Glyfosát-tolerantná rastlina cukrovej repy

Číslo patentu: E 13107

Dátum: 17.02.2004

Autori: Nehls Reinhard, Kraus Josef, Sauerbrey Elke, Jansen Rudolf, Loock Andreas

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

vynález sa týka gIyfosát-tolerantných rastlín cukrovej repy, rastlinného materiálu a semien, rovnako ako postupu a testovacej sady pre identifikáciu glyfosát-tolerantných rastlín cukrovej repy.Cukrová repa (Beta vulgaris) sa vmnohých krajinách pestuje ako kultúrna plodina s celkovým výnosom viac ako 240 miliónov ton.N-(Fosfonomethyl)-glycín, všeobecne označovaný ako glyfosát, je širokospektrálny herbicíd, ktorý našiel uplatnenie vzhľadom na jeho vysokú účinnosť, biologickú odbúrateľnosť a nízku toxicitu voči zvieratám a ľuďom. Glyfosát inhibuje šikimátovú dráhu, ktorá vedie ku vzniku aromatických zlúčenin, vrátane aminokyselín a vitamínov. Glyfosát inhibuje hlavne premenu fosfoenolpyrohroznovej kyseliny a šikimát-3-fosfátu na 5-enolpyruvát-šikimát-3 fosfát inhibiciou enzýmu 5-enolpyruvyl-šikimát-3-fosfát-syntázy (EPSP-syntáza alebo EPSPS). Ak sú konvenčné rastliny ošetrené glyfosátom, nemôžu rastliny vytvárať pre rast a prežitie dôležité aromatické zlúčeniny (napr. fenylalanín a tyrozin). EPSPS je prítomné vo všetkých rastlinách, baktériách a hubách. U zvierat, ktoré si vlastné aromatické aminokyseliny nesyntetizujú, sa nevyskytuje. Vzhľadom ktomu, že neexistuje biosyntetická dráha aromatických aminokyselín u savcov. vtákov alebo vodných foriem života, má glyfosát,ak vôbec, iba nízku toxicitu pre tieto organizmy. EPSPS-enzým je prirodzene obsiahnutý v potravinách rastlinného a mikrobiálneho pôvodu.Glyfosát je účinná zložka herbicídov, ako je napríklad Roundup, vyrábaný firmou Monsanto Company, USA. Obvykle je formulovaný vo forme vodorozpustnej soli, ako napriklad amóniovej, alkylamínovej, soli alkalického kovu alebo trimetylsulfóniovej soli. Jedna z najpoužlvanejšich formulácii je glyfosátová soľ izopropylaminu, čo je v Roundupe® pou živaná forma.Bolo dokázané, že je možné pripraviť rastliny tolerantné voči glyfosátu tým, že do genómu rastliny vnesieme schopnosť vytvárať glyfosát-tolerantnú EPSP-syntázu, napr. CP 4 EPSPS z Agrobaktérie sp. Kmeň CP 4 AcO.Glyfosát-tolerantné rastliny cukrovej repy môžu byť pripravené Agrobaktériami sprostredkovanou transformáciou, pri ktorej je do genómu rastliny vnesený gén kódujúci glyfosáttolerantnú EPSP-syntázu, ako je CP 4-EPSPS. Cukrová repa, exprimujúca CP 4-EPSPS,bola popísaná vo W 0 99/23232. Rastliny cukrovej repy, vypestované z buniek, ktoré boli transformované uvedeným spôsobom génom pre CP 4-EPSPS sa ale značne odlišujúsvojimi vlastnosťami, čo je možné vysvetliť skutočnosťou, že gén je inzertovaný na náhodných miestach v genóme. Inzercia jedného určitého transgénu na určitom mieste na chromozóme je často označovaná ako Event - udalosť. Pojem udalosť sa tiež používa pre odlíšenie odrôd plodín zmenených genetickým inžinierstvom. Žiaduce udalosti sú veľmi vzácne. Väčšina udalostí sa nepoužije, pretože je transgén zabudovaný do génu dôležitého pre rast s tým dôsledkom, že je tento prerušený alebo nie je exprimovaný, alebo je transgén zabudovaný v úseku chromozómu, ktorý expresiu transgénu neumožňuje,alebo je príliš slabá. Z tohto dôvodu je potrebné testovať veľký počet udalostí, aby mohla byť identiñkovaná udalosť, ktorá sa vyznačuje dostatočnou expresiou zavedeného génu. Tento proces je veľmi časovo a ñnančne nákladný, a nie je vôbec zaručené, že bude nájdená rastlina s uspokojivými vlastnosťami.Je teda úlohou tohto vynálezu pripraviť rastliny cukrovej repy, ktoré vykazujú vysokú toleranciu voči glyfosátu, ale nemajú žiadne nevýhody vo vzťahu k ostatným agronomickým vlastnostiam, ako je napríklad rast, výnos, kvalita, rezistencia voči patogénom atď.Glyfosát-tolerantné rastliny cukrovej repy podľa tohto vynálezu sa vyznačujú tým, žea) DNA-fragment genómovej DNA rastliny cukrovej repy, jej častí alebo semíen môže byť ampliñkovaný pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s prvým primerom,ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N 0 3, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO 4, pričom tento DNA-fragment má minimálne 95 identitu so SEQ ID NO 6, a/alebob) DNA-fragment genómovej DNA rastliny cukrovej repy, jej častí alebo semíen môže byt ampliñkovaný pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s prvým primerom,ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ lD NO 9, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO 10, pričom tento DNA-fragment má minimálne 95 identitu so SEQ lD NO 12, a/aleboc) DNA-fragment genómovej DNA rastliny cukrovej repy, jej časti alebo semíen môže byť ampliñkovaný pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s prvým primerom,ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ lD N 0 14, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ lD N 0 16, pričom tento DNA-fragment má minimálne 95 identitu