Analýza a typizácia monoklonálnych proteínov pomocou kapilárnej elektroforézy a imunopresunu

Číslo patentu: E 5686

Dátum: 09.11.2004

Autori: Robert Frédéric, André Régis

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Vynález sa týka oblasti analýzy biologických vzoriek pomocou kapilárnej elektroforézy a imunopresunu.0002 Predmetom vynálezu je najmä spôsob analýzy biologických vzoriek kapilárnou elektroforézou, pri ktorej je elektroforetická separácia zložiek vo vzorke sprevádzaná spracovaním vzorky imunologlckou technikou. V rámci predloženej prihlášky vynálezu termín imunosubtrakcíď označuje odstránenie píkov niektorých proteínov v elektroforetíckom profile imunopresunom týchto proteínových píkov na iné miesto profilu.0003 Predmetom vynálezu je predovšetkým spôsob aplikovateľný v diagnostických protokoloch atýka sa najmä vyhľadávania atypizácie proteínov vbiologických vzorkách, ktoré poukazujú na mono-klonálne ochorenia nazývané aj monoklonálne gamapatie či paraproteinémie.0004 Normálny vývoj Iymfocytov B vedie na povrchu dospelých Iymfocytov B k produkcii izotypov gamaglobulínov M aG, ktoré majú spočiatku spoločné idiotypy. Plazmatické poruchy, ktoré sú pôvodom monoklonálnych ochorení, vedú k poruche riadenia procesu dospievania buniek do formy buniek vylučujúcich protilátky po expozícii špecifickým antigénom povrchového imunoglobullnu. Vtejto situácii imunoglobulíny s afinitou voči antigénu, voči ktorému bol hostíteľ exponovaný, sú nadalej vylučované aj po vymiznutí antigénu. Vo všeobecnosti, imunoglobulíny určitého druhu sú rozmiestnené v rôznych triedach protilátok, pričom každá trieda sa odlišuje na základe jedného izotypu a rôzne izotypy identifikované vrámci jedného druhu sú spoločné pre všetky normálne jedince tohto druhu. imunoglobulíny sú vo všeobecnosti tvorené ťažkými reťazcami (2 ťažké reťazce) a ľahkými reťazcami (2 ľahké reťazce). Na základe tejto štruktúry so štyrmi reťazcami bolo identifikovaných páť izotypov ťažkých reťazcov (izotypy M, G, A, D, E) a dva izotypy ľahkých reťazcov (izotypy Kappa a Lambda). Okrem izotypov sú imunoglobulíny charakteristické determinantmi zodpovedajúcimi rozdielom medzi jedincami rovnakého druhu nazvanými alotypy ako aj idiotypom zodpovedajúcim časti molekuly imunoglobulínu viažucej antigén. ldiotyp sa teda vyznačuje molekulami produkovanými daným klonom buniek produkujúcich protilátky.0005 Plazmatické ochorenia sa vyznačujú najmä zmenou tvorby určitých imunoglobulínov alebo niektorých reťazcov imunoglobulínov a detekcia a charakterizácia týchto zmien má očivídný klinický vyznam.0006 Elektroforetická analýza biologickej vzorky umožňuje identitikovať sérové proteíny a určiť ich množstvo, najmä pokiaľ ide o imunoglobulíny. Proteíny sa v elektrickom poli pohybujú v závislosti od ich rozmeru a náboja, pričom vytvárajú elektroforetický profil pozostávajúci zo série píkov(nazývaných aj frakcie), z ktorých každý zodpovedá jednému alebo viacerým proteínom. Frakcia nazývaná gama je tvorená najmä imunoglobulínmi, hlavne typu G. U pacientov trpiacich plazmatickým ochorením, ktoré vedie kvylučovaniu monoklonálnych proteínov (nazývaných aj proteíny Mc) môže byt množstvo imunoglobulínov zodpovedajúcich jednému zo známych izotypov zvýšené významne oproti normálu, čo vedie k zmene elektroforetického profilu vo forme