalickú celulózu je množstvo uvoľne ného farbive závislé od miešania zmesi flw. Leisola. M. LinkovBiochemical Laboratory Report 13. Technical Research Centreof Finland, Helsinki (1976). Pri analýze veľkých sérii vzoriek je požiadavka na miešanie nevýhodou. ktorú odstraňuje použitie farebnáho polysaoharidového substrátu. ktorý je vo vode a v pufroch dokonale rozpustný a ktorý sa však dá z vodného roztoku kvantitativne vyzrážať organickým rozpúšťadlom za podmienok, kedy kratšie farebné fragmenty polysacharidu uvoľnené účinkom enzýmu zostávajú V roztoku. Na tomto principe bola navrhnutá metóda stanovenia aktivity endopektinázy (endopolygalakturonanázy. EC 3.2.1.15) D. R. Friend, G. W. J. Chang J. Agr. Food Chem. 30, 892 (1982) . pri ktorej sa meria rýchlosť uvoľňovania farebných fragmentov z farbeného pektinu. ktoré sú rozpustné v 63 etylalkohole.Podstata vynálezu spočiva v tom. že 4-0-metyl-D-glukorono-D-xylan so 4 až 20 kovalentne naviazanej dvojeodnej soli 1-amino-2-sulfo-4 ~ 3-(2-sulfátoetylsulfonylanilino) antrachinónu sa rozpusti V pufri o pH 4,0 až 6,0 v koncentrácii 0,2 až 2.0 hmot. pri teplote 50 až 90 °C a tento roztok sa po ochladeni na 20 až 50 °C použije ako substrát do zmesi s roztokom endo-1,4-p-xylanáz. v ktorých sa enzýmová reakcia prebiehajúca pri teplote 20 až 50 °C po dobu 5 až 180 min zastavuje pridanim dvoch objemov etylalkoholu, čim sa vyzráža podiel nehydrolyzovaného substrátu. ktorý sa takto oddeli od rozpustných farebných fragmentov uvoľnených účinkom enzýmu. ktorých množstvo je úmarné koncentrácii enzýmu v zmesi a trvaniu inkubácie a-ktoré sa stanovia fotometricky pri 580 až 610 nm.Výhodou navrhovaného spôsobu stanovenia aktivity endo-1.44(|,.-×ly 1 anáz Je. že využíva c-hromogénny substrát rozpuetený vo vode a v pufroch. čo zaručuje homogénne zloženie enzýmových inkubačných zmesi a odstraňuje požiadavky na miešanie, ako je tomu v pripade nerozpustných chromogénnych substrátov a že enzýmová reakcia sa zastavuje velmi jednoducho pridaním dvoch objemov denaturovaného etylalkoholu. čo vedie k vyzrážaniu substrátu s výnimkou farebných fragmentov uvolnených účinkon enzýmu z pôvodne úplne zrážatelného subetrátu. Ďalšou výhodou je. že test je špecifický pre endo-14-5-xylanázy a je iba málo ovplyvniteľný prítomnosťou Q-xylozidáz (exo-(5-xylanáz). že umožňuje stanoviť aktivitu endo-1.4- Q-xylanáz v prítomnosti redukujúcich sacharidov a iných redukujúcich látok ak tieto nemajú inhibičný účinok na enzým a že je vhodný pre analýzu veľkého počtu vzoriek získaných napr. po frakcionácii bielkovin na kolőnech chromatografiou. chronatcfokusáciou, pripadne elektroforézou.Príklad 1, xylan obsahujúci 4,8 kovalentne viazanej dvojsodnej soli i-amino-Z-sulfo-tt-Ijąz-sulfátoetylsulfonylanilino)j an ýtrachinőnu sa rozpusti v 0.05 mol§l 1 acetátovom pufri (zlo ženia kyselina octová a octan sódny). pH 5,4. za zahrievania na teplotu 60 °C a miešania tak, aby 1.ml roztoku obsahoval5 mg modifikovaného polysacharidu. Po ochladeni na teplotu40 °C sa 1 ml alikvóty miešajú s 0.1 ml objemami roztoku endo-1,4-P -xylanázy. Zmesi sa po premiešani inkubujú pri teplote 40 °c po dobu 10 až 180 min. Reakcia sa zastaví pridaním dvoch objemov etylalkoholu (2.2 ml). Po dôkladnom premiešani sa zmesi nechajú stáť pri teplote 20 až 25 °C po dobu 30 min, premiešajú sa a centrifugujú. Absorbancia čirych supernatantov sa meria oproti vzorke neobaahujúcej enzým pri 580 nm. Farebná intenzita supernatantov je úmerná množstvu enzýmu v inkubačnej zmesi a trvaniu inkubácie. Za jednotku enzýmovej aktivity sa považuje také množstvo p-xylanázy. ktoré uvolni zo substrátu pritomného v inkubačnej zmesi za 1 min234 607 fragmenty xylanu rozpustené v zmesi etylalkoholu a voda v objemovom pomere 2 1, ktoré obsahujú 1 z celkového množstva farbiva dvojsodnej soli 1-amino-2-su 1 fo-4- 3-(24 sulfátoety 1 sulfonylanilino) antrachinónu viazaného na polymérny substrát.0.3 ml objemy roztoku 5 mg xylanu s 13,6 kovalentne viazaného farbive dvojsodnej soli 1-amino-2-sulfo-4-3-(2-«-sulfátoetylsulfonylanilino) antrachinőnu v 0,1 mo 1.l 1 citrátovom pufri (zloženia kyselina citrónová a citrât sódny) pH 4.8. sa miešajú s 0,2 ml objemami roztoku endo-1.4-5 -xylanázy. Po inkubàcii pri teplote 30 °C po dobu 5 ~až 180 min sa reakcia zastavuje pridaním 1 ml 96 obj. etylalkoholu. Po dôkladnom premiešaní sa zmesi nechajú stáť po dobu 10 min pri teplote 25 °C. premiešajú sa znovu a zrazenina sa centrifuguje. Supernatanty sa fotometrujú pri 595 nm oproti eupernatantu získanému po zrážaní zmesi neobsahujúcej enzým.Xylan obsahujúci 18,0 kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli 1-amino-2-eulfo-4-3-(2-sulfátoetylsulfonylani 1 ino) antrachinőnu sa rozpustí v 0,05 mo 1.l 1 acetátovom pufri, pH 5.4 v koncentrácii 0,4 hmot. K 0,5 ml objemom tohto roztoku sa pridajú 5 až 50 /ul objemy roztoku endo-1.4- §-xylanázy, zmesi sa premiešajú a inkubujú pri teplote 40 °C po dobu 5 až 180 min. Po zastavení reakcií pridaním 1 ml 96 obj. etylalkoholu sa postupuje dalej ako v príklade 2.vynález má použitie v biochémii pri charakterizácii enzýmových preparátov a stanovení aktivity endo-1,4-(3-kylanáz.

MPK / Značky

MPK: C12N 9/24

Značky: spôsob, stanovenia, endo-1,4-ß-xylanáz, aktivity

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/6-234607-sposob-stanovenia-aktivity-endo-14-s-xylanaz.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob stanovenia aktivity endo-1,4-ß-xylanáz</a>

Podobne patenty