so SEQ lD NO 17.Polymerázová retazová reakcia (PCR) je dobre známa štandardná metóda, ktorá sa použiva k amplifikácíi molekúl nukleových kyselin (viď napr. US 4,683,202).Rastliny cukrovej repy podľa tohto vynálezu (ďalej označené ako udalosť H 7-1) vykazujú vysokú toleranciu voči glyfosátovým herbicídom. Okrem toho nie sú transfonnačným postupom ovplyvnené rastové a ďalšie agronomícké vlastnosti udalosti H 7-1. Udalosť H 7-1 exprimuje agrobakteriálny gén CP 4-EPSPS, ktorý je stabilne integrovaný do rastlinného genómu a odovzdáva glyfosátovú toleranciu na vysokej úrovni. Rastlina bola pripravená agrobaktériou sprostredkovanou transformačnou technikou s použitím binárneho vektora PV-BVGTO 8. Tento Vektor obsahoval medzi ľavou a pravou hraničnou oblasťou (Borderregion) nasledujúce sekvencie kódujúcu oblasť, pozostávajúcu zo sekvencie kódujúcej chloroplastový tranzitný peptid génu EPSPS z Arabidopsís thaliana (označený ako ctp 2),náležiaci ku kódujúcej sekvencii CP 4-EPSPS regulovaný promotorom vírusu mozaiky krtičniku (Fígwort mosaic virus - pFMV) a E 9-3- transkripčného terminátora z Pisum sativum.Vjednom výhodnom prevedení vynálezu vykazujú 3706-bp-, 751-bp- a 1042-bp-DNA fragmenty identitu najmenej 95, výhodne najmenej 99 , zvlášť výhodne najmenej 99,9 s nukleotidovými sekvenciami SEQ lD NO 6, SEQ lD NO 12 alebo SEQ ID NO 17. 95 identita napriklad znamená, že 95 nukleotidov danej sekvencie je identických sporovnávacou sekvenciou. Na tento účel môžu byť sekvencie porovnané pomocou programu BLAST (napriklad k dispozicii na http/lwvvw.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl 2 seq/bl 2.html). Najvýhodnejšie vykazuje 3706-bpDNA-fragment nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO 6, 751-bp-DNA-fragment nukleotidovú sekvenciu SEQ lD NO 12 alalebo 1042-bp-DNA-fragment nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO 17.Tento vynález sa týka takisto semien, uložených v NCIMB, Aberdeen (Škótsko, Spojené kráľovstvo), pod pristupovým číslom NCIMB 41158 alebo NCIMB 41159. Také semená je možné použiť pre získanie rastliny glyfosát-tolerantnej cukrovej repy. Semeno môže byt vysiate a vyrastajúca rastlina bude tolerantná voči glyfosátu.Vynález sa týka takisto bunky, pletiva alebo časti rastliny glyfosát-tolerantnej cukrovej repy.lný aspekt tohto vynálezu spočíva v postupe pre identifikáciu rastliny glyfosát-tolerantnej cukrovej repy, vyznačujúci sa tým, že postup zahŕňa krok/-ya) ampliñkácie DNA-fragmentu 3500-3900 bp. výhodne 3706 bp, z genómovej DNA rastliny cukrovej repy, alebo jej častí alebo semien, polymerázovou reťazovou reakciou s prvým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ ID NO 3, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 4 a/alebob) amplitikácie DNA-fragmentu 710-790 bp, výhodne 751 bp, z genómovej DNA rastliny cukrovej repy, alebo jej časti alebo semien, polymerázovou reťazovou reakciou s prvým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 9, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 10 a/aleboc) ampliflkácie DNA-fragmentu 990-1100 bp, výhodne 1042 bp, zgenómovej DNA rastliny cukrovej repy, alebo jej časti alebo semien, polymerázovou reťazovou reakciou s prvým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ ID NO 14, a s druhým primerom, ktorý má nukleotidovú sekvencíu SEQ ID NO 16.Postup umožňuje detekciu transgénnej rastliny glyfosát-tolerantnej cukrovej repy pomocou štandardných metód molekulámej biológie.vynález sa okrem tohto týka takisto testovacej sady pre identifikáciu transgénnej rastliny glyfosát-tolerantnej cukrovej repy, jej buniek, pletiv alebo častí, obsahujúcej najmenej jeden pár primerov sjedným prvým a jedným druhým primerom pre polymerázovú reťazovú reakciu, pričom prvý primer rozpoznáva sekvencíu do genómu rastliny vnesenej cudzorodej DNA. druhý primer sekvencíu vo vnútri okrajových 3- alebo 5- oblasti DNA, pričom rastlina je rastlina podľa Nároku 1.Podľa jedného výhodného prevedenia vynálezu sa lestovacia sada vyznačuje tým, že a) prvý primer vykazuje nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 9 a druhý primer vykazuje nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 10, a/alebo ý b) prvý primer vykazuje nukleotidovú sekvencíu SEQ ID NO 14 a druhý primer vykazuje nukleotidovú sekvencíu SEQ ID NO 16.Výhodne vykazuje prvý primer nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 9 alebo SEQ ID NO 14 a druhý primer vykazuje nukleotidovú sekvencíu SEQ lD NO 10 alebo SEQ lD NO 16. Nasledujúce obrázky slúžia na objasnenie vynálezu. UkazujúObr. 1 Mapa binárneho vektora a PV-BVGT 08.

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/68, A01H 5/00, C12N 15/82

Značky: rastlina, glyfosát-tolerantná, cukrovej

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/58-e13107-glyfosat-tolerantna-rastlina-cukrovej-repy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Glyfosát-tolerantná rastlina cukrovej repy</a>

Podobne patenty