modifikácie píkov separovaných proteínov vo vzorke séra.0007 Detekcia monoklonálnych proteínov azvlášt detekcia zvýšenia produkcie určitého izotypu imunoglobulínu predstavuje preto zjavný záujem pre výskum plazmatických ochorení, ale aj pre sledovanie pacientov trpiacich paraproteinémiami. Bolo napr. pozorované, že množstvo sérového proteínu Mc môže v určitých prípadoch, najmä pri vývoji nádoru, priamo súvisíet s postupovaním ochorenia. Určitý proteín Mc môže teda predstavovať markér, ktorý, pokial koreluje s ostatnými symptómami, môže byť zobraný do úvahy pri stanovení diagnózy.0008 Plazmatické ochorenia nie sú jediné, ktoré sa vyznačujú abnormálnou produkciou proteínov Mc. Spomedzi patologických porúch spojených sprodukciou proteínov Mc možno spomenúť lymfoidné neoplazmy, ako je chronická lymfoidné leukémia alebo lymfómy lymfocytového pôvodu B alebo T, niektoré nelymfoidné proliferácie, ako sú chronická myeloidná leukémia, rakovina prsníka alebo čreva.0009 Monoklonálne proteíny Mc môžu byt tiež produkované pri niektorých nezhubných ochoreniach, ako je cyrhóza, sarkoidóza, parazitózy alebo Gaucherova choroba. Okrem toho je známa produkcia monoklonálnych proteínov pri autoimunitných ochoreniach, ako je reumatická polyartritida, myasténia alebo choroba studených aglutinínov.0010 Elektroforéza na agarózovom géle alebo kapilárna elektroforéza umožňujú detekciu prítomnosti monoklonálnych proteínov v biologických vzorkách a sledovanie vývoja detegovaných monoklonálnych proteínov včase, vdaka čomu patria medzi výberové spôsoby užitočné pri stanovení diagnózy a sledovaní pacientov.g 0011 Vzávislosti od príslušného ochorenia má protein Mc rôznu povahu apozostáva buď z intaktnej molekuly protilátky alebo jej fragmentu. Ťažké alebo ľahké reťazce sa môžu teda tvoriť samostatne. Patria sem napr. Bence-Jonesove proteíny vylučované v moči pacientov trpiacich na myelómy a sú tvorené jedine ľahkými retazcami.0012 Určené izotypy imunoglobulínov umožňujú typizovať proteíny Mc podľa povahy ich ťažkého reťazca a/alebo podľa povahy ich ľahkého reťazca. Technika použitá na typizovanie imunoglobulínov umožní teda určiť typ ťažkých a/alebo ľahkých reťazcov asocíovaných s každým monoklonalnym proteínom prítomným v biologickej vzorke.0013 Okrem detekcie prítomnosti proteínov Mc sa ukazuje ako dôležité určiť ich typy, aby bolo možné charakterizovať ochorenia, ktoré s nimi súvisia. S týmto cieľom bolí už navrhnuté rôzne prístupy, ako kolónová Chromatografia, elektroforéza na agarózovom géie a kapilárna elektroforéza. Pomocou spôsobov využívajúcich eiektroforézu na agarózovom géie sú proteíny v biologickej vzorke separované elektroforézou vo forme elektroforetického profilu, v ktorom proteíny, najmä globuliny, sú detegované vo forme píkov alebo prúžkov, ktoré majú tendenciu obsahovať jeden monoklonálny proteín, ktorého povahu treba následne potvrdiť napr. technikou imunotixácie na agarózovom géle. Táto technika kombinuje dve etapy založené na elektroforéze na agarózovom géie a následne na imunoprecipitácii. Na agarózový gél sa nanesie paralelne viac ráz biologická vzorka. Aplikovaním elektrického poľa dôjde kseparácii proteínov, hlavne imunoglobulínov špecifických voči hľadaným imunoglogulínom (lgG, lgA, IgM, kappa a lambda, pripadne kappa voľný, lambda voľný, IgD a IgE), čo vedie