Vymazania v doméne II Pseudomonas exotoxínu, ktoré znižujú non-špecifickú toxicitu

Číslo patentu: E 17950

Dátum: 04.09.2008

Autori: Fitzgerald David, Pastan Ira, Weldon John

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Posledné roky boli vyvinuté imunokonjugáty ako alternatívny terapeutický prístup k liečbe zhubných nádorov. Imunokonjugáty boli pôvodne zložené zprotilátky chemicky spojenej srastlinným alebo bakteriálnym toxinom, čo je forma známa ako imunotoxin. Protilátka sa viaže k antigénu exprimovanému na cieľovej bunke a toxín je internalizovaný,zapríčiňujúc bunkovú smrť pozastavením syntézy proteínov a vzbudením apoptózy(Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 22439-446 (1996. Neskôr sú gény kódujúce protilátku a toxln fúzované a imunotoxin je exprimovaný ako fúzny proteín.0002 Na použitie s imunotoxínmi boli prispôsobené rôzne rastlinné, fungálne a bakteriálne imunotoxíny vrátane ricínu, diphtería toxínu a Pseudomonas exotoxlnu A (PE) (Pastan, I. et al., Nat Rev Cancer, 62559-565 (2006) Pastan, l. et al., Annu Rev Med, 58221-237 (2007. Na PE založené imunotoxíny sa v súčasnosti klinicky skúšajú na liečbu CD 22- exprimujúcich lymfómov a leukémil, ako aj mezotelín exprimujúcich tuhých nádorov (Kreitman, R., et al., J Clin Oncol, 231371943729 (2005) Hassan, R., Clín Cancer Res, 1325144-5149 (2007. Typicky bolo PE zastrihnuté alebo zmutované, aby sa znížila jeho nešpeciñcká toxicita pri zachovaní jeho toxicity pre bunky, na ktoré je zameraný zameriavacou zložkou imunotoxínu. V priebehu rokov bolí vyvinuté početné mutované a zastrihnuté formy PE. Formou používanou najčastejšie v klinických skúškach je forma skrátená o 38 kD, ktorá sa označuje ako PE 38.0003 W 0 2008/052322 zverejňuje zastrihnutú formu Pseudomonas exotoxlnu A, ktorý sa skladá z aminokyselín 252 až 608 alebo ich variant.0004 Napriek týmto dekádam úsilia nie sú súčasné na PE založené imunotoxíny úplne uspokojujúce. Aj ked PE 38 imunotoxíny, ktoré sa dostali na klinické skúšky, sú v porovnanípri nízkych dávkach dobre tolerované, dávku obmedzujúce toxicity obmedzujú ich ~terapeutický účinok. V prvej fáze klinickej skúšky na PE založeného imunotoxínu známeho ako LMB-2 dávku obmedzujúce toxicity nad 40 mg/kg podávané každý druhý deň (QOD) X 3 pozostávali zo zvýšenia výskytu tranzaminázy, hnačky, kardiomyopatie a alergickej reakcie(Kreitman, R.J. et al, J Clin Oncol, 1811622-1636 (2000. V prvej fáze klinickej skúšky antimezotelínového imunotoxínu, na ktorý sa odkazuje ako na SS 1 P, sa ako dávku obmedzujúce ukázali nepriaznivé udalosti ako peluritlda, utikaria asyndróm vaskulárnej priepustnosti (Hassan, R. et al., Clin Cancel Res, 131144-5149 (2007. V prvej fáze klinickej skúšky tretieho na PE založeného imunotoxínu, BL 22, dávku obmedzujúce toxicity zahŕňali niekolko prípadov hemolytického uremíckého syndrómu a syndrómu uvoľňovania cytokinu so syndrómom systémového vaskulárneho prepúšťania (Kreitman, R.J. et al., J Clin Oncol,2316719-6729 (2005.0005 Okrem toho sú na PE založené imunotoxíny, ktoré