Miestne špecifické inkorporovanie keto aminokyselín do proteínov

Číslo patentu: E 5743

Dátum: 15.10.2003

Autori: Schultz Peter, Wang Lei

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Vynález je v oblasti translačnej biochémie. vynález sa týka spôsobov prípravy a zmesí ortogonálnych tRNA, ortogonálnych aminoacyl-tRNA syntetáz a ich párov, ktoré inkorporujú keto aminokyseliny do proteínov. vynález sa týka aj spôsobov produkcie proteínov v bunkách s použitím takýchto dvojíc a príbuzných zmesí.0002 Genetické kódy všetkých známych organizmov kódujú tých istých dvadsat aminokyselín ako stavebných kameňov pre biosyntézu proteínov. Bočné reťazce týchto aminokyselín obsahujú prekvapujúco obmedzený počet funkčných skupín - duslkové bázy, karboxylové kyseliny a amídy, alkoholy a jednu tiolovú skupinu (a vo vzácnych prípadoch selenocysteín (pozri napríklad Bock, A., a spol., (1991) Mol. Microbiol. 52515-520) alebo pyrolyzín (pozri napríklad Srinivasan, G., a spol., (2002) Science 296214594462 Hao, B., a spol., (2002) Science 29621462-1 466), pričom zostávajúce sú jednoduché alkány alebo hydrofóbne skupiny. Schopnosť posilniť geneticky kódované aminokyseliny onové aminokyseliny, napríklad oaminokyseliny sbočnými reťazcami chelatujúcimi kovy, sfluorescenčnými, redox aktívnymi, fotoaktlvnymi alebo spinovo označenými retazcami by významne zvýšili schopnost manipulovať so štruktúrami afunkciamí proteínov a možno aj so samotnýmí živými organizmami. Nedávno bolo publikované, že pridaním nových komponentov do translačného mechanizmu baktérií Escherichia coli bolo možné in vivo cielene a s vysokou presnosťou včlenit do proteínov veľký počet neprírodzených aminokyselín. Pozri napríklad Wang, L., a spol., (2001) Science 2922498-500 Wang, L., aspol., (2002) J. Am. Chem. Soc. 1241836-1837 a Zhang, Z., a spol.,(2002) Angew. Chem. lnt. Ed. Engl. 412840-2842.0003 Publikácia Chin a spol. (PNAS, 99(17)11020-11024, 2002 sa týka dvojice ortogonálnej aminoacyltRNA syntetázy l tRNA na inkorporovanie p-benzoyl-L-fenylalanínu do proteínov E. coli.0004 Liu a Schultz (PNAS USA, 9624780-4785, 1999) opisuje supresorovú tRNA odvodenú zkvasiniek a kvasínkovú glutaminyI-tRNA syntetázu, ktorá tvorí v E. coli dvojice ortogonálnej tRNA / syntetázy.0005 Mendel aspol., (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 242435462, 1995) opisujú spôsoby, ktoré používajú supresorovú tRNA amber, ktorá bola chemicky aminoacylovaná s požadovanou aminokyselinou na cielene inkorporovanie aminokyseliny do proteínu ako odpoved na kodón amber.0006 Keto skupina je v organickej chémíi všeobecne rozšírená a zúčastňuje sa na veľkom počte reakcii od adičných a dekarboxylačných reakcií až po aldolové kondenzácie. Navyše, jedinečná reaktlvnosť karbonylovej skupiny umožňuje jej selektlvne moditíkovanie derivátmi hydrazidu a hydroxylamínu vpritomnosti ostatných vedľajších reťazcov aminokyselín. Pozri napríklad Cornish, V. W., a spol., (1996) J. Am. Chem. Soc. 11881508151 Geoghegan, K. F. a Stroh, J. G. (1992) Bioconjug. Chem. 3138-146 a Mahal, L. K., aspol., (1997) Science 27621125-1128. Hoci je prítomná v kofaktoroch (pozri napríklad Begley, T. P., a spol., (1997) in Top. Curr. Chem., zostavovatelia Leeper, F. J. a Vederas, J. C. (Springer-Verlag, New York), ročník 195, strany 93142), metabolitoch (pozri napríklad Diaz, E., aspol., (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 652523-569), aako posttranslačná modifikácia proteínov (pozri napríklad Okeley, N. M. a