Farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus

Číslo patentu: 282361

Dátum: 27.11.2001

Autori: Müllner Stefan, König Wolfgang, Müller Günter

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus obsahujúci účinné množstvo aspoň jedného peptidu zo skupiny zahŕňajúcej Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn a acetyl-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH v rozpustenej, amorfnej alebo kryštalickej forme. Ďalej je opísané použitie uvedených peptidov na výrobu liečiva na liečenie diabetes mellitus alebo od inzulínu nezávislej cukrovky.

Text

Pozerať všetko

Dátum podania prihlášky 18. 12. 1991Vestník ÚPV SR c. 112002Číslo prioritnej prihlášky P 40 40 574.5Dátum podania prioritnej prihlášky 19. 12. 1990Dátum zverejnenia prihlášky 15. 7. 1992 Vestník UPV SR č. 07/1992v pripade vylúčenej prihlášky 3879-91 Číslo podania medzinárodnej prihlášky podľa PCTČíslo zverejnenia medzinárodnej prihlášky podľa PCTURAD PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA SLOVENSKEJ REPUBLIKY(54) Názov Farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus(57) Anotácia Je oplsaný farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus obsahujúci účinné množstvo aspoň jedného peptidu zo skupiny zahŕňajúcej Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn a acetyl-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH v rozpustenej, amorfnej alebo kryštalickej forme. Ďalej je opísanć použitie uvedených peptidov na výrobu liečiva na liečenie diabetes mellitus alebo od inzulínu nezávislej cukrovky.Vynález sa týka nových farmaceutických prostriedkov s inzulínovým účinkom, ktoré sú vhodné na liečenie diabetes mellitus (cukrovka).Inzulíny sú tvorené dvoma polypeptidovými reťazcami,a síce reťazcom A, ktorý obsahuje 21 aminokyselinových zvyškov a reťazcom B, ktorý obsahuje 30 aminokyselinových zvyškov. Obidva tieto reťazce A a B sú vzájomne spojené dvoma dísulñdovými mostíkmi, pričom sú spojené cysteínovć zvyšky vpolohách A 7 a B 7, ako i cysteínové zvyšky v polohách A 20 a B 19. Tretí disulíidový mostík sa nachádza medzi poloharni A 6 a Al l. Zvierací a ľudský inzulín sa tvorí v slinivke brušnej vo forme preproinzulínu. Ľudský preproinzulín pozostáva napríklad zprepeptidu s 24 aminokyselinovými zvyškami, na ktoré nadväzuje proinzulín s 86 aminokyselinovými zvyškarni a uvedený preproinzulín má nasledujúcu konfiguráciu Prepeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A,pričom všeobecný substituent C znamená aminokyselinový reťazec s 31 zvyškami. V priebehu vylučovania z Langerhandsschenových ostrovov sa prepeptid odštiepi za vzniku proinzulínu. Potom sa reťazec C proteolyticky štiepi a vzniká účinný ľudský inzulín.Inzulín má v inzulínsenzitívnom tkanive široké spektrum účinkov. Najvýraznejším ztýchto účinkov je rýchle znižovanie hladiny glukózy u cicavcov v prípade aplikacie inzulínu. To je spôsobené rýchlym prevodom glukózy z krvi do svalov a tukových buniek, kde je glukóza spotrebovaná. Inzulín ďalej aktivuje glykogén-syntetázu a inhibuje lipolýzu. Inzulín tiež podporuje syntézu proteínov z aminokyselín a zosilňuje indukciu glukokinázy a fosfofruktokinázy a inhibuje tvorbu určitých enzýmov glukoneogenézy, akými sú