Spôsob detekcie in vivo aktivity neurotrypsínu, použitie tohto spôsobu a C-koncového 22-kDa fragmentu agrínu ako biomarkera pri diagnóze a sledovaní porúch súvisiacich s neurotrypsínom

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Spôsob detekcie in vivo aktivity neurotrypsínu, použitie tohto spôsobu a C-koncového 22 kDa fragmentu agrínu ako biomarkera pri diagnóze a sledovaní porúch súvisiacich s0001 Vynález sa týka spôsobu detekcie in viva aktivity neurotrypsínu, použitia tohto spôsobu a C-koncového 22-kDa fragmentu agrínu ako biomarkera pri rôznych diagnostických aleboklinických aplikáciách, ktoré priamo či nepriamo súvisia s neurotrypsinom.0002 Biomarkery ukazujú na biologické javy prebiehajúce počas choroby alebo liečby. Biomarker je definovaný ako akýkoľvek charakteristický znak, ktorý môže byt objektívne meraný a vyhodnotený ako indikátor normálneho alebo patologickćho biologického procesu alebo farmakologická odpoveď na terapeutickú intervenciu. Rozdielne typy bíomarkerov ukazujú na molekulárne charakteristické rysy, fyziologické parametre (napr. krvný tlak,srdcový tep) alebo poskytujú obraz o určitom jave. Čo je dôležité, že poskytujú výstupné informácie, t.j. napríklad výsledok molekulámeho, bunečného alebo fyziologického mechanizmu, informácie o terapeutickom benefite alebo riziku terapeutickej intervencie. Použiteľné biomarkery by mali spĺňať dve kritériá, musia súvisieť s biologickými mechanizmami prebiehajúcími počas ochorenia alebo liečby a musia štatisticky korelovať0003 Neurotiypsín je serínová proteáza podobná trypsínu. Má unikátne zloženie domény(Proba et al., 1998). Pozostáva zbázickćho segmentu bohatého na prolín, jednej kringel domény (kringle), štyroch domén vychytávacích receptorov (scavenger receptor) bohatých na cysteín (SRCR) a proteázové domény.0004 Neurotrypsín je prevažne exprimovaný vneurónoch mozgovej kôry, hipokampu a amygdale (Gschwend et al., 1997). Imunoelektrónovou míkroskopiou bol neurotrypsín nájdený v presynaptickej membráne a presynatipckej aktívnej zóne oboch asymetrických (excitačných)0005 Neurotrypsin hrá dôležitú úlohu pri neuropsychiatrických poruchách, ako aj priporuchách mimo nervový systém.0006 Nedávno bol neurotrypsín identifikovaný ako príčina ťažkej autozomálne-recesívnej formy mentálnej retardácie (Molinari et al., 2002). Jednotlivci, ktorí trpia mentálnou retardáciou závislou od neurotrypsínu majú deléciu s veľkosťou 4 bp vsiedmom exóne neurotrypsínového génu, čo vedie ku skráteniu proteínu postrádajúceho katalytickú doménu. Patofyziologický fenotyp a vek prepuknutia ochorenia u zasialmutých jednotlivcov charakterizuje neurotrypsin ako regulátor adaptívnych synaptických funkcií, napr. preskupenie synapsie počas neskorých fáz neurovývoja a dospelá synaptická plasticita. Po normálnom psychomotorickom vývoji počas prvých 18 mesiacov sa u chorých jedincov vo veku okolo 2 rokov ukazujú prvé priznaky mentálnej retardácie, čo ukazuje, že funkcia neurotrypsínu je rozhodujúca v neskorých štádiách vývoja mozgu, ako sú napr. adaptívne synaptické funkcie potrebné na vývoj a/alebo zachovanie vyšších kognitívnych funkcií.0007 Prihláška vynálezu W 0 2006/103261 ukázala, že nadmerná expresia neurotrypsínu v motoneurónoch transgćnnych myší vedie k degenerácii neuromuskulárnych spojení, čo spôsobuje smrť denervovaných svalových vláken. Strata svalových