van der Donk, W. A. (2000) Chem. Biol. 7, R 159-R 171), táto dôležitá funkčná skupina chýba vbočných reťazcoch bežných aminokyselín. Pridanie karbonylového bočného reťazca do aminokyseliny by umožnilo proteinom obsahujúcím túto aminokyselinu zúčastňovať sa vo veľkom počte reakcií od adičných a dekarboxylačných reakcií až po aldolové kondenzácie,napriklad by mohli byt selektívne modifikované derivátmí hydrazidu a hydroxylamínu.0007 Keto skupina poskytuje jedinečnú chemickú reaktívnosť, ktorá nie je prítomná v bežných dvadsiatich aminokyselinách vdôsledku svojej schopnosti zúčastňovať sa na adičných reakciách zahŕňajúcích buď karbonylovú skupinu alebo kyslú pozíciu Ca. Táto skupina poskytuje aj altemativu k prírodnej aminokyseline cysteínu na selektívnu modifikáciu proteínov s veľkým počtom rôznych chemických reagencii. Reaktívna tiol skupina cysteínu bola extenzivne používaná na pripojenie rôznych biofyzikálnych sond kproteínom. Pozri napr/klad Creighton, T. E. (1986) Methods Enzymol. 131283-106 Altenbach, C., a spol., (1990) Science 24821088-92 Brinkley, M. (1992) Bioconjug. Chem. 32-13 Giuliano, K.A., a spol., (1995) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 z 405-34 Mannuzzu, L. M., a spol., (1996) Science 2712213-6 Griffin, B. a spol., (1998) Science 2812269-272 Llopis, J., a spol., (2000) Methods Enzymol. 327546-64 a Gaietta, G., a spol., (2002) Science 296503-7. Nanešťastie značenie jednotlivých cysteínových zvyškov sa často komplikuje prítomnosťou viac ako jedného prístupného cysteínového zvyšku vproteíne, ako aj výmennými reakciami výsledného disultidu v prítomnosti voľného tiolu. Preto dostupnosť neproteinogénnej aminokyseliny sortogonálnou reaktívnosťou umožňuje selektívnu modíñkáciu proteínu vprípadoch, kedy nie je možné selektívne označiť jediný cysteín, ak sú potrebné dve rôzne značenia, alebo ak disulñdová väzba by nebola dostatočne stabilná. Karbonylová skupina ochotne reaguje shydrazidmi, hydroxylamínmi a semikarbazidmi v miernych podmienkach vo vodnom roztoku a vytvára hydrazónové, oxímové a semikarbazónové väzby, ktoré sú vo fyziologických podmienkach stabilné. Pozri napríklad Jencks, W. P. (1959) J. Am. Chem. Soc. 81, 475481 Shao, J. a Tam, J. P. (1995) J. Am. Chem. Soc. 11723893-3899.0008 Bolo vyvinutých niekoľko spôsobov na selektívne inkorporovanie karbonylovej skupiny do peptidov a proteínov. Na začiatku sa zaviedol aldehyd na N-terminálnych koncoch peptidov oxidáciou N-termínálneho serínu alebo treoninu s jodistanom, po ktorej nasledovalo spojenie s biotinom afluorescenčnými reportermí cez hydrazónovú väzbu. Pozri napríklad Geoghegan, K. F. a Stroh, J. G. (1992) Bioconjug. Chem. 32138-146.Tento spôsob sa však obmedzuje na N-terminálnu modiñkáciu proteínov. Syntéza peptidov vtuhej fáze sa neskôr použila na prípravu peptidových segmentov obsahujúcich bud hydrazid alebo hydroxylamin, ktoré následne reagujú s rozvetvenou aldehydovou jadrovou matricou, čím vzniknú peptidové dendrimery (pozri napríklad Shao, J. a Tam, J. P. (1995) J. Am. Chem. Soc. 11753893-3899 Rose, K. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116230-33), alebo s peptidovým segmentom obsahujúcim keto skupinu, čím sa získajú syntetické proteíny(pozri napríklad Canne, L. E., a spol., (1995) J. Am. Chem. Soc. 11722998-3007). Tento prístup je všeobecne použiteľný na peptidy alebo na malé proteíny obsahujúce menej ako 100 zvyškov, je však Iimitovaný ťažkosťami spojenými so syntézou veľkých peptidov alebo proteínov.0009 Na inkorporovaníe keto skupiny do proteínov sa použil aj in vitro biosyntetický spôsob. Pozri napriklad vyššie Cornish, V. W., a spol., (1996). V tomto spôsobe sa neprirodzená aminokyselina obsahujúca keto skupinu chemicky acyluje na supresorovú tRNA amber. Ak sa acylovaná tRNA a mutantný gén zlúčia v in vitro extrakte schopnom podporiť biosyntézu proteínov, neprirodzená aminokyselina sa selektívne inkorporuje ako odpoved na UAG kodón. Tento spôsob vyžaduje, aby supresorová tRNA bola chemicky aminoacylovaná s neprirodzenou aminokyselinou in vitro, a acylovaná tRNA sa spotrebuje ako stechiometrická reagencia počas translácie a nemožno ju regenerovať, čo vedie k nízkej výtažnosti proteínov.0010 Na ďalšie rozšírenie genetického kódu a zvýšenie diverzity neprirodzených amínokyselinových štruktúr napríklad keto aminokyselinou, ktorá sa môže inkorporovať do proteínov v bunke, je potrebné vyvinút lepšie a/alebo ďalšie komponenty biosyntetického mechanizmu, napríklad ortogonálne tRNA, ortogonálne aminoacyl-tRNA syntetázy a/alebo jedinečné kodóny, ktoré používajú keto aminokyselinu a ktoré je možne regenerovať. Tento vynález splňa túto a ine potreby ako sa ukáže po prehľade nasledujúceho opisu.0011 vynález poskytuje zmesi a spôsoby prípravy ortogonálnych komponentov na inkorporovaníe p-acetylL-fenylalanlnu do narastajúceho polypeptidového reťazca ako odpoveď na selektorový kodón, napríklad stop kodón, nonsens kodón, štvor- alebo viacbázový kodón, atd., napríklad in vivo. Napríklad vynález poskytuje ortogonálne tRNA (O-tRNA), ortogonálne aminoacyl-tRNA syntetázy (O-RS) a ich dvojice, ktoré možno použiť na inkorporovaníe keto aminokyselín do narastajúcích polypeptidových reťazcov, ako je uvedené v nárokoch. 0012 V typickom prípade ortogonálna aminoacyl-tRNA syntetáza (O-RS) podľa vynálezu výhodne aminoacyluje O-tRNA s účinnosťou, ktorá je aspoň okolo napríklad 50, 60, 75, 80 alebo 90, alebo vyššia,účinnosti polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo SEQ lD NO. 18 až 20 s p-acetyIL-fenyl-alanínom. V určitých uskutočneniach O-RS obsahuje aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu ktorúkoľvek zo SEQ ID N 0. 18-20, alebo jej konzervatívny variant.0013 Zmes, ktorá obsahuje O-RS, môže dalej voliteľne obsahovať ortogonálnu tRNA (O-tRNA), kde OtRNA rozpoznáva selektorový kodón. V určitých uskutočneniach O-tRNA obsahuje alebo je kódovaná polynukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO.21. Zmes, ktorá obsahuje O-RS, môže voliteľne obsahovaťť bunku(napriklad neeukaryotickú bunku, ako je napríklad bunka E. coli a podobne, alebo eukaryotickú bunku) a/alebo translačný systém.0014 vynález poskytuje aj bunku (napríklad neeukaryotickú bunku, alebo eukaryotickú bunku) obsahujúcu translačný systém, kde translačný systém obsahuje orlogonálnu tRNA (O-tRNA) ortogonálnu aminoacyl-tRNA syntetázu (O-RS) a p-acetyl-L-fenylalanín. Typicky O-RS výhodne aminoacyluje O-tRNA s účinnosťou, ktorá je aspoň okolo 50, 60, 75., 80 alebo 90, alebo vyššia, účinnosti polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú z SEQ ID NO. 18 až 20 s p-acetyI-L-fenylalaninom. O-tRNA rozpoznáva prvý selektorový kodón a O-RS výhodne aminoacyluje O-tRNA s p-acetyI-L-fenylalaninom. V určitých uskutočneniach O-tRNA obsahuje alebo je kódovaná polynukleotidovou sekvenciou ako je uvedené v SEQ ID NO. 21, alebo jej komplementárnou polynukleotidovou sekvenciou. V určitých uskutočneniach O-RS obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ako