pyruvátkarboxyláza a fruktosadifosfatáza.Diabetes ll. typu (od inzulínu nezávislý diabetes) súvisí srezistenciou proti inzulínu perifémych tkanív, akými sú svalové alebo tukové tkanivá. Zmenšená miera využitia glukózy, ku ktorej pritom dochádza, je spôsobená chýbajúcou inzulínovou stimuláciou transportu a následného metabolického spracovania glukózy. Táto násobná rezistencia je pravdepodobne spôsobená defektom vreceptorovej alebo postreceptorovej rovine, tzn. pred vznikom člena nazývaného second messenger (Garvey, Diabetes/Metabolísm Rewiews, 5/1989/727-742).Teraz bolo sprekvapením zistené, že krátke peptidy môžu mať inzulínový účinok, a že sa preto hodia na liečenie cukrovky (diabetes mellitus).Predmetom vynálezu sú farmaceutické prostriedky, na ošetrenie diabetes mellitus, ktoré obsahujú účinné množstvo aspoň jednćho peptidu vybraného zo skupiny zahmujúcej Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn a acetyl-LeuGlu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH .Predmetom vynálezu je ďalej použitie aspoň jedného peptidu na výrobu liečiv na liečenie diabetes mellitus alebo od inzulínu nezávislej cukrovky.Peptidy podľa vynálezu sa pripravujú všeobecnými metódami používanými v chémii peptidov, spočívajúcimi bud V postupnej výstavbe peptidu od C-terminálneho kon ca alebo vkopulácii vhodných segmentov (Houben-Weyl,Methoden der Organischen Chemie, zv. 15/1, 2). Kopulàcie peptidov môžu byť napríklad uskutočnené metódou zmesových anhydridov, cez aktívny ester alebo karbodiimidovou metódou a to najmä za prídavku látok urýchľujúcich reakciu a brániacich racemizácii, akými sú napríklad l-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysukcínimid, 3-hydroxy 4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazín, N-hydroxy-5-norbomen-ZJ-díkarboximid a ďalej s použitím aktívnych derivátov l-hydroxybenzotriazolu alebo anhydridov kyseliny fosforečnej, fosfónovej alebo fosñnovej, .pri teplote vrozmedzí -10 °C až teplota varu použitého rozpúšťadla,výhodne v rozmedzí -5 °C až 40 °C.Vhodnými rozpúšťadlami na takéto reakcie sú dimetylfonríamid, dimetylacetamid, N-metylpyrolídón alebo dimetylsulfoxid.Pokiaľ to rozpustnosť reakčných zložiek dovoľuje, môžu byť ako rozpúšťadlá použité metylćnchlorid, chlorofonn alebo tetrahydrofurán. Uvedené metódy prípravy peptidov sú opísanć Meinehofer-Gross, The Peptides/, Academic Press, zv. I. /1979/.V prípade, že sú funkčne skupiny v bočnom reťazci aminokyselín chránené s cieľom zabrániť vedľajším reakciám alebo s cieľom syntézy špeciálnych peptidov chránených vhodnými ochrannými skupinami /pozri napríklad T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis/,potom sa predovšetkým používajúAko ochranné skupiny amínovej skupiny sa výhodne používajú benzyloxykarbonylový zvyšok (Z-), ktorý je odštiepiteľný katalytickou hydrogenáciou, 2-(3,S-dimetylxyfenyD-propyl (2)oxykarbonylový zvyšok (Ddz-), ktorý je odštiepiteľný slabýmí kyselinamí, alebo tritylový zvyšok(Trh), ktorý je rovnako odštiepiteľný slabýmí kyselinamí, a 9-íluórenylmetylhyloxykarbonylový zvyšok (Fmoc-), ktorý len odštiepiteľný sekundámymi amínami. Skupina SH cysteínu môže byť blokovaná celým radom ochranných skupín. Výhodne sa tu používajú tritylový zvyšok (Trt-) a