sú vsúčasnosti vklinických skúškach, vysoko imunogénne. Toto sa nepreukázalo ako problém pri liečbe hematologických zhubnostl, pri ktorých je schopnosť imunitného systému reagovať často narušená. imunotoxíny môžu byť zväčša pacientom s hematologickými zhubnými nádormi podávané viackrát. Pacienti s tuhými nádormi si však väčšinou vyvinú protilátky k na PE založeným imunotoxínom už niekoľko týždňov po prvom podani. Keďže množstvo protokolov vyžaduje trojtýždňové obdobie medzi podávanlm imunotoxinov, vyvinutie protilátok počas tohto obdobia vpodstate znamená, že pre tuhé nádory môže byt uskutočnené iba jedno podanie na PE založeného imunotoxínu predtým, ako ho protilátky pacienta neurobia neúčinným. Dokonca aj jediné podanie na PE založeného imunotoxínu však môže byť značne užitočné na zníženie pacientovej nádorovej záťaže, elimináciu menších metastáz a zmiernenie symptómov. no možnosť podania viacerých dávok by bola jasne užitočné.0006 Bolo vyvinutých iba niekoľko prístupov na adresovanie týchto problémov. Jeden pristup zníženia nešpeciñckej toxiclty pozostávajúci zo zníženia izoelektrického bodu rámcových oblastí Fv používaného ako zameriavacieho podielu imunotoxínov bol uverejnený vspoločne vlastnenej PCT prihláške č. PCT/US 01/43602 publikovanej ako medzinárodná prihláška č. W 0 02/40545. Prístup k zníženie imunogenicity je opísaný vspoločne vlastnenej PCT prihláške č. PCT/US 06/028985, publikovanej ako W 0 2007/016150, ktorá uverejňuje mapovanie rôznych epitopov PE amutácií jednotlivých aminokyselinových rezíduí, ktoré môžu byť kombinované, aby sa znížila celková imunogenicita výslednej PE molekuly v porovnaní s PE 38. Napriek tomu by bolo žiaduce mať k dispozícií ďalšie prístupy znižujúce dávku obmedzujúcu toxicitu imunotoxinu. Okrem toho by bolo žiaduce mať kdispozícii ďalšie prístupy na zníženie imunogenicity PE a imunotoxlnov, v ktorých PE pôsobí ako toxický podiel. zverejnený vynález uspokojuje tieto a iné potreby.0007 V prvom aspekte vynález poskytuje izolovaný, zmutovaný Pseudomonas exotoxin A(PE) zahŕňajúci sekvenciu so vzorcom R -FCS-R 2-R 3-PE funkčná doména lll, v ktoromn O alebo 1 nezávisle pre každé z R 1, R 2 a R 3FCS furlnová reštrikčná sekvencia rezldul aminokyselín, táto sekvencia je štiepiteľná furínom a má aminokyselinový koniec a karboxylový koniec, pričom FCSa) je zastúpené vzorcom P 4-P 3-P 2-P 1, kde P 4 je aminokyselinové rezíduum na aminokyselínovom konci, P 1 je aminokyselinové rezíduum na karboxylovom konci, P 1 je arginínové alebo Iysínové rezíduum a daná sekvencia je štiepitelná na karboxylovom konci P 1 furínomb) (i) ďalej zahŕňa aminokyselinové rezíduá zastúpené s P 6-P 5 na danom amino konci, (ii) ďalej zahŕňa aminokyselinové rezíduá zastúpené s P 1-P 2 na danom karboxylovom konci, (iii) dalej ak P 1 je arginínové alebo Iysínové rezíduum, P 2 je tryptofan a P 4 môže byť arginin, valin alebo lysín, no platí že ak P 4 nie je arginín, potom sú P 6 a PZ základné rezíduá a (iv) daná sekvencia je štíepitelná na svojom karboxylovom konci P 1 