k tvorbe imuno-komplexov medzi imunoglobulínmi vzorky aprotilátkami. Po premyti gélu umožňujúcom odstrániť nevyzrážané proteíny sa farbením určí poloha imunokomplexov - ak vo vzorke nie sú monoklonálne proteíny, objaví sa iba difúzne sfarbené pozadie (zodpovedajúce množstvu monoklonálnych protilátok predstavujúcich polykionálne pozadie). Ak sú prítomné monoklonálne proteíny, objavia sa príslušných miestach gélu farebné prúžky. Pomocou referenčnej stopy (bez antiséra) možno takto určiť typ každého monoklonálneho prúžku viditeľného na géle.0014 Jednou z techník typizácie používaných pri kapilárnej elektroforéze je imunosubtrakcie, ktorá bola opísaná v patente US 5,228,960. Táto technika spočíva v inkubovaní biologických vzoriek so špecifickými protilátkami schopnými odstrániť určitú zložku (napr. imunoglobulíny) v danej vzorke. Táto zložka zostáva adsorbovaná na tuhej fáze, na ktorej bola ñxovaná protilátka - z toho dôvodu nebude prítomná vo vzorke analyzovanej kapilárnou elektroforézou. Rôzne spracované vzorky,zktorých boli odstránené určité imunoglobullny, sa potom nadávkujú do kapiláry a vních obsiahnuté proteíny sú následne separované aplikovaním elektrického poľa na koncoch kapiláry. Získané profily sú potom porovnané s profilom nespracovanej vzorky.0015 Vpatente EP O 690 988 (B 1) boli navrhnuté iné techniky identifikácie monoklonálnych proteínov separovaných vo vzorke kapilárnou elektroforézou. Uvedený európsky patent opisuje kombináciu separácie kapilárnej elektroforézy s etapou imunosubtrakcie s cieľom uľahčiť klasifikáciu proteínov Mc. Podľa patentu sa odčltanie realizuje priamo v kapiláre pomocou spôsobu pozostávajúceho zetapy elektroforetickej separácie prvej časti vzorky na jednotlivé zložky adetekcie týchto zložiek. Zmes druhej časti vzorky snajmenej jedným partnerom schopným špecificky viazať určený analyt vo vzorke, pričom špeciálny partner pre túto väzbu má inú elektroforetickú pohyblivost ako daný analyt. Druhá časť vzorky sa potom separuje na jednotlivé zložky a zložky sú detegované. Potom nasleduje etapa porovnania separovaných zložiek so zložkami separovanými v neprítomnosti partnerov viažucich špecificky hľadaný analyt.0016 Európsky patent EP 0 690 988 uvádza, že partner určený na viazanie analytov je modifikované molekula, napr. protilátka antiprotein Mc, ktorá bola podrobená chemickej modifikàcii takým spôsobom, aby jej čas migrácie pri kapilárnej elektroforéze bol mimo oblasti Gama elektroforetického profilu. Bola navrhnutá chemická modiñkácia protilátok reakciou ssukcínanhydridom, aby sa zvýšil obsah karboxylových skupín, ktoré majú záporný náboj v alkalickom pH. Pri opísaných podmienok analýzy (pH 10) bol zvýšený celkový záporný náboj protilátok.0017 Opisané podmienky uskutočnenia modiñkácie protilátok podľa európskeho patentu EP 0690 988, ako aj uvedené experimentálne výsledky sa týkajú výlučne analýzy aseparácie purifikovaných imunoglobulínov G anie analýzy séra, čo vyvoláva pochybnosti ovhodnosti navrhovaného spôsobu na hľadanie monoklonálnych proteínov v reálnej biologickej vzorke, napr. v sere.0018 W 0 96/33412 opisuje kompozicie, spôsoby a zariadenie na ultra rýchle stanovenie viazaním, výhodne kapilárnou elektroforézou. Pri jednom spôsobe uskutočnenia je prvým3 partnerom na väzbu detegovateľná značka a druhý partner na väzbu (napr. protilátka), je modifikovaný tak, aby niesol silný náboj.0019 Uvádzajú sa príklady nabitých zložiek. Niektoré z nich pridávajú jeden alebo viac negatívnych nábojov každej modifikovanej funkčne skupine protilátky. Medzi nimi sú polyméry s viacerými kyslými karboxylovými skupinami viazané bifunkčným čínidlom.0020 Kombinácia vzorky obsahujúcej analyt, s ktorým môžu reagovat uvedení dvaja partneri a na ktorý sa môžu viazať, vedie k tvorbe trojzložkového komplexu. Rozdiel elektroforetíckej pohyblívosti voľnej formy a formy viazanej v komplexe s prvým znaćkovaným vázobným partnerom je taký, že umožňuje elektroseparáciu a následnú detekciu analytu. Kompozície, spôsoby a zariadenie opísané v tomto dokumente umožňujú kvantitatívne určit koncentráciu analytu vo vzorke. Týmto analytom môže byt monoklonálna protilátka. Opísané sú aj súpravy a kufríkové testy.0021 Tento vynález navrhuje alternatívny spôsob aplikovateľný účinne na biologickú vzorku spájajúci použitie kapilárnej elektroforézy na separáciu zložiek biologickej vzorky a imunosubtrakciu umožňujúcu typizovanie proteínov Mc, ak sú prítomné v analyzovanej biologickej vzorke.0022 Jednou zvýhod spôsobu podľa vynálezu je, že umožňuje presun elektroforetického píku zodpovedajúceho proteínu Mc, pokiaľ je prítomný v biologickej vzorke a bol Separovaný kapilárnou elektroforézou, mimo zóny zodpovedajúcej proñlu migrácie proteínov vzorky, najmä mimo zóny migrácie globulínov. Tento presun odstráni pík predstavujúci separovaný proteín Mc z očakávanej pozicie na začiatku etapy migrácie bez toho, aby došlo k interferencii so separáciou ostatných proteínov vzorky. Na rozdiel od spôsobu oplsaného v patente US 5,228,960, monoklonálny proteín rozpoznaný protilátkou je prítomný vo vzorke nastreknutej na uskutočnenie kapilárnej elektroforézy. Je iba odstránený z profilu, pretože je premiestnený z pôvodnej pozície. Vďaka tomu tento spôsob umožňuje spoľahlivé čítanie výsledkov analýzy a odstraňuje akúkoľvek nejasnost medzi susednými pí kmi zodpovedajúcimi separovaným proteínom vzorky.0023 vynález sa týka aj chemickej modifikácie protilátok s cieľom pridania funkčných skupín, ktoré sú valkalickom prostredí záporné (v tomto prípade karboxylové skupiny), reakciou niektorých funkčných skupín protilátky s modíñkujúcim činidlom - každá modifikované funkčná skupina dodáva potom protilátke niekoľko záporných nábojov. Tieto protilátky sa následne používajú na špecifickú imunosubtrakciulimunopresun pikov zodpovedajúcich proteínom Mc biologickej vzorky.0024 Takto pripravené protilátky podľa vynálezu v porovnaní s pôvodnými protilátkami, ktoré už samotné vykazujú v alkalíckom prostredí záporný náboj. vykazujú v alkalíckom prostredí výraznejší záporný náboj, ktorý im dodávajú pridané karboxylové skupiny. Tieto protilátky budú ďalej nazývané modifikované negatívne nabité protilátky alebo aj modifikované protilátky.0025 Cieľom vynálezu sú aj súpravy na uskutočnenie separácie proteínov v biologickej vzorke kapilárnou elektroforézou ana detekciu pomocou imunosubtrakcle, na identifikáciu aprípadnú kvantifikáciu monoklonálnych protilátok, ktoré by mohli byt obsiahnuté vtestovanej biologickej vzorke.0026 vynález sa týka aj spôsobu prípravy chemicky modifikovaných protilátok s cielom naviazania ďalšieho valkalickom prostredí negatívneho náboja (modifikované negatívne nabité protilátky),v takých podmienkach, aby ich bolo možné používat pri imunosubtrakcii.0027 vynález sa teda týka spôsobu kapilárnej elektroforetíckej analýzy biologickej vzorky pozostávajúci zaplikácie modifikovaných negatívne nabitých protilátkok takým spôsobom, aby migrovali mimo zóny migrácie proteínov v biologickej vzorke počas ich separácie elektroforézou,pričom spomínané protilátky vykazujú antigénnu špecifickosť voči určitému monoklonálnemu proteínu.0028 vynález je definovaný patentovými nárokmi.0029 Pri separácií proteínov v biologickej vzorke v kapiláre vyplnenej elektrolytom proteíny migrujú pod vplyvom elektrického poľa proteíny sú unášané a migrujú od anódy ku katóde. Rozdiel vsamotnej elektroforetíckej rýchlosti (súvisiacej s nábojom proteínu) a elektroosmotíckým tokom(súvisiacim s nábojom vnútorného povrchu kapiláry) umožňuje separovat proteíny, ktoré chceme stanoviť.0030 Proteíny vo vzorke nastreknutej do kapiláry definujú profil elektroforetíckej migrácie, ktorý možno rozdeliť na viacero zón ilustrovaných na obrázkoch tejto prihlášky vynálezu a zodpovedajú zónam gama (najbližšie ku katóde), beta 2, beta 1, alfa 2, alfa 1 a albumín (pričom táto posledná zóna je najbližšie k anóde). lmunoglobuliny, spolu s proteínmi Mc, v biologickej vzorke migrujú od zóny alfa 1 k zóne gama.0031 S cieľom najmä dosiahnut elektroforetickú separáciu monoklonálnych proteínov obsiahnutých v biologickej vzorke ako aj typízácie pomocou reakcie imunosubtrakcie autori vynálezu stanovili podmienky uskutočnenia imunosubtrakcie, ktoré umožňujú odstránenie píku-4 zodpovedajúceho monoklonálnemu proteínu z migračného profilu proteínov vo vzorke (a zvlášť z profilu migrácie globulínov) a jeho premiestnenie mimo oblastí medzi zónou gama a alfai.0032 Presnejšie povedané, hľadaný monoklonálny proteín vo vzorke nie je odstránený zanalyzovaného média, ale je premiestnený vplyvom väzby s modifíkovanou negatívne nabitou protilátkou, ktorú špecificky rozpoznáva, takže komplex medzi spomínaným monoklonálnym proteínom a modifíkovanou protilátkou je premiestnený mimo profilu migrácie globulinov vo vzorke(Globulíny zodpovedajú elektroforetickým frakciám gama, beta-Z, beta-1, alfa-z, aIfa-l na elektroforetickom profile).0033 Ešte presnejšie povedané, komplex proteínu Mc-protilátka nabitý negatívne v alkalickom pH sa nachádza po etape elektroforetickej migrácie vnajanodickejšej zóne profilu separovaných proteínov.0034 Komplex modifikovaná protilátka-proteín Mc je teda viditeľný mimo proñlu takto deñnovaného separovanými imunoglobulínmi, hlavne je oddialený od zóny gama smerom kalbuminu a alfa-i bez toho, aby sa tým zhoršovala prípadná detekcia anodického monoklonálneho proteínu (to znamená migrujúceho v alfa-1/alfa-2) pretože komplex má pohyblivosť medzi monoklonálnym proteínom a modifíkovanou protilátkou.0035 Modiñkovaná protilátka sa vzásade pridáva v reakčnom nadbytku a frakciu protilátok je vidiet smerom k anóde za píkom zodpovedajúcim aibumínu (čiže má viac anodickú migrácíu ako albumín .0036 Drvý spôsob podľa vynálezu na analýzu biologickej vzorky kapilárnou elektroforézou a imuno-subtrakciou pozostáva z nasledujúcich etápa) separácia zložiek v prvej časti biologickej vzorky kapilárnou elektroforézou v prítomnosti modifikovaných záporne nabitých protilátok