S-terebutylový zvyšok (StBu-).Tritylový zvyšok môže byť odštiepený bud oxidáciou jódom za vzniku cystínovýchzlúčenín alebo reduknjúcim kyslým štiepením za vzniku cysteinových zlúčenín (Liebigs Ann. Chem 1979, 227-247).Naproti tomu S-tercbutylový zvyšok bude najlepšie odštiepený redukčne pôsobením tributylfosñnu (Aust. J. Chem. 19 /1966/ 2355-2360). Skupiny OH a COOH v bočných reťazcoch sa najlepšie chránia kyslo odštiepiteľným terebutylovým zvyškom (tBu-) (pozri tiež Meíenhofer-Gross The Peptides, zv. 3).Farmaceutickou kompozíeiou je výhodne roztok alebo suspenzia na injekčné účely s hodnotou pH medzi asi 3,0 a 9,0, výhodne medzi asi 5,0 a 8,5, ktorý, prípadne ktorá obsahuje vhodnć izotonické činidlo, vhodne konzervačné činidlo a pripadne vhodný pufer, ako i pripadne depotnú účinnú zložku, všetko prirodzene v sterilnom vodnom roztoku alebo v sterilnej vodnej suspenzii. Zvyšok kompozlcie je tvorený nosíčom.Vhodnými izotonickými činidlami sú napríklad glycerín, glukóza, mannít, chlorid sodný a vápenaté alebo horečnaté zlúčeniny, ako napríklad chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý.Vhodnými konzervačnými činidlami sú napríklad fenol, m-krezol, benzylalkohol a/alebo p-hydroxy ester kyseliny benzoovej.Ako pufre môžu byť najmä na nastavenie hodnoty pH medzi 5,0 a 8,5 použité napríklad octan sodný, citran sodný a fosforečnan sodný. Inak sú na nastavenie hodnoty pH kompozície vhodné i fyziologícky neškodné zriedené kyseliny (typicky kyselina chlorovodiková), prípadne lúhyNa účely modifikácie účinkového profilu kompozicie podľa vynálezu môžu byť do kompozície primiesené i modifikované /pozri. EP-B 132 769 a EP-B 132 770/ a/alebo nemodiíikované inzulíny, výhodne hovádzí, bravčový alebo ľudský inzulín, najmä ľudský ínzulín.Farmaceutické kompozícia podľa vynálezu sa pripraví tak, že sa do vhodnej aplikačnej formy upraví zmes aspon jednej zlúčeniny všeobecného vzorca (II) a/alebo aspoň jednej z ich fyziologicky prijateľných solí a prípadne modifrkovaných a/alebo nemodifikovaných inzulínov, alebo ich derivátov s fyziologicky prijateľným nosičom a pripadne s vhodnými prísadami a pomocnými látkami.V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia,pričom tieto príklady majú iba ilustratívny charakter a vlastný rozsah vynálezu, definovaný formuláciou patentových nárokov, nijako neobmedzujú.Do roztoku 2,0 g (1,56 mmolu) H-LeU-GIu/OtBU/-AsnTyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu-triíluóraoetátu (Liebigs Ann. Chem. 1979, 243) v 30 ml dimetylformamidu sa pridá 0,4 m 1 N-etylmorfolínu a 0,53 g acetyl-N-hydroxysukcínimidu. Po štyroch hodinách pri teplote okolia sa reakčná zmes zahustí za vysokého vákua. Zvyšok sa rozpustí V octane etylnatom a získaný roztok sa postupne vytrepe do nasýtenćho vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, vodného roztoku hydrogensíranu draselného a do vody. Pritom vypadne zrazenina, ktorá sa oddelí podtlakovou ñltráciou, pričom sa získa 1,3 g produktu. Etylacetátová fáza sa vysuší nad síranom sodným a zahustí. Zvyšok sa rozotríe s dietyléterom a odsaje. Získa sa 0,8 g produktu. Celkový výťažok 2,1 g (vyšší než 100 ).1,3 g (asi 1,07 mmolu) uvedeným spôsobom získané čisté šarže