furínomc) je vybratá zo SEQ ID NO.12-20 ~d) je SEQ lD N 0210 alebo jej zastrihnutá verzia zahŕňajúca RQPR (SEQ ID NO 21) aleboe) je SEQ ID N 0211 alebo jej zastrihnutá verzia zahŕňajúca RSKR (SEQ ID N 026)R 1 alebo viacero súvislých rezíduí z rezíduí 365-394 SEQ lD N 01PE funkčnú doménu lII tvoria rezíduá 395-613 SEQ lD N 01, nepovinne zahŕňa (i) substitúcie vjednom alebo viacerých rezíduách zodpovedajúce 609-613 SEQ ID N 01, (ii) substitúciu glycinu, alanínu, valínu, Ieucínu alebo izoleucínu pre arginin na pozícii zodpovedajúcej pozícii 490 SEQ ID N 01, (iii) substitúciu alanínu, glycinu, serínu alebo glutamínu pre jeden alebo viacero rezíduí zodpovedajúcich reziduám vybratým z D 403,R 412, R 427, E 431, R 432, R 458, D 461, R 467, R 505, R 513, E 522, R 538, E 548, R 551, R 576,K 590 a L 597 SEQ ID N 01, pričom rezíduá zo SEQ lD N 01 si zachovávajú imunogenicitu epitopu alebo subepitopu PE domény lII, alebo (iv) kombináciu čohokoľvek z (i) až (iii),pričom zmutované PE nezahŕňajú rezíduá 1 až 273 a 185 až 364 SEQ ID N 01.0008 V druhom aspekte vynález poskytuje chimérickú molekulu zahŕňajúcua) Cytokín, protilátku alebo fragment protilátky, pričom tento cytokín, protilátka alebo fragment protilátky sa špecificky viaže k antigénu alebo receptoru na povrchu bunky spojenému alebo fúzovanému sob) zmutovaným PE v súlade s ktorýmkorvek uskutočnením prvého aspektu vynálezu 5.0009 V niektorých uskutočneniach môže byť FCS reprezentovaná vzorcom P 4-P 3-P 2-P 1(SEQ ID N 0236), pričom P 4 označuje amino koniec, P 1 označuje karboxylový koniec, P 1 je arginínové reziduum a sekvencia je štiepitelná na svojom karboxylovom konci P 1 furínom. V niektorých uskutočneniach FCS (i) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 6-P 5 na danom amino-konci, (ii) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 1 ~P 2 na danom karboxylovom konci, (iii) ďalej ak P 1 je arginínové reziduum, P 2 je tryptofan a P 4 môže byť arginín, valln alebo lysin, no plati, že ak P 4 nie je arginín, potom sú PG a P 2 základné reziduá a (iv) daná sekvencia je štiepitelná na svojom karboxylovom konci P 1 furlnom. V niektorých uskutočneniach je FCS SEQ lD N 0210. V niektorých uskutočneniach PE funkčná doména lll pozostáva zo sekvencie rezidui 395 až 613 SEQ lD N 011. V niektorých uskutočneniach zmutovaný PE zahŕňa jeden alebo viacero súvislých rezidui z rezidui 365-394 SEQ lD N 021 medzi danou FCS a danou PE doménou lll. V niektorých uskutočneniach n je 0 pre R, R 2 a R 3. V niektorých uskutočneniach je ligand protilátkou alebo jej fragmentom, ktorý si zachováva schopnosť rozpoznávať antigén.0010 V treťom aspekte vynález poskytuje chimérickú molekulu na požlvanie na inhibíciu rastu cieľovej bunky s vonkajšou časťou a daná chimérická molekula zahŕňa(a) cytokín, protilátku alebo fragment protilátky s tým, že daný cytokín, protilátka alebo fragment protilátky sa špeciñcky viažu k antigénu alebo receptoru na exteriéri danej bunky, a je spojený alebo fúzovaný so(b) zmutovaným PE v súlade s ktorýmkolvek uskutočnením prvého