je uvedené v ktorejkoľvek SEQ ID NO. 18-20, alebo jej konzervatívny variant. voliteľne bunka podľa vynálezu obsahuje nukleovú kyselinu, ktorá obsahuje polynukleotíd, ktorý kóduje daný polypeptid, kde polynukleotíd obsahuje selektorový kodón, ktorý O-tRNA rozpoznáva.0015 Bunka podľa vynálezu voliteľne obsahuje bunku E. coii, ktorá obsahuje ortogonálnu tRNA (O-tRNA),ortogonálnu aminoacyl-tRNA syntetázu (O-RS), keto aminokyselinu, a nukleovú kyselinu, ktorá obsahuje polynukleotíd, ktorý kóduje daný polypeptid, kde polynukleotíd obsahuje selektorový kodón, ktorý O-tRNA rozpoznáva. Typicky O-RS výhodne aminoacyluje O-tRNA s účinnosťou, ktorá je aspoň okolo 50, 60, 75,80 alebo 90, alebo vyššia, účinnosti polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú z SEQ ID NO. 18 s p-acetyI-L-fenylalaninom.0016 V určitých uskutočneniach vynálezu O-tRNA podľa vynálezu obsahuje alebo je kódovaná poly~ nukleotidovou sekvenciou ako je uvedené v SEQ ID N 0. 21, alebo jej komplementárnou polynukleotidovou sekvenciou. V určitých uskutočneniach vynálezu O-RS obsahuje aminokyselínovú sekvenciu ako je uvedené v SEQ lD N 0. 18-20, alebo jej konzervatívny variant.0017 O-tRNA a/alebo O-RS podľa vynálezu môže byt odvodené zakéhokoľvek organizmu (napríklad z eukaryotických a/alebo z neeukaryotických organizmov). V určitých uskutočneniach O-RS a O-tRNA sú odvodené z Mefhanococcus jannaschíi.0018 Polypeptidy a polynukleotídy sú tiež v rozsahu vynálezu. Polypeptid podľa vynálezu obsahuje umelý(napríklad umelo pripravený anie prirodzene sa vyskytujúci) polypeptíd obsahujúci aminokyselinu ako je uvedené v SEQ ID NO. 18-20, a/alebo konzervatívne varianty. Polynukleotid podľa vynálezu obsahuje umelý polynukleotíd, ktorý kóduje polypeptid obsahujúci aminokyselinu ako je uvedené v SEQ ID NO. 18-20.-3 0019 Vektory obsahujúce polynukleotid podľa vynálezu sú tiež v rozsahu vynálezu. Napriklad vektor podľa vynálezu môže zahŕňať plazmíd, kozmid, fág, vírus, expresný vektor, alalebo podobne. Bunka obsahujúca vektor podľa vynálezu je tiež v rozsahu vynálezu.0020 Spôsoby prípravy proteínu v bunke (napríklad v neeukaryotickej bunke, ako je napríklad bunka E. coli alebo podobne, alebo eukaryotická bunka) s p-acetyl-L-fenylalanlnom v špeciñkovanej pozícií sú tiež v rozsahu vynálezu. Napriklad spôsob zahŕňa kultivovanie, vo vhodnom médiu, bunky, kde bunka obsahuje nukleovú kyselinu, ktorá obsahuje aspoň jeden selektorový kodón a kóduje protein, pričom poskytuje p-acetyl-L-fenylalanin, ainkorporuje keto aminokyselinu do špecitikovanej pozície vproteine počas translácie nukleovej kyseliny aspoň s jedným selektorovým kodónom, čim sa produkuje proteín. Bunka dalej obsahuje ortogonálnu tRNA (O-tRNA), ktorá funguje v bunke a rozpoznáva selektorový kodón a ortogonálnu aminoacyl-tRNA syntetázu (O-RS), ktora výhodne aminoacyluje O-tRNA s účinnosťou, ktorá je aspoň okolo 50. 60, 75,80 alebo 90, alebo vyššia, účinnosti polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu z SEQ ID NO. 18 s p-acetyI-L-fenylalaninom. Vurčitých uskutočneniach O-RS obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá obsahuje ktorúkoľvek z SEQ ID N 0. 