Ac-Len-Glu/OtBu/-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trtl-Asn-OtBu sa rozpustía v zmesi 30 ml kyseliny tritluóroetovej a 30 ml etylmerkaptánu. Po štyroch hodinách sa reakčná zmes naleje do 300 ml vody a vodný roztok sa trikrát extrahuje dietyléterom. Vodná fáza sa potom vysuší mrazovou sublímáciou (lyoñlizáciou).Do roztoku 25,24 g (55 mmolu) Ddz-Tyr/BuV-OH,15,88 g /50 mmolov/ H-Gln-0 Nb.HCl a 6,75 g i-hydroxybenzotriazolhydrátu v 100 m 1 N,N -dimetylformamidu sa pri teplote -3 °C pridá 6,4 m 1 (50 mmolov) N-etylmorfolínu a 10,5 g dicyklohexylkarbodíimidu. Táto zmes sa mieša počas jednej hodiny pri teplote 0 C a potom ešte počas jednej hodiny pri teplote okolia, načo sa odstaví cez noc pri teplote okolia. Vylúčená zrazenina sa oddell podtlakovou liltráciou a tiltrát sa zahustí. Rezultujúci olej sa rozpustí voctane etylnatom a získaný roztok sa potom postupne premyje vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného,citrátovým pufrom /pH 3/ a vodou, načo sa vysuší nad síranom sodným a zahustí. Olejovitý produkt sa rozotrie spetroléterom na prášok a oddell podtlakovou tiltráciou. Potom sa trikrát povarí vždy so 100 ml diizopropylćteru a dekantuje. Nakoniec sa rozotrie so studeným diizopropylćterom, oddelí podtlakovou filtrácíou a premyje petroléterom.Do roztoku 32,5 g (45 mmolov) produktu 16 v 500 m 1 metanolu sa pridá 5 ml vody a Pd/BaSO 4 a zmes sa hydrogenuje počas 7 hodín. Potom sa katalyzátor odstráni podtlakovou filtráciou a tiltrát sa zahusti. Rezultujúci olej sa potom rozpustí v 250 m 1 octanu etylnatćho. Do získanćho roztoku sa pridá 11,3 m 1 (55 mmolov) dicyklohexylarnínu a zmes sa nechá stáť počas niekoľkých hodín pri teplote 3 °C, načo sa vylúčená zrazenina oddelí podtlakovou filtráciou. Táto zrazenina sa potom rozotrie v treeej miske s octanom etylnatým, oddelí podtlakovou filtráciou a vysuší za vákua Výťažok 27 g (78 ) teplota tavenia 170-17 °C ot 13 10,2 (cl, v metanole). Elementáma analýza C 42 Hs 4 N 409 C () H() N() vypočítaná 65,6 8,39 7,28 nájdené 65,4 8,5 7,3.2,9 g (3,7 mmolu) Ddz-Tyr/Bu/-Gln-OH.dicyklohexylamínu sa rozdelí medzi octan etylnatý a citrátový pufer (pH 3). Etylacetátová fáza sa premyje vodou až do neutrálnej reakcie, vysuší nad síranom sodným a zahustí. Ako zvyšok sa získa amorñíý produkt 17.9,7 g (16,5 mmolu) produktu 17, 19,2 g (15 mmolov) zlúčeniny z príkladu 3 a 2,025 g (15 mmolov) HOBr sa pri izbovej teplote a za miešania rozpustí v 30 ml N,N-dimetylformamidxi Zmes sa potom ochladí na teplom 0 °C, pridá sa k nej 1,95 ml (15 mmolov) N-etylmorfolínu,ako i roztok 3,3 g (16 mmolov) dicyklohexylkarbodiimidu a 9 m 1 NN-dimetylformamidu a zmes sa najprv mieša pri teplote 0 °C počas jednej hodiny a potom ešte štyri hodiny pri izbovej teplote, načo sa cez noc nechá stáť pri izbovej teplote a dicyklohexylmočovina sa odsaje. Po dvojnásobnom premytí vždy 4,5 ml NN-dimetylformamidu sa filtrát prileje do 159 ml nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a zmes sa mieša tak dlho, až sa vylúči prášková zrazenína. Táto zrazenina sa odsaje, rozotrie s citrátovým puñom, znova odsaje, premyje vodou až do neutrálnej reakcie a vysuší pri tlaku asi 13,3 Pa (výťažok 23,1 g). Tento surový produkt sa zahreje na parnom kúpeli až takmer na teplotu