vláken je charakteristická pre typ svalovej atroñe u starších jedincov, označovaná za sarkopéniu. Teda bolo postulované,že ínhibícia neurotrypsínu by mohla mať prospešný účinok na denerváciu svalových vlákensúvisiacich s vekom, stratu svalových vláken a atrofiu kostrových svalov.0008 Ďalšie zistenia (Aimes et al., 2005) predpokladajú potenciálnu úlohu serínových proteáz, ako neurotrypsínu pri vaskulárnej funkcii a abiogenéze.0009 Z pohľadu ústrednej úlohy neurotrypsínu v metabolizme je žiaduce stanoviť a sledovaťporuchy súvisiace s neurotrypsínom u pacientov alebo stanoviť účinok liečivých prípravkov nastav neurotrypsínu in vivo.0010 Vynálezcovia zistili, že zámer predloženého vynálezu môže byť realizovaný spôsobom podľa nároku 1, v ktorom 22 kDa fragment agrínu je zmeraný v krvi alebo moči na stanovenie in vivo aktivity neurotrypsínu a použitie takéhoto spôsobu podľa nároku 3 na diagnózu a sledovanie neurotrypsínu súvisiaceho sporuchami. Vynález ďalej zahŕňa použitie 22 kDafragmentu agrínu ako špeciálneho biomarkera podľa nároku 8.0011 Ďalší nezávislý nárok sa týka použitia 22-kDa-fragmentu agrínu ako biomarkera pri klinických alebo preklinických štúdiách na stanovenie účinkov látok na aktivitu neurotrypsínu.0012 Výhodné uskutočnenia vynálezu sú uvedené v závislých nárokoch.Obrázok l ukazuje proteinovú sekvenciu ľudského agrínu (SEQ ID NO l). Celá dĺžka nespracovaného prekurzora činí 2045 aminokyselín. V časti sekvencie je označená poloha a- a B-štepiacich miest. Ďalej sú označené niektoré podsekvencie, na ktoré je odkazovanéV príkladoch. Sekvencia 22-kDa fragmentu agrínu je uvedená veľkými písmenami.Obrázok 2 A je schematické znázomenie organizácie domény agrínu a lokalizácie jeho štíepiacich miest závislých od neurotrypsínu. Agrín má hmotnosť proteinového jadra približne 220 kDa. Jeho viacdoménový proteín je zložený z 9 FS domén (podobných folistatínu), 2 LE domén (podobných laminín-EGF), jednej domény SEA (spennová proteín enterokináza a agrín), 4 EG domén (podobných epidermálnemu rastovému faktoru) a 3 LG domén (laminín globuláme). Na oboch stranách SEA domény bola nájdené S/T oblasť (bohatá na serín/treonín).0014 Agrín existuje vniekoľkých izoformách, napr. sekretovaná izofonna sN-koncovou agrínovou doménou (NtA) a transmembránová izofonna 2.typu s N-koncovým transmembránovým segmentom (TM) zakotveným v plazmatickej membráne. Varianty zostrihu C-koncovej časti inzert dlhý 4 aminokyseliny v mieste A/y a tri rôzne inzerty vmieste B/z zložené z 8, 11 alebo 19 (81 l) aminokyselín. Neurotrypsín štiepi agrín V dvoch miestach. Jedno miesto (označované ako a miesto) je lokalizované medzi arginínom 1102 (Rll 02) a alanínom 1103 (Al 103). Druhé miesto (označované ako B miesto) je lokalizované medzi lyzínom 1859 (Kl 859) a serínom 1860 (S 1860). Čísla aminokyselín odkazujú na sekretovaný agrín (varianta zostríhu AOBO) ľudského homológu (UniProtKB/Swiss-Prot 000468). Štiepenie agrínu neurotrypsínom vytvára N-koncový fragment v rozmedzí 110-400 kDa (vďaka rôznym hladinám karbohydrátu), stredný íragment približne 90 kDa a C-koncový fragment 22 kDa.Obrázok 2 B ukazuje, ako neurotrypsin štiepi agrín in vitro. Analýza Western blot HeLa buniek kotransfektovaných s kombináciami agrínu viazaného na membránu (), normálneho neurotrypsínu (wt), neaktívneho neurotrypsínu (S/A) a prázdneho pcDNA 3.1 (-). Supernatanty(S) a