18-20. V určitých uskutočneniach O-tRNA obsahuje alebo je kódovaná poly-nukleotidovou sekvenciou ako je uvedene v SEQ ID NO. 21, alebo jej komplementárnou polynukleotidovou sekvenciou.0021 Pred podrobným opisom vynálezu je potrebné si uvedomiť, že tento vynález sa neobmedzuje na určité biologické systémy, ktoré, prirodzene, môžu byť variabilné. Tiež je potrebne si uvedomiť, že tenninológia použitá v tejto prihláške je len s cieľom opísať osobitné uskutočnenia, a nie je myslená ako limitujúca. Podľa použitia vtejlo špecitikácii avpriložených nárokoch, formy jednotného čísla zahŕňajú aj plurálové odkazy pokiaľ obsah jasne nediktuje inak. Tak napriklad odkaz na bunku zahŕňa kombináciu dvoch alebo viacerých buniek odkaz na baktérie zahŕňa zmesi baktérií, a podobne.0022 Pokiaľ nie je detinované tu a nižšie vo zvyšku tohto opisu, všetky použité technické a vedecké výrazy majú rovnaký význam ako ich bežne chápe odbomik v danej oblasti techniky, ktorej sa vynález týka.0023 Ortogonálny Podľa použitia vprihláške výraz ortogonàlny sa vzťahuje na molekulu (napríklad na ortogonálnu tRNA (O~tRNA) alalebo na ortogonálnu aminoacyl-tRNA syntetázu (O-RS. ktorá funguje s endogénnymi komponentmi bunky so zníženou účinnosťou v porovnaní so zodpovedajúcou molekulou, ktorá je pre bunku alebo iný translačný systém endogénna, alebo ktorá nedokáže fungovať sendogénnymi komponentmi bunky. Vkontexte s tRNA a s aminoacyI-tRNA syntetázami ortogonálny sa vzťahuje na neschopnosť alebo na zníženú účinnosť, napríklad menej ako 20-nú účinnosť, menej ako 10-nú účinnosť,menej ako 5-nú účinnosť, alebo menej ako 1-nú účinnosť onogonálnej tRNA fungovať s endogénnou tRNA syntetázou vporovnaní s endogénnou tRNA. Ortogonálnej molekule chýba funkčná endogénna komplementárna molekula v bunke. Napriklad ortogonálna tRNA vdanom translačnom systéme je aminoacylovaná akoukoľvek endogénnou RS daného translačného systému so zníženou alebo dokonca nulovou účinnosťou, vporovnaní saminoacyláciou endogénnej tRNA endogénnou RS. Vinom príklade ortogonálna RS aminoacyluje akúkoľvek endogénnu tRNA v danom translačnom systéme so zníženou alebo dokonca nulovou účinnosťou v porovnaní s aminoacyláciou endogénnej tRNA endogénnou RS.0024 Pribuzný Výraz pribuzný sa vzťahuje na komponenty, ktoré fungujú spolu, napriklad ortogonálna tRNA a ortogonálna aminoacyI-tRNA syntetáza. O komponentoch možno tiež hovoriť, že sú komplementárne. 0025 Výhodne aminoacylue Výraz výhodne aminoacyluje sa vzťahuje na účinnosť, napriklad 70-nú účinnosť, 75-nú účinnosť, 85-nú účinnosť, 90-nú účinnosť, 95-nú účinnosť, alebo 99-nú alebo vyššiu účinnosť, s ktorou O-RS aminoacyluje O-tRNA s keto aminokyselinou v porovnani s O-RS aminoacylujúcou prirodzene sa vyskytujúcu tRNA alebo počiatočný materiál používaný na vygenerovanie O-tRNA.0026 Selektorou kodón Výraz selektorový kodón sa vzťahuje na kodóny, ktoré O-tRNA rozpoznáva v procese translácie a ktoré typicky nerozpoznáva endogénna tRNA. Antikodónová slučka O-tRNA rozpoznáva selektorový kodón na mRNA a inkorporuje svoju aminokyselinu, napríklad neprirodzenú aminokyselinu, ako je napriklad keto aminokyselína, na toto miesto vpolypeptide. Selektorové kodóny môžu zahŕňať napriklad nonsens kodóny, ako je napríklad stop kodón, napríklad kodóny amber, ochre a opal štvor- alebo viacbázové kodóny vzácne kodóny, kodóny odvodené z prirodzených alebo neprírodzených bázových párov alalebo podobne.0027 Supresorová tRNA Supresorová tRNA je tRNA, ktorá mení čítanie mediátorovej RNA (mRNA) vdanom translačnom systéme, napriklad poskytnutím mechanizmu na inkorporovanie aminokyseliny do polypeptidového reťazca ako odpoveď na selektorový kodón. Napriklad supresorovà tRNA môže čítať napriklad cez stop kodón, štvorbàzový kodón, vzácny kodón alalebo podobne.0028 Supresná aktivita Výraz supresná aktivita sa