aspektu vynálezu.0011 V niektorých uskutočneniach môže byť FCS reprezentovaná vzorcom P 4-P 3-P 2-P 1(SEQ lD N 0236), v ktorom P 4 označuje amino koniec, P 1 označuje karboxylový koniec, P 1 je arginínovým rezíduom a daná sekvencia je štiepiteľná na karboxylovom konci Pl furínom. V niektorých uskutočneniach FCS (i) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 6 P 5 na danom amino konci, (ii) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 1-P 2 na danom karboxylovom konci, (iii) ďalej ak P 1 je arginínové reziduum, P 2 je tryptofan a P 4 môže byť arginín, valín alebo lysin, no platí že ak P 4 nie je arginín, potom sú P 6 a P 2 základné reziduá a (iv) daná sekvencia je štiepitelná na svojom karboxylovom konci P 1 furínom. V niektorých uskutočneniach je FCS SEQ ID N 0210. V niektorých uskutočneniach PE funkčná doména lll pozostáva zo sekvencie rezidui 395 až 613 SEQ ID N 021. V niektorých uskutočneniach zmutovaný PE zahŕňa jeden alebo viacero súvislých rezidui z rezidui 365-394 SEQ ID N 021 medzi danou FCS adanou PE doménou Ill. Vniektorých uskutočneniach n je O pre R 1, R 2 a R 3. V niektorých uskutočneniach je ligand protilátkou alebo jej fragmentom ktorý si zachováva schopnosť rozpoznávať antigén.0012 Vo štvrtom aspekte vynález poskytuje izolovanú kyselinu nukleovú a daná kyselina nukleová kóduje zmutovaný PE vsúlade sktorýmkolvek uskutočnením prvého aspektu vynálezu.0013 V niektorých uskutočneniach môže byť FCS reprezentovaná vzorcom P 4-P 3-P 2-P 1(SEQ ID NO.36), v ktorom P 4 označuje amino koniec, Pl označuje karboxylový koniec, P 1 je arginínovým rezíduom a daná sekvencia je štiepiteIná na karboxylovom konci P 1 furínom. V niektorých uskutočneniach FCS (i) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 6 P 5 na danom amino konci, (ii) ďalej zahŕňa aminokyselinové reziduá zastúpené s P 1-P 2 na danom karboxylovom konci, (iii) ďalej ak P 1 je arginínové reziduum, P 2 je tryptofan a P 4môže byt arginín, valín alebo iysín, no plati že ak P 4 nie je arginín, potom sú P 6 a P 2 základné rezíduá a (iv) daná sekvencia je štiepiterná na svojom karboxylovom konci Pi furínom. V niektorých uskutočneniach je FCS SEQ lD N 0210. V niektorých uskutočneniach PE funkčná doména lll pozostáva zo sekvencie rezíduí 395 až 613 SEQ ID NO 1. V niektorých uskutočneniach zmutovaný PE zahŕňa jeden alebo viacero súvislých rezidui z rezíduí 365-394 SEQ ID NO 1 medzi danou FCS a danou PE doménou IIi. V niektorých uskutočneniach n je 0 pre R 1, R 2 a R 3. V niektorých uskutočneniach je Iigand protilátkou alebo jej fragmentom ktorý si zachováva schopnost rozpoznávať antigén.Obrázky 1 A a 1 B. Obrázok 1 A je schémou štruktúry anti-CD 22 imunotoxínu známeho ako HA 22. HA 22 zahŕňa disulñdom spojený Fv (VHNL) anti-CD 22 fragment protilátky rekombinantne pripojený k 28 kD cytotoxickému skráteniu Pseudomonas exotoxínu A (PE,38 kD skrátenie je vtejto oblasti známe ako PE 38). PE 38 je vytvorené vymazanim natívnych PE rezíduí 1-252, ktoré zodpovedajú doméne l, z aminokyselinovej sekvencie rezíduí 