s určenou antigénnou špecifickosťou schopných tvorit komplex typu antigen-protilátka s monoklonálnym proteínom, ktorý je prípadne prítomný v biologickej vzorke, a detekcia separovaných zložiek biologickej vzorkyb) porovnanie elektroforetickeho profilu ziskaného vetape a) selektroforetickým profilom zložiek druhej časti rovnakej vzorky separovanej kapilárnou elektroforézou v neprítomnosti uvedených modifikovaných záporne nabitých protilátok s určenou antigénnou špecitickosťou.0037 Na základe pozorovaní biologické vzorky obsahujú bežne frakciu polyklonálnych imunoglobulinov predstavujúcich polyklonáIne pozadie situované v oblasti gama (alebo vjej blízkosti) elektroforetického profilu. V podmienkach uskutočnenia kapilárnej elektroforézy vhodných na separáciu proteínov Mc sa tieto polyklonálne imunoglobuliny objavujú vo forme širšieho píku ako imunoglobuliny Mc (pretože obsahujú množstvo imunoglobulinov s veľmi blízkou pohyblivostou). Toto polyklonálne pozadie možno zredukovať po zmiešaní vzorky s modifikovanými záporne nabitými protilátkami vzávislosti od typu imunoglobulinov (G, A, M, kappa alebo Iambda). Rozlíšenie medzi monoklonálnym píkom apolyklonálnym pozadlm sa vtomto prípade robí na základe toho, že plk Mc je zakoncentrovanejší v porovnaní so širokým polyklonálnym pikom.0038 Podľa jedného z výhodných spôsobov aplikácie vynálezu sa rozdelí daná biologická vzorka na viacero častí, ktoré sa paralelne kontaktujú rôznymi protilátkami. čím sa vytvorí škála modifikovaných záporne nabitých protilátok, pričom každý typ protilátky tejto škály má známu antigénnu špecifickost voči jednému izotypu imunoglobulínu.0039 Takto možno uskutočniť paralelne analýzu tej istej biologickej vzorky pomocou uvedených modifikovaných záporne nabitých protilátkok s rôznou špeciñckosťou, pričom antigénna špecifickosť týchto protilátok sa vyberá v závislosti od hľadaných monoklonálnych proteínov, ktoré rozpoznajú protilátky, a ich počet závisí od počtu kapilár elektroforetického prístroja.0040 Podla ďalšieho špeciálneho spôsobu uskutočnenia vynálezu je pri vyššie uvedených spôsoboch biologická vzorka rozdelená na najmenej dve alikvótne časti aspôsob pozostáva z nasledujúcich etáp, predchádzajúcich separácií zložiek biologickej vzorky elektroforézou1) Zmiešanie média obsahujúceho modifikované záporne nabité protilátky surćenou antigénnou špecifickosťou sjednou alikvótnou časťou biologickej vzorky vinkubaćných podmienkach umožñujúcich imunologickú reakciu medzi uvedenými protilátkami a cielovým proteínom špecificky rozpoznávaným danými protilátkami, pokial je prítomný v biologickej vzorke, azmiešanie inej alikvótnej časti biologickej vzorky srovnakým médiom bez modifikovaných protilátok, 2) nastreknutie alikvótnych časti biologickej vzorky inkubovaných podľa etapy 1) do elektroforetickej kapiláry.

MPK / Značky

MPK: G01N 27/447, G01N 33/558, G01N 33/68, C07K 16/00

Značky: pomocou, imunopresunu, proteínov, analýza, monoklonálnych, kapilárnej, elektroforézy, typizácia

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/52-e5686-analyza-a-typizacia-monoklonalnych-proteinov-pomocou-kapilarnej-elektroforezy-a-imunopresunu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Analýza a typizácia monoklonálnych proteínov pomocou kapilárnej elektroforézy a imunopresunu</a>

Podobne patenty