vzťahuje na schopnosť tRNA, napriklad supresorovej tRNA čítať cez selektorový kodón.0029 Translačny systém Výraz translačný systém sa vzťahuje na komponenty potrebné na inkorporovanie prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny do narastajúceho polypeptidového reťazca(proteínu). Komponenty translačného systému môžu zahŕňať napriklad ribozómy, tRNA, syntetázy, mRNA a podobne. Komponenty podľa vynálezu možno pridať do in vitro alebo do in vivo translačného systému,napríklad do neeukaryotickej bunky, napriklad do baktérie (ako je napríklad E. co/I), Archaelu, alebo do eukaryotickej bunky, napriklad do bunky kvasinky, cicavca, rastliny, riasy, huby, hmyzu, alalebo podobne.0030 Negrirodzená amínokyselíga Podľa použitia v tejto prihláška výraz neprírodzená aminokyselína sa vzťahuje na akúkoľvek aminokyselinu, modítikovanú aminokyselinu a/alebo amínokyselinový analóg, ako je napríklad keto amínokyselína, ktorá nie je jednou z dvadsiatich bežne sa vyskytujúcich aminokyselín alebo selenocysteín alebo pyrolyzín.0031 odvodený z Podľa použitia v tejto prihláške výraz odvodený z sa vzťahuje na komponent, ktorý je izolovaný alebo pripravený s použítím informácie zo špecitikovanej molekuly alebo organizmu.0032 Pozitlvna selekcia alebo skriningoyý marker Podľa použitia v tejto prihláške výraz pozitívny selekčný alebo skriningový marker sa vztahuje na marker, ktorý ak je prítomný, napríklad exprimovaný, aktivovaný alebo podobne, vedie k identitikácii bunky, ktorá obsahuje znak, napríklad bunky s pozitívnym selekčným markerom na rozdiel od buniek bez tohto znaku.0033 Negatlvną selekcia alebo skriningog marker Podľa použitia vtejto prihláške výraz negatívna selekcia alebo skriningový marker sa vzťahuje na marker, ktorý ak je prítomný, napríklad exprimovaný,aktivovaný, alebo podobne, umožňuje identifikáciu bunky, ktorá neobsahuje danú vlastnosť alebo znak(napríklad v porovnani s bunkou, ktorá túto vlastnosť alebo znak nesie).0034 Repoiter Podľa použitia vtejto prihláške výraz reporter sa vzťahuje na komponent, ktorý možno použít na selekcíu cieľových komponentov daného systému. Napríklad reporter môže zahŕňať proteín,napríklad enzým. ktorý nesie rezistenciu alebo senzítivitu voči antibiotikám (napriklad voči B-Iaktamáze. chloramfenikol acetyltransferáze (CAT) apodobne), fluorescenčný skriningový marker (napríklad zelený fluorescenčný proteín (napríklad (GFP), YFP, EGFP, RFP, atd.), luminiscenčný marker (napríklad proteín luciferázy zo svätojánskej mušky), atinitne založený skriningový marker, alebo pozitívne alebo negatívne voliteľné markerové gény ako je napríklad lacZ, B-gal l lacZ (B-galaktozídáza), Adh (alkoholdehydrogenáza),his 3, ura 3, leu 2, lys 2, alebo podobne.0035 Eukaryot Podľa použitia vtejto príhláške výraz eukaryoť sa vzťahuje na organizmy patriace do fylogenetíckej domény Eucarya ako sú napríklad živočíchy (napríklad cicavce, hmyz, plazy, vtáky, atď.), ciliaty,rastliny (napríklad jednoklíćnolisté, dvojklíčnolísté, riasy, atd.), huby, kvasinky. bíčikovce, míkrosporídíe,prvoky. atď.0036 Neeukaryot Podľa použitia vtejto prihláška výraz neeukaryot sa vzťahuje na neeukaryotické organizmy. Napriklad neeukaryotický organizmus môže patriť do fylogenetickej domény Eubacteria (napríklad Escheríchia coli, Thermus thennophílus, Bacillus stearothermophilus, atd.) alebo do fylogenetíckej domény Archaea (napríklad Methanococcus jannaschíi (Il/ľj), Methanosarcina mazei (Mm), Methanobacteríum thennoautotrophicum (Mt), Methanococcus marípaludís, Methanopyrus kandlen) HaIobacte/íum ako napríklad Haloferax volcanií a Halobacteríum dmhy NRC-1, Archaeoglobus fulgidus (At), Pyrococcusfuriosus (PD,Pyrococcus horíkoshií (Ph), Pyrobaculum aemphílum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfatarícus (Ss),Su/folobus tokodaií, Aeuropymm pemíx (Ap). Thermoplasma acidophilum, Thennoplasma volcanium, atď.). 