Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok na jeho báze

Číslo patentu: 279877

Dátum: 09.03.1994

Autori: Bauer Jacques, Schulthess Adrian, Hirt Pierre

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Extrakt na báze modifikovaných bakteriálnych makromolekúl obsahuje zmes modifikovaných kyslých bakteriálnych polypeptidov s molekulovou hmotnosťou 10 000 až 1 000 000 a izoelektrickým bodom 2,5 až 5,5, v ktorej celková hmotnosť stavebných aminokyselín tvorí aspoň 50 % hmotn. extraktu. Príprava extraktu spočíva v kultivácii baktérií vo vodnom prostredí, potom alkalickej extrakcii suspenzie baktérií a čistení bielkovinového extraktu. Alkalická extrakcia sa vykonáva v prítomnosti zriedeného vodného zdroja iónov OH- a pri stabilnom pH medzi 11 a 13, pričom pokles pH v priebehu extrakcie nie je vyšší ako 0,4. Takto získaný bielkovinový extrakt možno použiť ako účinnú zložku farmaceutického prostriedku.

Text

Pozerať všetko

(19) Číslo prihlášky 1111-93 Dátum podania 03.02.93 (13) Dmh d°km° B Číslo prioritnej prihlášky 450/92-8 (Sl) Im C 16 Dátum priority 14.02.92 C 121 21/00 A 6 1 K 3 5/74 Krajina priority CH ÚRAD Dátum zverejnenia 09.03.94 PRIEMYSELNEHO VLASTNÍCTVA Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 07.05.99 SLOVENSKEJ REPUBLIKY Cislo PCT PCT/CH 93/00029 03.02.93(73) Majiteľ patentu Laboratoires OM S. A., Meyrin, CH(72) Pôvodca vynálezu Bauer Jacques, Saint-Sulpice, CH Hirt Pierre, Préverengcs, CH Schulthess Adrian, Begníns, CH(54) Názov vynálezu Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok na jeho bázeExtmkl na báze modifikovaných bakteriálnych makrornolekúl obsahuje zmes modifikovaných kyslých bakteriálnych polypeptidov s molekulovou hmotnosťou 10 000 až l 000 000 a izoelektrickým bodom 2,5 až 5,5, v ktorej celková hmotnosť stavebných aminokyselín tvon aspoň 50 hmotu. extraktu. Príprava extraktu spočíva v kultivácii baktérií vo vodnom prostredí, potom alkalickej extrakcii suspenzie baktérií a čistení bíelkovinového extraktu. Alkalická extrakcía sa vykonáva V prítomnosti zriedeného vodného zdroja iónov OH a pri stabilnom pH medzi 11 a 13, pričom pokles pH v priebehu extrakcíe nie je vyšší ako 0,4. Takto získaný bielkovinový extrakt možno použiť ako účinnú zložku farmaceutického prostriedku.Vynález sa týka extraktu bakteriálnych makromolekúl,hlavne extraktu na báze rnoditikovaných bakteríálnych makromolekúl, spôsobu jeho prípravy a farmaceutického prostriedku, obsahujúceho tento extrakt ako účinnú zložku.Sú známe bakteriálne produkty s terapeutickou účinnosťou, ktoré sa získavajú alkalickou hydrolýzou. Prihlasovateľov patent CH 633. 88 opisuje napríklad koncentrat bakteriálnych lyzátov s antijntekčnými vlastnosťami. Lyzáty každého bakterialneho kmeňa sa získavajú progresívnou alkalickou hydrolýzou (pH 9 - 10), ktora vedie k dešuukcii viditeľnej štruktúry baktérií.Pôvodcovia tohto vynálezu však zistili, že je možné získavať bakteríálne extrakty s rôznymi imunofannakologickými účinkami, napríklad s významným imunomodulačným účinkom, rôznym alkalickým spracovaním, ktoré umožňuje ponechať viditeľnú štruktúru spracovaných baktérií neporušenú. Toto spracovanie konkrétne spočíva V alkahckej extrakcii za podmienok vyššieho a hlavne stabilného pH.Predmetom Vynálezu je teda jednak extrakt na báze modifikovaných bakteriálnych makromolekúl a jednak spôsob prípravy tohto bielkovinového extraktu.Predmetom vynálezu je ďalej farmaceutický prostliedok, obsahujúci ako účinnú zložku extrakt na báze modifikovaných bakteriahiych rnakromolekúl podľa vynálezu(ďalej označovaný ako bielkovinový extrakt).Chemické spracovanie