613, popri rezíduách 365-380 domény lb. Obrázok 1 B znázorňuje sekvencíu P 38 domén Il (rezíduá 251-364) a lb (rezíduá 365-394) (SEQ ID NO 4). Čísiovanie rezíduí je založené na aminokyselinovej sekvencii natívneho PE. Zostatky 365 až 380 z natívneho PE(orámovaný) boli vymazané pri tvorbe PE 38. Miesta štiepenia Iysosomálnej proteázy sú označené šípkami spojenými s označení ich zodpovedajúcich častí z analýzy SDS-PAGE. Miesta štiepenia Iysosomálnej proteázy sa vyskytujú medzi rezíduami 260-261, 265-266,297-298, 341-342, 342-343, 351-352, 352-353, 353-354, 364-381, 390-391 a 391-392. Označené je tiež furinové reštrikčné miesto (279-280). 11-reziduová na furin citlivá sekvencia v doméne il z HA 22-LR je zatienená.Obrázok 2. Obrázok 2 je schémou štruktúry HA 22 mutanta JW 008. JW 008 je formou HA 22, ktorá má rovnaké skrátenia PE 38 ako HA 22 LKR, ale v ktorej bola natívna sekvenciafurínom štiepiteľnej sekvencie rezíduí 274-284 pozmenená substitúciami dvoch rezíduíObrázok 3. Obrázok 3 znázorňuje schematické nákresy HA 22 a sérií variantov, v ktorých boli výmazy zavedené do domén ii a lb PE 38 zložky HA 22, aby sa odstránili reštrikčné miesta lysosomáinej proteázy. Týchto päť mutantných proteínov (M 1, M 2, M 3, M 4 a M 5) je ilustrovaných s použitím rozšíreného pohľadu na domény il a lb PB 38, aby sa ukázal rozsah výmazov (bodkované čiary) a prítomnosť v M 3 a M 4 C 2878 bodovej mutácii. Čísiovanie rezíduí je založené na umiestnení aminokyselín vnatívnom PE. Proteíny boli následne puriñkované a porovnané s HA 22 s použitím in vitro testu cytotoxicity na Raji bunkách. Na proteín M 5 sa tu odkazuje aj ako na HA 22-LR (SEQ ID N 0210). i 05., (ng/ml) každého mutanta vzhľadom k IC 5 o HA 22 zodpovedá priemeru aspoň troch nezávislých experimentov.Obrázok 4. HA 22-LR je odolný voči tráveniu s Iysosomàlnymi extraktmi. HA 22 a HA 22-LR boli inkubované slysosomálnymi extraktmi Raji buniek pod identickými podmienkami. Následne po pridaní iysosomáinych extraktov boli vzorky odstránené bezprostredne (O), po 30 minútach apo 1, 2, 4, 8 A 24 hodinách a následne analyzované redukujúcou SDSPAGE. Šípky označujú VL, VH-PE 38 (HA 22) A VH-PE 25 (HA 22-LR) pásma ktoré zahŕňajú vyspelé ímunotoxiny.Obrázok 5. Farmakokinetiká HA 22-LR. Balb/C myšiam bolo intravenózne vstreknutých 10 mg HA 22 (h) alebo HA 22-LR a tie krvácaii v rôznych intervaloch medzi 2 a 60 minútami od času podania injekcie. Koncentrácia imunotoxínu v sére v rôznych intervaloch bola zistená s ELISA a bola nastavená ne jedinú exponenciálnu funkciu rozkladu. Zodpovedajúci polčas

MPK / Značky

MPK: C12N 15/62, A61K 38/16, C07K 19/00, C07K 14/21, C12N 15/11

Značky: toxicitu, vymazania, doméne, exotoxínu, znižujú, pseudomonas, non-špecifickú

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/55-e17950-vymazania-v-domene-ii-pseudomonas-exotoxinu-ktore-znizuju-non-specificku-toxicitu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Vymazania v doméne II Pseudomonas exotoxínu, ktoré znižujú non-špecifickú toxicitu</a>

Podobne patenty