0037 Konzervatívny variant Výraz konzervatívny variant sa vzťahuje na translačný komponent, napríklad konzervatívny variant O-tRNA alebo konzervatívny variant O-RS, ktorý funkčne pôsobí ako komponent,zktorého konzervatívny variant vychádza, napríklad O-tRNA alebo O-RS, avšak svariácíamí vsekvencíi. Napríklad O-RS bude aminoacylovať komplementárnu O-tRNA alebo konzervatívny variant O-tRNA sneprirodzenou amínokyselinou, napriklad sketo aminokyselinou, hoci O-tRNA akonzervatívny variant O-tRNA nemajú rovnakú sekvenciu. Konzervatívny variant môže mať napríklad jednu variáciu, dve variácie, tri variácie, štyri variácie alebo päť alebo viac variácii v sekvencii, pokiaľ konzervatívny variant je komplementárny so zodpovedajúcou O-tRNA alebo O-RS.0038 Selekčny alebo skríningog agens Podľa použitia vtejto prihláške výraz seIekčný alebo skriningový agens sa vzťahuje na agens, ktorý ak je prítomný, umožňuje selekcíu/skríníng určitých komponentov z populácie. Napríklad selekčný alebo skriningový agens zahŕňa, avšak sa neobmedzuje napríklad na nutríčnú látku, antibiotikum, vlnovú dlžku svetla, protilátku, exprímovaný polynukleotid, alebo podobne. Selekčný agens sa môže líšiť napríklad koncentráciou, intenzitou, atď.0039 Ako odpoveď na Podľa použitia vtejto prihláška v kontexte translácíe s komponentmi O-tRNA a O«RS sa výraz ako odpoveď na vzťahuje na spôsob, v ktorom tRNA podľa vynálezu rozpoznáva selektorový kodón a sprostredkuje ínkorporovanie keto aminokyseliny, ktorá je naviazaná na tRNA, do narastajúceho polypeptidového reťazca.0040 Obrázok 1 ilustruje SDS-PAGE analýzu domény Z akumulovanej v rôznych podmienkach expresíe. Ľavý prúžok je marker molekulovej hmotnosti.0041 Obrázok 2 Panely (A) a (B) ilustrujú (A) FT~|CR hmotnostné spektrum s vysokým rozlišením Zdomény intaktného mutantného proteínu obsahujúceho p-acetyl-L-fenylalanín. Je možné pozorovať sériu vrcholov zodpovedajúcich rôznym stavom nabitia proteínu. V každej sérií sú trí vrcholy zodpovedajúce proteínu bez prvého metíonínu, jeho acetylovanej forme a intaktnému proteínu značenemu pre stav nabitia 8. Vsuvka znamená expanziu molekulového vrcholu proteínu s doménou Z z izotopického klastra 7. (B) ilustruje tandemové hmotnostné spektrum NHz-terminálneho peptidu MTSVDNYHNK. Parciálnu sekvenciu TSVDNYIN peptidu obsahujúcu p-acetyI-L-fenylalanín (Y) možno priradiť z iónovej série označenej b a y.0042 Obrázok 3, Panely (A), (B) a (C) ilustrujú in vitro značenie mutantnej domeny Z obsahujúcej p-acetylL-fenylalanín s fluoresceín hydrazidom 1. (A) ilustruje reakciu značenia p-acetyl-L-fenylalanínu s fluoresceín hydrazidom 1. (B) ilustruje stríebrom zafarbenú SDS-PAGE (hore) analýzu a fluorescenčné zobrazenie (dole)

MPK / Značky

MPK: C12N 9/00, C12P 21/02, C12P 21/00, C12N 15/67

Značky: aminokyselin, miestne, proteínov, specifické, inkorporovanie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/50-e5743-miestne-specificke-inkorporovanie-keto-aminokyselin-do-proteinov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Miestne špecifické inkorporovanie keto aminokyselín do proteínov</a>

Podobne patenty