baktérií, napríklad uíedeným NaOH, spôsobuje hlboké modifikácie primárnych, sekundárnych a tercíarnych štruktúr bakteriálnych makmmolekúl. Je možné tiež pozorovať čiastočnú deamidácíu aspaiaginu a glutamínu, ktorá vedie k vzniku kyseliny asparágovej, resp. kyseliny glutámovej. V priebehu tohto procesu tiež prebiehajú čiastočné racemizácie niekoľkých aminokyselín, hlavne kyseliny asparagovej, serínu a arginínu. V súhrne je dôsledkom týchto fyzikálno-chernických moditilçácií Štruktúry rnakromolekúl vznik polypeptidov, ktorých arntiónové vlastnosti mi kyslé. Všetky tieto polypeptidy majú izoelektrické body V rozmedzí medzi 2,5 a 5,5, s významnejšou koncentráciou okolo 4,5. Tieto štruktúme zmeny tak produkujú bielkovinové extrakty, ktoré majú imunomodulačné vlastnosti in vitm i in vivo.V bielkovinovom extrakte podľa vynálezu predstavuje Súhrnná hmotnosť stavebných aminokyselín aspoň 50( hrnotnostné lyoñlizátu), výhodne 55 až 85 /o uvedeného bielkovinového extraktu a obsah lipopolysacharidov (LPS),je Výhodne nižšia ako asi 2.l 03 . Molekulová hmotnosť stavebných elementov bielkovinového extraktu podľa vynálezu je V rozmedzí medzi 10.000 a l,000.000. Tento bielkovinový extrakt ďalej obsahuje medzi bielkovinovými aminokyselínami, niektorými s kontiguráciou D a L, prevažujúce množstvo kyslých zvyškov, ako je kyselina asparágová a kyselina glutámová. Hlavnými racemizovanými amínokyselinamí sú serín s asi 25 až 45 konfigurácie D, kyselina asparagová s asi 10 až 30 a arginín s asi 3 až 20 . Použitie termínu moditikované Proteíny je okrem iného spojené s prítomnosťou aminokyselín V konfigurácii D v bielkovinovom extrakte, lebo konfigurácia L je pritomná v prírodných proteínoch.Okrem toho môže bielkovinový extrakt podľa vynálezu obsahovať nanajvýš okolo l 03 lipopolysacharidov, nanajvýš asi 2 voľných aminokyselín, nanajvýš asi 8 glycidov, nanajvýš asi 4 amínocukrov a nanajvýš asi 15 dezoxyribonukleových kyselín.Principiálne je možné ako východiskový produkt podľa vynalezu použiť akýkoľvek grampozitívny alebo gramnegatívny bakteriálny kmeň, ako sú Escherichía colí alebo jeden alebo niekoľko bakteriálnych kmeňov, opisaných V citovanom patente CH 633.188. Napríklad ďalej opísaný postup používa kmeň Escheiichia coli, konkretne kmeň l-l 147, uložený podľa budapeštianskej zmluvy 3.10.1991 V Národnej zbierke mikroorganizmov, Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 - FRANCE.Primárne inokulum sa pripraví zo zmrazených baktérií,ktoré sa oživia striedavou kultivaciou V kvapahiom prostredí, napriklad Tryptic Soya Broth a na pevnej pôde. Objem kultúry iriokula sa progresívne zvyšuje do l l vo zvyčajnom kvapalnom kultivačnom prostredí a inkubuje sa za trepania pri 37 °C.Takto pripravené sekundárne inokulum sa uvedie do fermentora s objemom 20 l, obsahujúceho 5 l vhodného bežného živného média. Hodnota pH sa nastaví a udržiava na 7,0, napríklad 5 amoniakom a teplota sa reguluje na 37 °C. Kultivácia baktérií sa vykonáva za prevzdušňovania(vzduch) a miešania, za kontrolovaných podmienok Vedúcich k získaniu pOg vyššieho ako 90 nasýtenia. Vykoná sa meranie optickej hustoty pri 700 nm Na konci kultivácie sa baktérie ínaktivujú teplom autoklávovaním (30 min. pri 120 °C) alebo okamíhovou pasterizáciou (90 s pri 105 °C) a odoberie sa vzorka na overenie absencie životaschopných zárodkov.Bakteriálna suspenzia sa zahusti a nespotrebovaué zvyšky kultivačného prostredia sa odstránia odstredením alebo výhodne tangenciálnou ultrafiltrácíou, napríklad ultrafltračným systémom FILTRON na polysulfónových patrónach. Táto ultrafiltrácia sa vykonáva V dvoch stupňoch najprv sa