bunečné lyzáty (CL) bolí analyzované anti-agrínovými protilátkami smerovanými proti Ckoncu agrínu. Homý panel Transfekcia samotného agrínu viedla k signálu nad 250 kDa vbunečnom lyzáte. Po kotransfekcii so štandardným neurotrypsínom, bol štiepený agrín s plnoudĺžkou, čo viedlo k fragmentom bežiacim v supematante pri 22, 90 a 110 kDa. Po kotransfekcií s neaktívnym neurotrypsínom nebolo nájdené štiepenie. Dolný panel Kontrola expresieObrázok 3 ukazuje štruktúru domény transmembránového agrínu. Sú označené sekvencíe oz- a B-štíepiacich miest a C-koncových fragmentov, ktoré sú výsledkom štiepenia neurotrypsínu. TM, transmembránový segment FS, časť podobná folistatínu bohatá na cysteín LE,larninínová doména podobná EGF S/T, oblasť bohatá na serín/treonín SEA, spermový proteín(sperm protein), enterokináza, a agrínová doména EG, doména podobná epídermálnemu rastovému faktom (EGF) LG, laminínová globuláma doména jednoduché kruhy, miesta N viazanej glykozylácie mnohonásobne kruhy, miesta pripojenia glykánu.Obrázok 4 ukazuje, že neurotrypsín štiepi agrín in vivo. Analýza tkaniva technikou Westem blotting u normálnych (wt) a neurotrypsín-deñcienmých (K 0) myší. Produkt štiepenia agrínu s hmotnosťou 90-kDa bol detegovaný vmozgu, obličkách a pľúcach normálnych myší, ale chýbal u neurotrypsín-deñcientných myší. Podobné výsledky okrem pľúc boli dosiałmuté pre 22-kDa agrinový fragment. ako zavádzacia kontrola bol používaný B-Aktín.Obrázok SA, B ukazuje, že chemická stimulácia dlhodobej potenciácie vyvoláva prírastok proteolytickej aktivity neurotrypsínu.Obrázok SA je Western blotting pre agrín (horný panel) a B-aktín (dolný panel) v rezoch hipokampu bez stimulácie (bez stim) a stimulovaný kombináciou pikrotoxínu, forskolínu a rolipramu (PFR). Intenzita signálu 90-kDa fragmentu agrínu štiepeného neurotrypsínom vhipokarnpe stimulovanom PFR je viac intenzívnejší než u nestimulovanej kontroly.Obrázok SB ukazuje pomer intenzity signálu 90-kDa fragmentu agrínu normalizovaného intenzitou signálu B-aktínu. Priemer intenzít signálu vnestimulovaných kontrolách bol nastavený na 1. Tri nezávislé experimenty ukázali signíñkantný 30 prírastok ñagmentu agrínu po stimulácii PFR vporovnaní snestimulovanými kontrolami (p 9,05 podľaObrázok 6 ukazuje, ako chemická stimulácia dlhodobej potenciácie zvyšuje počet ñlopódiíspôsobom závíslým od neurotrypsínu.0015 Hístogram ukazuje počet ñlopódií (Fil) na l m sekundámeho apikálneho dendritu(Dend) hípokampálnych CAl pyramidálnych neurónov za štyroch rôznych podmienok. Unormálnych myší (wt) vyvolala stímulácía kombináciou pikrotoxínu, forskolínu a rolipramu

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/37

Značky: spôsobu, sledování, biomarkera, 22-kda, diagnóze, poruch, detekcie, tohto, neurotrypsínu, neurotrypsínom, c-koncového, súvisiacich, spôsob, fragmentu, agrínu, použitie, aktivity

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/50-e8178-sposob-detekcie-in-vivo-aktivity-neurotrypsinu-pouzitie-tohto-sposobu-a-c-koncoveho-22-kda-fragmentu-agrinu-ako-biomarkera-pri-diagnoze-a-sledovani-poruch-suvisiacich-s-neurotrypsi.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob detekcie in vivo aktivity neurotrypsínu, použitie tohto spôsobu a C-koncového 22-kDa fragmentu agrínu ako biomarkera pri diagnóze a sledovaní porúch súvisiacich s neurotrypsínom</a>

Podobne patenty