varu, riedka suspenzia sa prechováva cez noc pri teplote 3 °C, zrazenina sa odsaje a premyje octanom etylnatým a ćterom.Získaný produkt sa rozkladá pri teplote od 205 °C a zuhoľnatí zhruba pri teplote 250 °C3,5 g (2 mmoly) produktu 18 sa za miešania rozpustí v zmesi 1,75 m 1 kyseliny triíluóroctovej (20 mmolov),0,35 ml vody a 33 ml metyléndichloridu (asi 35 ml 5 roztoku v kyseline trifluóroctovej s l vody) a 3,5 m 1 anizolu. získaný roztok sa potom mieša počas 3 hodín pri izbovej teplote, načo sa do neho pridá pyridin vmnožstve 2 ml (24,8 mmolu) a zmes sa zahustí pri tlaku asi 13,3 Pa. Zvyšok sa rozotrie s éterom, podtlalcovo odíiltruje, premyje eterom, vysuší, premyje vodou a vysuší nad oxidom fosforečným (výťažok 3,35 g). Na účely ďalšieho čistenia sa produkt dvakrát krátko povarí vždy s 20 ml octanu etylnatého, načo sa za tepla podtlakovo odfiltruje. Potom sa produkt ešte premyje éterom. Výťažok 3,0 g (92 ) teplota tavenia 255-265 C (za rozkladu) a -20,2 ° (c l, v metanole).Biologické aktivita peptidov podľa vynálezu všeobecného vzorca (II) bola stanovená pomocou vypreparovaných tukových buniek a výsekov bránice (diafragma) lorýs. Výraz tripeptid sa vzťahuje na Tyr Cys Asn-OH a výraz hexapeptid sa vzťahuje na acetyl-Leu Glu Asn Tyr Cys AsnOH. Výraz bazálny sa vzťahuje na aktivitu bez stimulacíe, výraz inzulín sa vzťahuje na ľudský inzulín a dpm znamená rádioaktívne rozpady za minútu.Preparácia tukových buniek z krýs prebiehala nasledujúcim spôsobom tukové tkanivo nadsemenníkov (krysy Wistar stelesnou hmotnosťou 160 až 180 g a s žiadnym obmedzením v potrave) sa spracuje kolagenázou a získané osamostatnené tukové bunky sa viackrát premyjú ílotáciou. Príprava výsekov krysej diafragmy z viackrát premytej hemidiafragmy (krysy Wistar s telesnou hmotnosťou 60 až 70 g a sžiadnym obmedzením vpotrave) boli vyseknutćObidva nasledujúce testy zahŕňajú inzulínom stimulovateľnć pohltenie glukózy, ktoré vyžaduje inzulínom indukovanú kaskádu prenosu signálov a transport glukózy, a to nezávisle od toho, či je glukóm metabolizovami oxidačne(glykolýza, cez pentózofosfát) alebo neoxidačne. e sledovaná transformácia na lipidy, glykogén alebo membránou nepriestupné vedľajšie produkty (glukózo-ó-fosfát), ale nikdy vznik laktátu.a/ Krysie tukové bunky sa inkubujú v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s D-U-14 Cglukózou(koncová koncentrácia D-glukózy 22 M). Tukové bunky sa potom oddelia odstredenlm cez vrstvu silikónového oleja od ostatného média, izolujů sa a potom sa stanoví rádioaktivita pridružená k týmto bunkám.b/ Výseky klysej diafiagmy sa inkubujú v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s D-u-cjgrukóznn(koncová koncentrácia D-glukózy 75 M). Médium sa odsaje. Výseky tkaniva sa niekoľkokrát premyjú a potom sa solubilizujú spracovaním alkálií s cieľom stanoviť rádioaktivitu pridmženú k tomuto tkanivu.Získané výsledky sú zhmuté v nasledujúcej tabuľke l.

MPK / Značky

MPK: A61K 38/08, C07K 7/06

Značky: farmaceutický, mellitus, ošetrenie, diabetes, prostriedok

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-282361-farmaceuticky-prostriedok-na-osetrenie-diabetes-mellitus.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus</a>

Podobne patenty