vykoná 5 až lO-násobná koncentrácia(membrány 30 kD až 0,3 .rn) a potom premývanie diaíiltráciou fyziologickým roztokom (3 až 15 premývacích objernov).Stanoví sa sušina bakterialnej suspenzie, čo umožňuje adjustovať biomasu prípravku pred alkalickou extrakciou. Konečná suspenzia baktérií sa zriedi fyziologíckým roztokom a konečná sušina baktérií sa upraví na 2 až 20 g/l.B. Alkalická extrakcia Na vlastnú alkalickú extrakciu sa koncentrácia NaOH V bakteriáhiej suspenzii upraví na 0,0 l až l , tu na 0,1 . Extrakcia sa vykonáva za miešania medzi 30 a 45 °C,tu pri asi 37 °C. Piiebežne sa odoberajú vzorky na analytické účely. Analýza zahmuje meranie pH, stanovenie makromolekúl a lipopolysacharidov. Baktćiie použite na získa SK 279877 B 6nie lótov I a II, boli zahustené a premyté (stupeň A) na patróne 30 kD a v prípade lótu III na patróne 1000 kD. V týchto príkladoch bol čas trvania procesu alkalickej extrakcie mieme kratší ako dva dni, Výsledky vzťahujúce sa k trom lótom (I, II a III), získaným z uvedeného kmeňa Escherichia coli, sú zhmute V tabuľke l , Tabuľka l Monitorovanie alkalickej extrakciestanovenie makromolekúl Bradfordovou metódou referencie hovädzí sérovým alburnín (BSA)stanovenie LPS metódou LALreferencie LPS Escherichia coli 01 1 1 B 4Toto monitorovanie ďalej umožňuje odbomíkovi stanoviť približný čas procesu alkalickej extrakcie v závislosti od zamýšľaneho použitia vzhľadom na typ použitých baktérií a podmienky pH a teploty. Tento čas sa všeobecne pohybuje medzi niekoľkými hodinami a asi jedným týždňom.Čo sa týka pH, je treba pripomenúť, že jedna z charakteristík vynálezu spočíva v stabilnom pH, ktoré sa udržiava medzi 11 a 13, napriklad medzi 12,0 a 12,5, s poklesom V priebehu extrakčného procesu nanajvýš 0,4. V tomto príklade bolo pH 12,3 až 12,4 s maximáhiou výchylkou v priebehu extrakcie 0,1.Ďalšia význanuiá výhoda spôsobu podľa vynálezu je zrejmá z výsledkov, uvedených v tabuľke l. Je možné konštatovať, že obsah lípopolysacharidov v získanom bielkovinovom extrakte je značne redukovaný.Na konci extrakcie a pred čistením bielkovinového extraktu sa vykoná mikroskopická kontrola baktérií po sfarbení gram na overenie, že viditeľné štruktúry baktérií sú neporušene.Bielkovinový extrakt, získaný postupom podľa stupňa B, sa frakcionuje ultrañluáciotr konkrétne sa vykoná 5 až IO-násobná koncentrácia ultraľltrácíou (1000 kD) a účinná zložka sa extrahuje diañltráciou, napríklad s vodou. Nakoniec sa bielkovinový extrakt zahustí ultrafrltráciou (10 kD).Na účely eliminácie väčšej časti endotoxínov, konkrétne LPS, sa bielkovinový extrakt podrobí procesu fázového prenosu s neiónogénnyrn detergentom Tento proces je možné napriklad vykonať v pritonmosti 7 Tritonu X-l 14 zahrievanim za miešania počas asi 20 min. na asi 60 °C. Po oddelení fáz sa spodná fáza (Triton LPS) odstráni. Homá vodná fáza, obsahujúca bíelkovínový extrakt,sa zhromaždí a pH sa upraví na 7.Táto vodná fáza sa podrobí iónovýmennej chromatografu kvôli ďalšiemu zníženiu obsahu LPS a odstráneniu neiónogénneho detergentu. Na túto chromatografiu je možné použiť napriklad gél DEAE-Sepharose. Konkrétne sa vodná fáza, obsahujúca bielkovinový extrakt, najprv adsorbuje na menič iónov, potom sa odstránia molekuly, ktoré neboli zachytené a premytírn pri nízkom pH sa odstránia nečistoty. Po ekvilibrácii gélu pri neutrálnorn pH sa bielkovinový extrakt eluuje zvyšovaním iónovej sily a potom saeluát zahustí ultrañltráciou a premyje díafiltráciou s vodou. Takto vyčistený bielkovinový extrakt sa sterilne preñltruje a prípadne lyoñlizuje zvyčajným známym spôsobom. Lyoñlizát bol podrobený biochemickýrn analýzam a imunofannakologickým testom. Stanovenie aminokyselín,racemizovaných V priebehu alkalickej extrakcie, sa vykonalo podľa Nimuru N. a Kinoshitu T., J. Chromatography,352, 169 - 177, 1986. Rôzne racemizácie, detekovzmé V bielkovinových extraktoch (loty I, II a Ill) sú ako príklady uvedené V tabuľke 2 a vyjadrené v konfigurácii D.neni avand Iunnkynl inyAnalytické výsledky sú uvedene v tabuľke 3.frakcie vlnnnć na ukzvonalnkuly nutná kyselinyq ru Pukuäum-uounmuuuq www ąwmo uuuàhäbääb L4 ua uäum-.uu. o mmm mamu uuoolhhökkhb . 0 OuHfguuuuuuuu~un 4 uuu.muouuoL wJezentárna analýza. pepol uhlík Janík dual)Bolo jasne demonštrované, hlavne testami ín vitro a in vivo na pokusných zvieratách, že bielkovinový extrakt podľa vynálezu má imunomodulačne vlastnosti a protinádorovú účinnost.1. Imunologické testy in vitrolmunologicke testy in vitro boli vykonávané na makrofágoch, derivovaných z kostnej drene a na lyrnfocytoch zo sleziny, Peyerových plátov alebo mezenterických ganglií,odobraných myšiam C 57 BL/6.Makrofágove modely Bielkovinový extrakt stimuluje makrofágy v ich schopností aküvovať oxidačný metabolizmus glukózy V dráhe pentózofosfátov a aktivuje produkciu metabolitov dusíka (nitritový test). Sekrécia TNF, rovnako ako produkcia prostaglandínov (PGEz) pri makrofágoch je stirnulovaná bielkovinovým extraktomNítritový test, uvedený ako príklad, bol vykonaný podľa M. A. Marlettu Biochemistry, 27, 8706-8711, 1988. Malcrotägy odvodené od kostnej drene sa kultívujú na mikroplatríiach (70.000 makrofágov na jamku) V prítomnosti rôznych koncentrácii bielkovinového extraktu (0,1 až 50 g extraktu/rnl) alebo lipopolysacharidov E. coli ako pozitívnej kontroly (0,0004 až 0,2 g LPS/ml). Produkcia N 02 v supematantoch makrofágových kultúr sa stanovi pomocou Griessovho činidla podľa J. Mauela et al., Int. J. Immunophannac., 11, 637-645, 1989.Výsledky pri rôznych koncentráciách testovaných produktov sú uvedené V tabuľke 4 v nmol NOy/ml bunkovćho supematantu V Závislosti od koncentrácie extraktu alebo LPS. Bielkovinový extrakt vyvoláva silnú produkciu N 021Lymfocytáme modely Lymfocyty, pochádzajúce zo sleziny, Peyerových platov alebo mezenterických ganglií,sa kultivujú na mikmplatniach (5105 buniek na jamku) za štandardizovaných kultivačných podmienok v prítomnosti rôznych koncentrácii bielkovinového extraktu (l až 100 g eXtraktIL/tnl) alebo lipopolysacharidov E. coli ako pozitívnej kontroly (l až 100 LPS ng/ml). Proliferácia buniek, vyvolaná produktmi, je stanovovaná mierou inkorporácie tritiovaného tymidínu do DNA buniek podľa J . Louise et al.,Eur. J. Imrnunol., 9, 841-847, 1979. Amplitúda stimulácie lymfocytov bíelkovinovým extraktom je za rovnakej koncentrácie pn všetkých troch zdrojoch lymfocytov porovnateľná s pozitívnou kontrolou. Bielkovinovy extrakt sa aktívuje od 1 g extraktu/ml a má maximum aktivity medzi 30 a 100 g extraktu/ml.2. Imunologický test in vivoProtinádorová účinnosť bielkovinového extraktu bola preukázaná in vivo na modele vyvolaného peritoneálneho karcinómu pri myšiach BD IX.Použite bunky Bunky Pro b boli klonované z kultúry buniek Kl 2, izolovaných z nádoru DI-lD, vyvolaneho dimetylhydrazinom pri polorodej myši BD IX, podľa F. Martina et al., Int. J. Cancer, 32, 623-627, 1983.Indukcia peritoneálnych karcinómov Bunky Pro b,vstreknuté intraperitoneálnou cestou syngénnym myšiam(105 buniek/myš), vyvolávajú po asi desiatich dňoch početné pevne noduly, ktoré sa objavujú V epiploome alebo mezentériu na úrovni mliečnych škvfn (mílky spots) a p 0 tom progresívne prenikajú do peritoneálnej dutiny, podľa P. Lagadaca et al., Invasion and Metastasis, 7, 83 - 95, 1987. Po ďalších 4 až 5 týždňoch sa objavuje krvácavá vodnateľnosť a všetky myši urnierzýú po 8 až 12 týždňoch.Indukcia pulmonálnych metastáz Vstreknutie 7,106 buniek Pro b do femorálnej žily vyvoláva pulmonálne metastázy, ktore napádajú laloky a všetky myši tuníerajú po 6 až 10 týždňoch.Liečba peritoneálnych a pulmonálnych karcínómov Imunoterapia sa začína 14 dm po injekcii nádorových buniek, keď sú karcinómy makroskopickć. Liečba spočíva vintraperitoneálnych injekciách bielkovinového extraktu v množstve 10 mg na kg telesnej hmotnosti. Myši dostávajú celkovo 5 injekcii V odstupe 3 až dni. Každý pokus zahrnuje kontrolnú a ošetrovanú skupinu s 10 (alebo 12) myšami, ktoré sú očíslovaně.Výsledky Myši sa usmnia 6 týždňov po vstreknuti buniek a vykoná sa autopsia. Objem perítoneálnych karcinómov sa zhodnotí naslepo a myši sa zoradia podľa vzrastajúcej veľkosti karcinómov. Zostaví sa stupnica karcinorríatózy podľa počtu a veľkosti pozorovaných nodulov. Objem hemoragických ascitov sa meria dvojitým vážením. Klasitikácía puhnonálnych metastáz sa vykoná po mikroskopíckom pozorovaní pľúc a myši sa rozdelia do dvoch skupín s metastázami a bez nich.Získané výsledky ukazujú, že vo ôsmich pokusoch na 82 ošetrených myšiach nemalo 41 myší pri autopsii žiaden nodulus (40 až 60 myší na pokus) pri ostatných myšiach bol rast nodulov významne inhibovaný. Okrem toho 78 z 82 myší nemalo ascites. Všetky neošetrené myši malí nádory a hemoragické ascity. Tieto Výsledky potvrdzuje tiež test prežitia z 10 myší ošetrených bielkovinovým extraktom prežili 3 myši do 10., 18. a 27. mesiaca po injekcii rakovinových buniek a pri autopsii nemali nádor. Všetky myši z kontrolnej skupiny zomreli na nádor 3 mesiace po inj ekcü buniek.Výsledky, získané V priebehu dvoch pokusov s rastom pulmonálnych metastáz ďalej umožnili preukázať, že bielkovinový extrakt má systemický účinok. Z 20 myší, liečených intraperitoneálríou injekciou totiž 13 myší má úplnú inliibícíu rastu pulmonálnych metastáz. Protinádorový účinok bíelkovinového extraktu sa dosahuje pri metastázach,vyvolaných rakovinovými bunkami časti hrubého čreva a tiež disociovanými nádorrni. V priebehu liečby neboli pozorované známky toxicity.Bielkovinový extrakt má slabú toxicitu. Jednotkové dávky, dosahujúce 300 mg na kg, aplikované intraperitoneálne, sú myšarni dobre tolerované.Aplikácia bielkovinového extraktu sa vykonáva injekčne, výhodne íntrapexitoneálne, vo forme lyotilizátu, rozpusteného napríklad vo fyziologickom roztoku. Rovnako je možné použiť ďalšie galenické tbrrny, napríklad aplikované orálnou, rektálnou alebo topíckou cestou.l. Extrakt na báze bakteriálnych makromolekúl, v y z n a č uj ú c i s a tý m ,žeobsahujezmesmodiñkovauých kyslých bakteriálnych polypeptidov s molekulovou hmotnosťou 10 000 až l 000 000 a s izoelektrickým bodom v rozmedzí 2,5 až 5,5, v ktorom celková hmotnosť stavebných aminokyselín predstavuje aspoň 50 hmotnosti extraktu, kde obsah lipopolysacharidov je nižší ako 2.103 hmotn., obsah voľných aminokyselín je do 4 hmotn. a kyseliny dezoxyribonukleovej je do 15 hmotn2. Extrakt bakterialríych makromolekúl podľa nároku l,vyznačujúci sa tým,žeuvedenácelková hmotnosť stavebných aminokyselín je 55 až 85

MPK / Značky

MPK: A61K 35/74, C12P 21/00

Značky: spôsob, makromolekúl, báze, prostriedok, přípravy, extrakt, bakteriálnych, farmaceutický

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-279877-extrakt-bakterialnych-makromolekul-sposob-jeho-pripravy-a-farmaceuticky-prostriedok-na-jeho-baze.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok na jeho báze</a>

Podobne patenty